Лекции по лабораторной диагностике вирусов

Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций подразделяются на несколько больших групп.

- Прямые методы, состоящие в выявлении непосредственно в биологическом материале самого вируса или антител к нему.

- Непрямые методы-заключаются в искусственной наработке вируса в значительных количествах, и его дальнейшем анализе.

К наиболее актуальным в повседневной практике методам диагностики относятся:

Серологические методы диагностики - выявление в сыворотке крови пациента определенных антител или антигенов в результате реакции антиген-антитело(АГ-АТ). То есть, при поиске у пациента определенного антигена используется соответствующее искусственно синтезированное антитело, и, соответственно, наоборот-при выявлении антител используют синтезированные антигены.

Реакция иммунофлуоресценции (РИФ)

Основана на использовании меченых красителями антител. При наличии вирусного антигена он связывается с мечеными антителами, и под микроскопом наблюдается специфическая окраска, которая говорит о положительном результате. При этом методе, к сожалению, невозможна количественная интерпретация результата, а только лишь качественная.

Возможность количественного определения дает иммуноферментный анализ(ИФА). Он похож на РИФ, однако в качестве маркеров используют не красители, а ферменты, превращающие бесцветные субстраты в окрашенные продукты, что и дает возможность количественной оценки содержания как антигенов, так и антител.

- Отмывают не связавшиеся антитела и антигены.

- Добавляют бесцветный субстрат, и в лунках с антигеном, который мы определяем, произойдет окрашивание, т.к. там будет связанный с антигеном фермент, после чего на специальном приборе оценивают интенсивность свечения окрашенного продукта.

По похожей схеме происходит и выявление антител.

Реакция непрямой(пассивной) гемаглютинации (РПГА).

Метод основан на способности вирусов связывать эритроциты. В норме эритроциты падают на дно планшета, образуя так называемую пуговку. Однако если в исследуемом биологическом материале находится вирус, он свяжет эритроциты в так называемый зонтик, который не упадет на дно лунки.

Теперь остановимся на методах диагностики непосредственно нуклеиновых кислот исследуемых вирусов, и прежде всего о ПЦР ( Полимеразная Цепная Реакция) .

Суть этого метода заключается в обнаружении специфического фрагмента ДНК или РНК вируса путём его многократного копирования в искусственных условиях. ПЦР можно проводить только с ДНК, то есть для РНК-вирусов предварительно необходимо произвести реакцию обратной транскрипции.

Непосредственно ПЦР проводят в специальном приборе, под названием амплификатор, или термоциклер, который поддерживает необходимый температурный режим. ПЦР-смесь состоит из добавленной ДНК, которая содержит интересующий нас фрагмент, праймеров (короткий фрагмент нуклеиновой кислоты, комплиментарный ДНК-мишени, служит затравкой для синтеза комплиментарной цепи), ДНК-полимеразы и нуклеотидов.

Стадии цикла ПЦР:

- Деннатурация-первая стадия. Температура повышается до 95 градусов, цепочки ДНК расходятся друг относительно друга.

- Отжиг праймеров. Температуру понижают до 50-60 градусов. Праймеры находят комплиментарный участок цепи и связываются с ним.

- Синтез. Температуру вновь повышают до 72, это рабочая температура для ДНК-полимеразы, которая, отталкиваясь от праймеров, строит дочерние цепи.

Цикл многократно повторяется. Через 40 циклов из одной молекулы ДНК получается 10*12 степени копий копий искомого фрагмента.

При проведении ПЦР в режиме реального времени синтезируемые копии фрагмента ДНК метятся красителем. Прибор регистрирует интенсивность свечения и по ходу реакции строит графики накопления искомого фрагмента.

Современные методы лабораторной диагностики с высокой достоверностью позволяют выявить присутствие вируса - возбудителя в организме, нередко, задолго до появления первых симптомов заболевания.

Инфекционные болезни — это заболевания, вызванные проникновением в организм бактерий, грибков или вирусов. Самая важная часть диагностики инфекций — это определение возбудителя и его концентрации. Для этих целей используются разнообразные лабораторные методы, которые позволяют выяснить, чем именно и как давно атакован организм, а в некоторых случаях — спрогнозировать эффективность лечения тем или иным препаратом.

Особенности диагностики инфекционных заболеваний

В клинической практике данный тип заболеваний встречается очень часто. Именно они, по данным Всемирной организации здравоохранения, становятся причиной 26% всех смертей. В список самых распространенных инфекционных заболеваний входят инфекционная пневмония и другие воспалительные заболевания дыхательных путей, гепатит, ВИЧ, туберкулез, малярия, воспаления органов половой системы и мочевыводящих путей, гистоплазмоз, ротавирусные инфекционные заболевания, ветряная оспа, герпес, вирус папилломы человека и еще несколько десятков болезней. Хотя бы раз в жизни каждый из нас сталкивается с инфекционными заболеваниями и необходимостью быстрой постановки диагноза.

Все инфекционные болезни делятся на пять типов — прионные, вирусные, бактериальные, протозойные и грибковые поражения. Далее будут рассмотрены последние четыре типа как наиболее распространенные. Разные возбудители иногда могут вызывать одно и то же заболевание. В частности, пневмония может быть результатом как вирусной, так и бактериальной инфекции. Лечение зависит не от проявлений, а от возбудителя болезни. Противовирусные препараты бесполезны в борьбе с бактериями и грибками, антибиотики не действуют на вирусы. Поэтому основная задача лабораторной диагностики инфекционных заболеваний — выявление типа возбудителя.

Способы лабораторной диагностики инфекционных болезней можно разделить на два типа: неспецифические и специфические методы.

К неспецифическим относятся общий анализ крови и исследование соотношения ее белковых фракций, печеночные пробы, общий анализ мочи и кала. Эти методы не дают информации о виде возбудителя, но позволяют узнать, в какой мере болезнь затронула органы и системы организма, что именно в их работе нарушено и насколько далеко зашел процесс.

Специфические — вирусологический и бактериологический методы, микроскопическое исследование возбудителей, анализы на антигены и антитела — направлены непосредственно на обнаружение возбудителя.

Современная медицина располагает множеством методов выделения возбудителей бактериальной инфекции:

Бактериоскопический . Исследуется окрашенный специальным образом мазок.

Бактериологический . Биоматериал высеивается в питательную среду, и через некоторое время специалист исследует колонию бактерий, выросшую в ней.

Биологический . Направлен на определение патогенности микроорганизмов.

Серологический . Выявляет антитела и антигены в сыворотке крови — особые вещества, которые вырабатываются организмом при контакте с возбудителем определенной болезни.

Чаще всего для исследований используют кровь или сыворотку крови, реже — слюну, мочу, кал, клетки эпителия (мазок и соскоб) и другой биоматериал.

В лабораторной диагностике вирусных заболеваний используются:

Вирусологическое исследование . Световая и электронная микроскопия дает возможность выявить наличие вирусных включений и сами вирусы и идентифицировать их.

Серологическое исследование для обнаружения антител и антигенов. Этот метод дает возможность быстро выявить агрессора, как и в случае с бактериальными инфекциями. Для диагностики используются разнообразные способы исследования материала — реакции гемадсорбции, гемагглютинации или метод непрямой иммунофлюоресценции. Имунноблоттинг, в частности, позволяет выявлять антитела сразу к нескольким инфекциям и считается современным и точным диагностическим методом.

Молекулярно-генетические методы . Последнее слово в лабораторной диагностике. Позволяют обнаружить вирус даже тогда, когда его концентрация ничтожно мала — то есть на самых ранних стадиях. Самым известным из этих методов является ПЦР, при которой фрагмент вируса многократно копируется до тех пор, пока специалист не получит достаточно материала для определения типа вируса и его изначальной концентрации.

Для выявления вирусов обычно требуется сделать анализ крови.

Так называют инфекции, вызванные простейшими паразитами, например, амебами. Малярия, амёбиаз, токсоплазмоз, лямблиоз, трихомониаз, сонная болезнь — вот неполный список самых распространенных протозойных инфекций. Лабораторная диагностика таких заболеваний включает в себя следующие методы:

Микроскопический . Простейшие паразиты выявляются путем исследования под микроскопом окрашенных образцов биоматериала. Самый простой и надежный метод для многих возбудителей.

Культуральный . Посев биоматериала в питательную следу для дальнейшего исследования размножившихся простейших. У этого метода есть существенный недостаток: результатов нужно ждать долго, сам процесс может занять не менее 5-6-ти дней.

Серологический . Используют редко ввиду малой информативности.

Аллергический . Также не является распространенным. Кожные аллергопробы делают для того, чтобы подтвердить лейшманиоз и токсоплазмоз. Это вспомогательный диагностический метод.

В качестве биоматериала для исследований в основном используется кровь, иногда — – кал или моча.

Микроскопическое исследование . Препарат окрашивается и рассматривается под мощным микроскопом. Посредством иммунофлюоресцентной микроскопии исследуется проба, помеченная флюоресцеинами — специальным красителем. Наиболее быстрый способ выявления грибка по сравнению с другими методами.

Культуральный . Происходит посев пробы на питательную среду и дальнейшее исследование полученной в результате колонии грибков.

Серологический . Используется для выявления грибковых поражений, однако для микозов он считается не особенно точным.

Гибридизация нуклеиновых кислот . Самый современный способ выявления грибковых инфекций, его применяют для идентификации основных возбудителей системных микозов. Из культуры извлекается РНК и вносится особым способом помеченная молекула ДНК. Если в пробе наличествует один из основных патогенных грибков, ДНК объединится с его РНК, создав легко различимую структуру. Несомненным преимуществом метода является возможность определить инфекцию на самых ранних стадиях.

Биоматериалом для исследований являются клетки кожи, волос и ногтей, клетки слизистых оболочек (мазок или соскоб), мокрота, моча, секрет простаты, сперма, грудное молоко.

Современные методики диагностики инфекций позволяет выявить их на начальном этапе, Чем раньше болезнь будет обнаружена, тем проще ее вылечить. Поэтому сдавать анализы на инфекции желательно регулярно, даже если вы ни на что не жалуетесь и не замечаете никаких перемен в самочувствии.

Пе­ред сда­чей био­ма­те­ри­а­ла для ис­сле­до­ва­ний иног­да тре­бу­ет­ся опре­де­лен­ная под­го­тов­ка. Так, кровь обыч­но сда­ют с ут­ра, на­то­щак, а пе­ред за­бо­ром маз­ка не ре­ко­мен­ду­ет­ся при­ни­мать душ. Эти тре­бо­ва­ния очень важ­ны: они обес­пе­чи­ва­ют точ­ность ре­зуль­та­та, по­это­му узнай­те у вра­ча за­ра­нее о под­го­то­ви­тель­ных ме­рах и точ­но сле­дуй­те всем его ре­ко­мен­да­ци­ям.

Общие свойства вирусов.

Вирусы – микроскопические неклеточные формы жизни, обладающие свойством генетического паразитизма, содержащие один тип нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) и размножающиеся путем дезинтеграции. Вирусы существуют в двух качественно разных формах: внеклеточной – вирион и внутриклеточной – вирус. Вирусы человека и животных, в основном, сферической формы, могут быть правильной многогранной формы. Вирусы растений, как правило, палочковидной формы, а вирусы бактерий (бактриофаги) чаще всего имеют форму сперматозоидов. Размеры вирусов колеб­лются от 20 до 300 нм.

В зависимости от размеров вирусы делятся на:

1. Мелкие – от 20 до 60-70 нм (пикорнавирусы, арбовирусы, реовирусы)

2. Средние – 80-150 нм (миксовирусы)

3. Крупные – 150 нм и более (герпесвирусы, оспенные вирусы).

Определенные связи с размером имеет структура и химический состав вируса. Наиболее просто устроены мелкие вирусы, наиболее сложно – крупные. Мелкие вирусы состоят только из нуклеиновой кислоты и белка – это нуклеопротеиды и нуклеокапсиды. Капсид состоит из белковых субъединиц – капсомеров, уложенных компактно, правильными образованиями на поверхности нуклеотида в виде спирали (миксовирусы) или по кубическому типу симметрии (энтеро-, адено-, герпесвирусы). Каждый вирус имеет определенное число капсомеров (адено – 252, полио – 60, герпес – 162 и т.д.). У средних и крупных вирусов, кроме нуклеокапсида, есть внешняя оболочка, содержащая белки, жиры, углеводы, - супрекапсид. Вся эта структура – вирион. В состав вириона входят неорганические ионы.

Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций.

I. Экспресс-диагностика – обнаружение вируса или его антигенов в исследуемом материале:

1. Обнаружение внутриклеточных включений (бешенство, герпетическая инфекция, натуральная и ветряная оспа) и элементарных телец (натуральная оспа) с помощью специальных методов окраски и обычной световой микроскопии.

2. РИФ, ИФА, РИА, ЭМ, ИЭМ.

3. Обнаружение нуклеиновой кислоты вируса метод ПЦР.

II. Вирусологический метод – выделение вируса из исследуемого материала и его идентификация:

1-ый этап – накопление вирусов:

а) в культурах клеток и тканей

б) в куриных или утиных эмбрионах

в) организме чувствительного лабораторного животного

2-ой этап – обнаружение (индикация) вирусов:

а) в культуре клеток: по обнаружению цитоплазматических и внутриядерных включений, по ЦПД вируса, по цветной пробе Солка, по РГА и РГАдс.

б) в курином эмбрионе: по образованию бляшек на поверхности ХАО, по помутнению амниотической жидкости, по РГА.

в) в организме лабораторного животного: по клиническим и патологоанатомическим изменениям тканей и органов.

3-ий этап – идентификация вирусов:

б) РН с учетом по: цветной пробе Солка, РТГАдс, нейтрализации ЦПД или инфекционной активности вируса.

III. Серологический метод (серодиагностика) – обнаружение антител к антигенам вирусов в сыворотке крови пациента:

1. РТГА, РСК, ИФА, непрямая РИФ, РИА.

2. РН с живыми лабораторными штаммами вируса.

Пояснения по методам лабораторной диагностики вирусных инфекций.

I. Экспресс-диагностика – обнаружение вируса или его антигенов в исследуемом материале:

1. Обнаружение внутриклеточных включений (бешенство, герпетическая инфекция, натуральная и ветряная оспа) и элементарных телец (натуральная оспа) с помощью специальных методов окраски и обычной световой микроскопии.

a) Элементарные тельца – это отдельные крупные вирионы, имеющие размеры до 200 нм и видимые при особых методах окраски (по Мо­розову, Романовскому-Гимзе) в световой микроскоп: элементарные тельца Пашена при натуральной оспе в содержимом везикул и пустул.

б) В клетках, пораженных некоторыми вирусами, можно наблюдать образование вирусных включений, локализующихся в цитоплазме (тельца Бабеша-Негри при бешенстве, тельца Гварниери при натуральной оспе), или в ядре (при инфекции, вызванной аденовирусами, герпесвирусами). Природа не всех вирус­ных внутриклеточных включений ясна. Тельца Бабеша-Негри при бешенстве, по данным японских ученых, являются местом продукции вирионов, т.е. колониями элементарных частиц. При герпесе включения на ранней стадии формирования представляют собой скопления вирионов. Включения окрашиваются по Романовскому-Гимзе, Туревичу, Муромцеву (при бешенстве).

2. РИФ, ИФА, РИА, ЭМ, ИЭМ.

а) ЭМ (электронная микроскопия) – позволяет обнаружить возбуди­теля в клиническом материале при негативном контрастировании. Этот метод требует достаточно высокой концентрации возбудите­ля в материале (10 4 -10 5 частиц/мл).

б) Обнаружение антигенов вирусов:

- РИФ (с использованием диагностических люминесцирующих сывороток)

- ИФА (иммуноферментный анализ) – это высокочувствительный, быст­рый метод, технически простой и доступный. Применяется для быст­рой диагностики гепатитов, респираторных инфекций, гастро­энтеритов (ротавирусных инфекций). Чаще всего для обнаружения антигенов вирусов используется сэндвич-вариант постановки ИФА. Для его постановки используют плоскодонный полистирольный иммунологический планшет, на дне лунок которого фиксированны антитела к антигенам вируса (первые антитела). В лунки вносят образец исследуемого материала, инкубируют при определенной температуре, затем промывают лунки специальными буферными растворами. После отмывки вносят вторые антитела, конъюгированные с ферментом (чаще всего – пероксидаза хрена), инкубируют. По окончании инкубации лунки снова тщательно промывают и заполняют субстрат-индикаторной смесью – перекись водорода и тетраметилбензидин (ТМБ) или ортофенилендиамин (ОФД) – и инкубируют при комнатной температуре в темном месте, после чего реакцию необходимо остановить добавлением стоп-реагента (раствор серной или соляной кислоты). Индикатор (хромоген) в присутствии активных радикалов кислорода, образующихся в процессе ферментации перекиси водорода пероксидазой, изменяет свой цвет с бесцветного на синий (ТМБ) или желто-коричневый (ОФД). После остановки реакции при использовании ТМБ цвет раствора изменяется на желтый, а при использовании ОФД становится темнее. Учет реакции ведется в фотоколориметре с вертикальным направлением освещения при длине волны 450 нм для ТМБ и 492 нм для ОФД против контрольных положительной и отрицательной проб.

- РИА (радиоиммунный анализ), разновидность твердофазного иммунологического анализа, когда один из известных компонентов имеет радиоактивную метку. Результаты учитываются с помощью счетчика или авторадиографии, используя рентгеновскую пленку. Для выявления АГ исследуемый материал смешивают со специфической сывороткой, а затем через определенное время вносят гомологичный АГ, меченый радиоактивным изотопом. При этом между анигеном исследуемого материала и меченным антигеном возникает конкуренция за связывание со специфической сывороткой. Если меченый АГ остается свободным, реакция считается положительной, поскольку исследуемый АГ связался с диагностической сывороткой. Такой вариант иммуноанализа называется конкурентным.

- ИЭМ (иммунная электронная микроскопия) – отличается от обычной ЭМ предварительной обработкой исследуемого материала специфическими антителами, мечеными атомом металла. Подобная обработка приводит к тому, что при просмотре электронограммы интересуемые объекты (вирусные частицы) проявляются более четко благодаря большей электронопоглощающей способности металла. Это позволяет выявить возбудителя и одновременно его идентифицировать.

3. Обнаружение нуклеиновой кислоты вируса метод ПЦР.

II. Вирусологический метод – выделение вируса из исследуемого материала и его идентификация:

1-ый этап – накопление вирусов:

- накопление в культуре клеток и тканей

Культуры тканей стали активно использоваться с 50-х годов, ког­да в практику вошли антибиотики (прекратились бактериальные проросты ткани), были разработаны синтетические питательные среды, а главным стимулом послужило выявление ЦПД у вирусов. С 1954 года стали использовать метод однослойных культур тка­ней. Существует 3 типа тканевых культур:

Первично-трипсинизированные культуры получают из различных тканей: кожно-мышечной ткани эмбрионов человека, куриных, мышиных, из почек различных эмбрионов, из легких, из роговицы глаза кролика и т. д. Ткань измельчают, обрабатывают трипсином, освобождают от детрита, стандартизуют число клеток, взвешенных в питательной среде с антибиотиками, разливают в пробирки или флаконы. Полуперевиваемые культуры – это культуры из диплоидных клеток, способные вне организма выдерживать 40-50 пассажей благодаря двойному набору хромосом, после чего отмирают. Перевиваемые культуры существуют вне организма очень долго. Они получены из нормальных тканей, из злокачественных, эмбриональных. Перевиваемые линии культур тканей: Нер-2 (злокачественные клетки из опухоли гортани человека), НеLа (злока­чественные клетки из раковой опухоли шейки матки), Детройт-6 (зло­качественные клетки из опухоли мозга), A-1 (клетки амниона человека), МК-2 – из почек обезьяны – всего около 400 видов. Для культур клеток необходимы питательные среды. Наиболее универсальная – 199 среда, содержащая 66 компонентов. Игл установил 28 крайне необходимых компонентов: глютамин, 12 незаменимых аминокислот, 8 витаминов комплекса В, 6 неорганических ионов, углевод, сыворотка. Основу всех сред составляют солевые растворы: Эрла, Хенкса. рН среды должна быть строго определена и постоянна – 7,0-7,4.

- культивирование вирусов в куриных, реже утиных, эмбрионах

Эмбрионы для выделения вирусов применяют с 1930 года. Преимущества: это закрытая полость, свободная от микрофлоры и вирусов. У эмбрионов не образуются антитела, как в ор­ганизме лабораторных животных, они доступны и дешевы. Используются эмбрионы разного возраста (от 5-7-дневного до 11-13-дневных) и разные методы заражения: в амнион, на хорион-аллантоисную оболочку – ХАО, в хорион-аллантоисную полость, в желточный мешок.

- накопление вируса в организме чувствительных лабораторных животных

В основном используются белые мыши разного возраста, обезьяны (для вируса кори). При накоплении вирусов в организме животных можно оценить этапы развития клинической картины заболевания, патоморфологические и патогистологические изменения в органах и тканях.

2-ой этап – обнаружение (индикация) вирусов:

а) В культуре ткани:

¨ Обнаружение внутриклеточных включений, элементарных телец (см. Экспресс-диагностику)

¨ Обнаружение ЦПД разных вирусов в культуре ткани:

При размножении вируса в культуре ткани происходят различные измене­ния, которые в конечном итоге приводят к гибели клетки. Сморщивание клеток, пикноз ядер, скручивание их, образование небольших очагов этих изменений наблюдается при энтеровирусной инфекции, полиовирусы тоже дают очень быстро ЦПД. Вирус может размножаться и не вызывать заметных изменений в клетке, тогда прибегают к окрашиванию монослоя гематоксилин-эозином или другим гистохимическим методом и изучают тонкие изменения в ядрах и цитоплазме и т.д.

¨ РГАдс. – реакция гемадсорбции:

Данный способ индикации используется только для вирусов, содержащих гемагглютинины (ГА). Если к культуре клеток, зараженной вирусом с ГА, добавить эритроциты, то они могут адсорбироваться на клетках, пораженных вирусом. Данный феномен наблюдается с вирусами клещевого энцефалита, гриппа, парагриппа, кори, паротита и т. д. Учёт реакции проводится с помощью световой микроскопии.

¨ РГА – реакция гемагглютинации:

Данный способ индикации используется только для вирусов, содержащих гемагглютинины (ГА). Вирусы, обладающие ГА, способны вызывать склеивание эритроцитов. В отличие от гемадсорбции, для РГА берется вируссодержащая жидкость (ВСЖ) (культуральная среда, амниотическая или аллантоисная жидкость и т.д.), помещается в лунку планшета и добавляется взвесь эритроцитов (куриных, бараньих, человеческих и др.). При наличии в ВСЖ вируса с ГА происходит агглютинация эритроцитов, и они образуют осадок в виде зонтика (РГА положительная); при отсутствии вируса образуется осадок из эритроцитов в виде пуговки (РГА отрицательная).

¨ Цветная проба Солка:

Самый простой метод индикации вирусов в культуре клеток. Сущность его заключается в визуальной оценке окраски питательной культуральной среды. Большинство питательных сред для культур тканей содержит индикатор – феноловый красный. В нейтральной стерильной среде индикатор имеет красный цвет. В кислой среде феноловый красный становится желтым. Жизнеспособные клетки выделяют в питательную среду кислые продукты своего метаболизма, вызывая изменение цвета индикатора с красного на желтый уже на третьи сутки. При накоплении вируса в культуре клеток он нарушает функционирование клеток вплоть до их гибели. При этом отмечается задержка изменения цвета среды более 6 дней, что и позволяет сделать заключение о присутствии вируса в культуре.

б) В куриных эмбрионах:

¨ Образование бляшек на хорион-аллантоисной оболочке

¨ Помутнение амниотической жидкости.

в) В организме лабораторного животного:

¨ Оценка клинических проявлений инфекции

¨ Оценка патоморфологических и патогистологических изменений

3-ий этап – идентификация вирусов:

Идентификация вируса производится по инактивации его или его свойств специфическими противовирусными сыворотками. Для этого вируссодержащую жидкость (в РТГА, РН, РСК, ИФА) или культуру инфицированных клеток (в РИФ) инкубируют с диагностическими сыворотками, после чего:

¨ добавляется взвесь эритроцитов (курицы, человека, барана и др.). При связывании антителами диагностической сыворотки гемагглютининов вируса агглютинации эритроцитов не происходит (образуется осадок эритроцитов в виде пуговки – РТГА положительная). Если сыворотка не подходит к данному вирусу, эритроциты агглютинируются, образуя осадок в виде зонтика.

б) РН с учетом по:

¨ цветной пробе Солка:

если вирус связался с антителами диагностической сыворотки, он не может инфицировать и разрушать клетки культуры, что приводит к пожелтению питательной среды (РН положительная). Если сыворотка не подходит к данному вирусу, он поражает клетки культуры, они погибают, и цвет питательной среды остается красным.

если вирус связался с антителами диагностической сыворотки, он не оказывает ЦПД на клетки культуры (РН положительная). Учет проводят микроскопически.

¨ нейтрализации инфекционной активности вируса:

если вирус связался с антителами диагностической сыворотки, он не вызывает заболевание у инфицированного лабораторного животного (РН положительная).

если вирус связался с антителами дигностической сыворотки, он не вызывает адсорбции (фиксации) эритроцитов на поверхности культуры клеток (РН положительная). Учет проводят микроскопически.

можно использовать сэндвич-вариант постановки ИФА (см. экспресс-диагностику, только вместо исследуемого материала используют вируссодержащую жидкость).

культуру клеток, инфицированных вирусом, обрабатывают дигностической люминесцирующей сывороткой и учитывают результат реакции с помощью люминесцентного микроскопа. Если вирус связывается с антителами диагностической сыворотки, наблюдается свечение клеток (РИФ положительна).

III. Серологический метод (серодиагностика) – обнаружение антител к антигенам вирусов в сыворотке крови пациента:

Для серодиагностики вирусных инфекций используют парные сыворотки, взятые с интервалом 10-14 дней. Диагностически значимым является не менее чем 4-х-кратное нарастание титра AT.

1. РТГА, РСК, ИФА, непрямая РИФ (с антиглобулиновой люминесцирующей сывороткой), РИА с антигенами вирусов или инактивированными вирусными частицами.

2. РН с живыми лабораторными штаммами вируса с учетом по: цветной пробе Солка, РТГАдс, нейтрализации ЦПД или инфекционной активности вируса.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ

Студент должен знать:

-морфологию, экологию, физиологию вирусов, методы их изучения;

-основы эпидемиологии вирусных инфекций (типы инфекций);

-основы химиотерапии и химиопрофилактики вирусной инфекции;

-факторы иммунитета при вирусных инфекциях.

Студент должен уметь:

-проводить профилактику вирусных инфекций;

-составлять алгоритмы действия в условиях эпидемии.

Вопросы для фронтального обсуждения:

1.Дайте понятие вирусам. Охарактеризуйте особенности строения и жизни вирусной частицы.

2.Какими факторами осуществляется защита организма человека от вируса.

3.Назовите группу и механизм действия препаратов на вирусы. Приведите примеры препаратов.

4.Назовите типы инфекции, вызываемые вирусами.

5. Назовите представителей кишечных, кровяных, респираторных вирусных инфекций, инфекций кожных покровов и слизистых.

7.Назовите, как называются мероприятия, ликвидирующие эпидемический процесс.

Самостоятельная работа студентов:

Запишите определения методов исследования вирусных инфекций.

Зарисйте в атлас внутриклеточные включения при натуральной оспе (тельца Гварниери), при бешенстве (тельца Бабеша-Негри).

3.Составьте план противоэпидемических мероприятий на вирусную инфекцию (инфекцию определяет преподаватель).

Краткие теоретические положения

Введение

Расширение возможностей в лечении и профилактике вирусных болезней с использованием противовирусных препаратов, иммуномодуляторов и вакцин с различным механизмом действия нуждается в быстрой и точной лабораторной диагностике. Узкая специфичность некоторых противовирусных препаратов также требует быстрой и высокоспецифичной диагностики инфицирующего агента. Появилась необходимость в количественных методах определения вирусов для мониторинга противовирусной терапии. Помимо установления этиологии заболевания лабораторная диагностика имеет важное значение в организации противоэпидемических мероприятий.

Ранняя диагностика первых случаев эпидемических инфекций позволяет своевременно провести противоэпидемические мероприятия – карантин, госпитализацию, вакцинацию и пр. Реализация программ по ликвидации инфекционных заболеваний, например натуральной оспы, показала, что по мере их выполнения возрастает роль лабораторной диагностики. Существенную роль играет лабораторная диагностика в службе крови и акушерской практике, например, выявление доноров, инфицированных вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), вирусом гепатита В (HBV), диагностика краснухи и цитомегаловирусной инфекции у беременных.

Методы диагностики вирусных инфекций

Для успешного выделения вирусов клинический материал должен быть взят в соответствии с патогенезом предполагаемого заболевания и в наиболее ранние сроки.

Как правило, берутся:

– при респираторных инфекциях – носоглоточный смыв;

– при энтеровирусных инфекциях – смыв и фекалии (рео-, энтеровирусы);

– при поражениях кожи и слизистых оболочек – соскобы, содержимое пузырьков (герпес, ветряная оспа);

– при экзантемных инфекциях – смывы (корь, краснуха);

– при арбовирусных инфекциях – кровь, спинномозговая жидкость.

1.Быстрые (экспресс-методы) — прямое обнаружение вируса или его компонентов (антигенов, НК), включений непосредственно в клиническом материале.

А. Вирусоскопический метод заключается в об­наружении вируса в исследуемом материале под микроскопом. Чаще всего используют электронный микроскоп. Световая микроскопия из-за нич­тожно малых размеров вирусов практически не применяется. При данном методе можно определить тип НК, размеры вириона, форму вириона, а также выявить внутрик­леточные включения, которые образуются в пораженных клетках при некоторых инфек­циях.

II. Вирусологический метод основан на:

культивировании вирусов в чувствительных биологических системах (клеточных культурах, курином эмбрионе, организмах лабораторных животных),их индикации по цитопатогенному действию на биологическую систему (рис.1), идентификации по ингибиции действия вирусов соответствующими противовирусными антителами (рис.2).

Рис. 1. Цитопатическое действие вирусов на клетку: А-нормальный рост, Б-ЦПД вирусов на клетку

Рис.2 Ингибиция вируса антителами

Вирусологическое исследование - это "золотой стандарт" вирусологии и должно проводится в специализированной вирусологической лаборатории. В настоящее время оно используется практически только в условиях возникновения эпидемической вспышки того или иного вирусного инфекционного заболевания.

III. Серологический метод — определение противовирусных антител (оптимально — IgM) и/или определение динамики нарастания их титров за определенный период заболевания в парных сыворотках. Диагностически значимым считают нарастание титра антител в 4 и более раз.

Метод парных сывороток:осуществляем сбор венозной крови в количестве 10 мл в начале болезни и в конце, приготавливаем сыворотку, определяем количество антител в первой и второй сыворотке.

При этом четырехкратное нарастание титра антител во второй сыворотке в большинстве случаев служит показателем протекающей или свежеперенесенной инфекции. При исследовании одной сыворотки, взятой в острой стадии болезни, диагностическое значение имеет обнаружение антител класса Ig М, свидетельствующее об острой инфекции.

Современные методы диагностики:

1.ПЦР-выявляют персистирующие вирусы по НК, находящиеся в клиническом материале, с трудом обнаруживаемые или не обнаруживаемые другими методами.

2.Радиоизотопный иммунный анализ (РИА)-метод основан на метке антител радиоизотопами, что обеспечивало высокую чувствительность в определении вирусного антигена. Широкое распространение метод получил в 80-е годы, особенно для определения маркеров HBV и других некультивируемых вирусов. К недостаткам метода относится необходимость работать с радиоактивными веществами и использования дорогостоящего оборудования (гамма-счетчиков).

3.Иммуноферментный анализ (ИФА) – Иммуноферментные методы определения вирусных антигенов в принципе сходны с РИФ, но основываются на мечении антител ферментами, а не красителями. Наиболее широко используется пероксидаза хрена и щелочная фосфатаза, применяют также b-галактозидазу и b-лактамазы. Меченые антитела связываются с антигеном, и такой комплекс обнаруживается при добавлении субстрата для фермента, с которым конъюгированы антитела. Конечный продукт реакции может быть в виде нерастворимого осадка, и тогда учет проводится с помощью обычного светового микроскопа, или в виде растворимого продукта, который обычно окрашен (или может флюоресцировать или люминесцировать) и регистрируется инструментально.

Поскольку с помощью ИФА можно измерять растворимые антигены, то не требуется наличия интактных клеток в образце и таким образом могут использоваться различные виды клинического материала.

Другое важное преимущество метода ИФА – возможность количественного определения антигенов, что позволяет применять его для оценки клинического течения болезни и эффективности химиотерапии. ИФА, как и РИФ, может применяться как в прямом, так и в непрямом варианте.

Твердофазный ИФА, дающий растворимый окрашеный продукт реакции, нашел наибольшее распространение. ИФА может быть использован как для определения антигена (тогда на твердую фазу – дно лунки полистиролового планшета – наносятся антитела), так и для определения антител (тогда на твердую фазу наносятся антигены).

4.Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) – Метод основан на использовании антител, связанных с красителем, например флюоресцеинизотиоцианатом. РИФ широко применяется для выявления вирусных антигенов в материале больных и для быстрой диагностики.

В практике применяются два варианта РИФ: прямой и непрямой. В первом случае применяются меченные красителем антитела к вирусам, которые наносятся на инфицированные клетки (мазок, культура клеток). Таким образом, реакция протекает одноэтапно. Неудобством метода является необходимость иметь большой набор конъюгированных специфических сывороток ко многим вирусам.

При непрямом варианте РИФ на исследуемый материал наносится специфическая сыворотка, антитела которой связываются с вирусным антигеном, находящимся в материале, а затем наслаивается антивидовая сыворотка к гамма-глобулинам животного, в котором готовилась специфическая иммунная сыворотка, например антикроличья, антилошадиная и т. п. Преимущество непрямого варианта РИФ состоит в потребности лишь одного вида меченых антител.

Метод РИФ широко применяется для быстрой расшифровки этиологии острых респираторных вирусных инфекций при анализе мазков-отпечатков со слизистой оболочки верхних дыхательных путей. Успешное применение РИФ для прямой детекции вируса в клиническом материале возможно лишь в случае содержания в нем достаточно большого числа инфицированных клеток и незначительной контаминации микроорганизмами, которые могут давать неспецифическое свечение.

5.Другие методы диагностики –

РТГА используется для диагностики заболеваний, вызванных гемагглютинирующими вирусами. Она основана на связывании антителами сыворотки больного добавленного стандартного вируса. Индикатором реакции являются эритроциты, агглютинирующиеся вирусом (формирование характерного "зонтика") при отсутствии специфических антител и оседающие на дно неагглютинированными при их наличии.

РСК является одной из традиционных серологических реакций и используется для диагностики многих вирусных инфекций. В реакции принимают участие две системы: антитела сыворотки больного + стандартный вирус и эритроциты барана + антитела к ним, а также оттитрованный комплемент. При соответствии антител и вируса этот комплекс связывает комплемент и лизиса бараньих эритроцитов не происходит (положительная реакция). При отрицательной РСК комплемент способствует лизису эритроцитов. Недостатком метода является его недостаточно высокая чувствительность и трудность стандартизации реагентов.

Для учета значимости РСК также, как и РТГА, необходимо титрование парных сывороток, то есть взятых в начале заболевания и в период реконвалесценции.

РПГА – агглютинация сенсибилизированных вирусными антигенами эритроцитов (или полистироловых шариков) в присутствии антител. На эритроцитах могут быть сорбированы любые вирусы, независимо от наличия или отсутствия у них гемагглютинирующей активности. В связи с наличием неспецифических реакций сыворотки исследуются в разведении 1:10 и более.

РНГА – агглютинация эритроцитов, сенсибилизированных специфическими антителами в присутствии вирусных антигенов. Наибольшее распространение РОПГА получила при выявлении HBs-антигена как у больных, так и у доноров крови.