Методика отбора проб на вирусы

Об актуальных изменениях в КС узнаете, став участником программы, разработанной совместно с ЗАО "Сбербанк-АСТ". Слушателям, успешно освоившим программу выдаются удостоверения установленного образца.

Программа разработана совместно с ЗАО "Сбербанк-АСТ". Слушателям, успешно освоившим программу, выдаются удостоверения установленного образца.

Методические указания МУК 4.2.2136-06 “Организация и проведение лабораторной диагностики заболеваний, вызванных высоковирулентными штаммами вируса гриппа птиц типа А (ВГПА), у людей” (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ 9 ноября 2006 г.)

В справке нет пункта 3!

Дата введения: с момента утверждения

ВГПА - вирус гриппа птиц типа А

Биобезопасность - биологическая безопасность

ЛПУ - лечебно-профилактические учреждения

МФА - метод иммунофлуоресцирующих антител

ОТ-ПЦР - метод обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции

1.1 В настоящих методических указаниях определены порядок сбора, упаковки, хранения, транспортирования и выполнения лабораторных исследований биологического материала от больных (и умерших) пациентов при лабораторной диагностики заболеваний, вызванных высоковирулентными штаммами вируса гриппа птиц типа А (ВГПА).

1.2 Методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, лечебно-профилактических и других организаций, независимо от организационно-правовой формы.

3.1 При эпизоотическом неблагополучии в России и за рубежом по ВГПА и при отсутствии лабораторно подтвержденных случаев заболевания людей на данной территории:

3.1.1 Забор материала от пациентов (или умерших) с подозрением на инфекцию ВГПА проводят в лечебно-профилактических учреждениях (ЛПУ).

Применяемые на этом этапе тест-системы должны обеспечивать первичную идентификацию возбудителя как вируса гриппа типа А и дифференциацию штаммов этого вируса по типу гемагглютинина (например Н5).

3.1.4 При получении положительных результатов подтверждающего тестирования референс-лаборатория проводит изоляцию вируса, изучение его свойств и депонирование.

Максимальное внимание должно уделяться случаям ВГПА с предположительной передачей от человека человеку. Регистрация подобных случаев требует незамедлительного проведения комплекса противоэпидемических мероприятий и изучения генетических особенностей изолята ВГПА.

3.2 При наличии лабораторно подтвержденных случаев заболевания людей ВГПА на данной территории:

3.2.1 Забор материала проводят в ЛПУ при подозрении на заболевание ВГПА.

3.2.3 Обязательное подтверждающее тестирование в референс-лаборатории не проводится. Направление материала в референс-лабораторию осуществляется в случаях возникновения противоречивых результатов при первичном тестировании.

4.3 Для исследования забирают следующие виды клинического материала:

- смывы из полости носа и ротоглотки (для ОТ-ПЦР-анализа);

- мазки из полости носа (для МФА и ОТ-ПЦР-анализа) и ротоглотки (для ОТ-ПЦР-анализа);

- носоглоточное отделяемое (для выделения вируса, ОТ-ПЦР-анализа).

- фекалии (для ОТ-ПЦР-анализа).

Перечисленные выше процедуры по забору клинического материала врачи осуществляют в противочумных костюмах IV типа (или длинном хирургическом халате, с завязками на спине, шапочках), дополненных ватно-марлевыми повязками или респираторами типа ШБ-1 (или РБ) “Лепесток-200”. На руки надевают резиновые перчатки.

Целесообразно также включать в исследование аспираты из трахеи, бронхоальвеолярный лаваж и биоптаты легких при возможности их забора. Данные процедуры осуществляет врачебный персонал, одетый в противочумный костюм I типа (или длинный хирургический халат, с завязками на спине, дополненный фартуком, бахилами, косынкой, очками, ватно-марлевой повязкой или респиратором типа ШБ-1 (или РБ) “Лепесток-200” и перчатками).

Выбор времени забора клинического материала очень важен, так как наиболее высокое содержание вируса в дыхательных органах человека регистрируется в течение первых четырех дней после появления признаков заболевания. Образцы должны быть собраны в течение 3 сут. после появления клинических признаков, указанных в п. 6.1.

Для постмортальной диагностики используют аутоптаты легких, трахеи и селезенки.

От одного больного должно забираться не менее трех видов клинического материала. Обязательно следует забирать мазки из полости носа и роторлотки и носоглоточное отделяемое. Каждый образец материала помещают в отдельную транспортную емкость.

4.4 Сбор материала производят в пробирки со стабилизирующей средой, приготовленной согласно приложению 4, и/или в пробирки с транспортной средой, предоставляемой (или рекомендуемой) фирмой-производителем тест-систем.

4.5 Отправку материала в лабораторию осуществляют в транспортной таре со стабилизирующей средой (приложение 4).

1) в транспортную емкость (плотно закрывающиеся пластмассовые пробирки или флаконы с завинчивающимися крышками); плотно закрытый верхний конец транспортной емкости вместе с крышкой герметизируют различными пластификаторами (парафин, парафильм и др.); емкость маркируют;

2) в полиэтиленовый пакет подходящего размера с ватой (или другим гигроскопичным материалом) в количестве достаточном для адсорбции всего образца в случае его утечки; полиэтиленовый пакет следует герметично заклеить или запаять;

5.1.1 Образцы от одного пациента могут быть упакованы в один полиэтиленовый пакет. Не допускается упаковывать образцы материалов от разных людей в один и тот же пакет.

5.1.2 В полиэтиленовый пакет вкладывают бланк направления с указанием: наименование направляющего учреждения, ФИО больного, возраст, место жительства, предварительный диагноз, эпидемиологический анамнез, вид материала, дата и время взятия материала.

5.2 Герметично закрытые полиэтиленовые пакеты помещают в термоизолирующий плотнозакрывающийся контейнер (термос), приспособленный для транспортирования биологических материалов.

5.2.1 В термоконтейнеры и термосы помещают охлаждающие элементы или пакеты со льдом. К наружной стенке термоконтейнера или термоса прикрепляют этикетку с указанием вида материала, условий транспортирования, названия пункта назначения. Сроки и условия транспортирования упакованных проб клинического материала указаны в приложении 2.

5.3 Транспортирование проб клинического материала в референс-лабораторию, вирусологические лаборатории и лаборатории учреждений противочумной системы Роспотребнадзора осуществляется нарочным(и), информированным о правилах доставки материала в соответствии с п. 3.4. СП 1.2.036-95.

6.1 При отсутствии лабораторно подтвержденных случаев заболевания людей на данной территории лабораторные исследования с целью диагностики ВГПА следует проводить у пациентов с респираторными заболеваниями тяжелого течения и неясной этиологии при наличии как минимум двух из перечисленных (следующего комплекса - убрать) симптомов:

- фебрильная лихорадка с температурой тела выше 380C;

- затрудненное дыхание или дыхательная недостаточность;

- водянистая диарея при отсутствии слизи и крови в фекалиях;

в комбинации хотя бы с одним из следующих эпидемиологических признаков в период 1-7 дней перед появлением симптомов :

- посещение мест регистрации заболевания ВГПА у птиц или людей;

- тесный контакт (в радиусе 1 метра) с лицом, являющимся подозрительным, вероятным или подтвержденным случаем ВГПА;

- контакт с погибшими или больными птицами, уход, убой, ощипывание, разделка тушек, подготовка к употреблению домашней или дикой птицы или контакт с их останкам или объектами окружающей среды, контаминированными их фекалиями на территории, где в течение последнего месяца были заподозрены или подтверждены случаи инфекции ВГПА у животных или людей;

- манипуляции с образцами клинического материала (от животных или людей), подозрительным на зараженность ВГПА в лаборатории или в иной обстановке;

- употребление сырых или недостаточно приготовленных продуктов из домашней птицы на территории, где в течение последнего месяца были заподозрены или подтверждены случаи инфекции ВГПА у животных или людей.

- Тесный контакт с подтвержденно инфицированным ВГПА животным, но не домашними или дикими птицами (например, кошка или свинья).

Данный случай расценивается как подозрительный случай ВГПА.

Вероятный случай ВГПА - лицо, умершее от необъясненного острого респираторного заболевания, которое расценивается как эпидемиологически связанное по времени, месту и экспозиции с вероятным или подтвержденным случаем ВГПА, а также лицо, отвечающее критериям для подозрительного случая, и одному из дополнительных критериев:

a. инфильтраты или признаки острой пневмонии на рентгенограмме грудной клетки плюс признаки дыхательной недостаточности (гипоксемия, выраженное тахипноэ) или

b. положительный результат лабораторного подтверждения инфекции, вызванной вирусом гриппа А, но недостаточное лабораторное подтверждение инфекции.

6.2 При наличии лабораторно подтвержденных случаев заболевания людей ВГПА на данной территории показанием к обследованию являются клинические симптомы, приведенные в п. 6.1. Дополнительные эпидемиологические признаки являются необязательными.

6.3 Исследование секционного материала от умерших на наличие вируса ВГПА проводят при:

- сходстве клинической картины заболевания, приведшего к летальному исходу, с описанной в п. 6.1 или невозможности исключения такой клинической картины в анамнезе и при наличии в анамнезе хотя бы одного из перечисленных в п.п. 6.1 дополнительных эпидемиологических признаков.

6.4 Исследования проводят с использованием диагностических тест-систем, разрешенных к применению в установленном порядке. Для выявления ВГПА методом ОТ-ПЦР предпочтение должно отдаваться диагностическим тест-системам, которые обеспечивают максимальную контаминационную безопасность исследований.

6.5 При проведении первичного тестирования на наличие вируса ВГПА должны исследоваться не менее 2 видов клинического материала (например: мазки из полости носа и из ротоглотки) с использованием как минимум двух методов - ОТ-ПЦР и МФА.

6.6 При получении отрицательных результатов исследования всех образцов выдается окончательный отрицательный ответ.

При отсутствии регистрации заболевания людей, вызванных ВГПА, на данной территории при получении хотя бы одного положительного результата при МФА исследовании или использовании ОТ-ПЦР выдается предварительный положительный ответ и образцы направляют для подтверждающего тестирования в референс-лабораторию.

В период регистрации заболевания людей, вызванных ВГПА на данной территории, обязательное подтверждающее тестирование не проводят, и при получении хотя бы одного положительного результата при вирусологическом исследовании или использовании ОТ-ПЦР выдается окончательный положительный ответ.

6.7 При подтверждении в референс-лаборатории положительного результата первичного тестирования, при исследовании хотя бы одного вида клинического материала выдается окончательный положительный ответ.

При получении в референс-лаборатории отрицательных результатов исследования двух видов клинического материала проводится повторное тестирование. При получении аналогичного результата выдается окончательный отрицательный ответ.

7.1 Первичное исследование материала от больного, подозрительного на зараженность вирусом ВПГА, проводят в лабораториях, имеющих разрешение на работу с ПБА III-IV групп патогенности.

Подтверждающее тестирование осуществляется в референс-лаборатории.

7.2 Проведение работ, не связанных с накоплением вируса, образованием аэрозолей инфицированного материала (окраска и просмотр мазков, постановка серологических реакций с необеззараженным, диагностическим материалом, серологические исследования с необеззараженным материалом) осуществляют в противочумном костюме IV типа, дополненном ватно-марлевой повязкой или респиратором типа ШБ-1 (или РБ) “Лепесток-200 и резиновыми перчатками. Работы проводят в боксе биологической безопасности II класса.

7.3 Проведение работ по заражению культур клеток или куриных эмбрионов, а также связанных с возможностью образования аэрозоля осуществляют в боксах безопасности III класса. Работы проводят в противочумном костюме IV типа, дополненном ватно-марлевой повязкой или респиратором типа ШБ-1 (или РБ) “Лепесток-200 и резиновыми перчатками.

7.4 Аптечка экстренной профилактики лабораторий, проводящих диагностику заболеваний, вызванных ВГПА, должна быть укомплектована в соответствии с СП 1.3.1285-03 и дополнена двумя из следующих противовирусных препаратов: Циклоферона и Амиксина, Ремантадина, Альгирема, Арбидола и Озельтамивира (Тамифлю).

7.5 Режимы обеззараживания различных объектов при лабораторной диагностике ВГПА (в соответствии с СП 1.3.1285-03).

7.5.1 Обеззараживание поверхностей помещения (пол, стены, двери), оборудования, рабочих столов и др. - двукратным протиранием с интервалом 15 мин 6% раствором перекиси водорода или 3% раствором хлорамина (экспозиция 120 мин), либо любым дезинфицирующим средством, обладающим вирулицидной активностью, с последующей обработкой УФ в течение 60 мин.

Запрещено одновременное использование 6% раствора перекиси водорода и 3% раствора хлорамина в пределах одной лаборатории в связи с опасностью взрывоподобного характера протекания химической реакции при смешении этих растворов.

7.5.2 Обеззараживание защитной одежды осуществляют:

а) кипячением в 2% растворе соды в течение 30 мин с момента закипания;

б) замачиванием на 30 мин при 50. С в 3% растворе перекиси водорода с 0,5% моющего средства.

7.5.3 Обеззараживание перчаток - замачиванием на 60 мин в 6% растворе перекиси водорода с 0,5% моющего средства или в 3% растворе хлорамина.

7.5.4 Обеззараживание лабораторной посуды, автоклавируемых дозаторов, наконечников, вируссодержащих жидкостей, агарозного геля, инструментария из металла проводится методом автоклавирования - давление 2,0 кГс/см2 (0,2 Мпа), температура 132+-2. С, время 45 мин.

7.5.5 Обеззараживание дозаторов - двукратным протиранием поверхностей дозатора с интервалом 15 мин 6% раствором перекиси водорода, с последующей обработкой в парах формалина в течение 60 мин.

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко

Рекомендуется использование следующей стабилизирующей среды для хранения и транспортировки материала от людей для дальнейших вирусологических исследований.

Среда готовится в стерильных условиях, автоклавирование не допускается, можно стерилизовать фильтрованием через нитроцеллюлозный стерильный фильтр в стерильную же посуду.

- среда для культур клеток N199, содержащая 0,5% BSA;

- пенициллин 2 х 10(6) ед./л, стрептомицин 200 мг/л, полимиксин В 2 х 10(6) ед./л, гентамицин 250 мг/л, нистатин 0,5 х 10(6) ед./л.

Методические указания МУК 4.2.2136-06 “Организация и проведение лабораторной диагностики заболеваний, вызванных высоковирулентными штаммами вируса гриппа птиц типа А (ВГПА), у людей” (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ 9 ноября 2006 г.)

Текст методические указания официально опубликован не был

2. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 9 ноября 2006 г.

Отбор проб продуктов и сырья призван при оптимальных затратах времени и средств обеспечить представительность проб, наиболее полно и достоверно характеризующих радиоактивное загрязнение контролируемой партии продукции.

Отбор проб является начальным этапом радиометрического контроля. От правильности приемов отбора проб в значительной мере зависят объективность и точность результатов последующего исследования и, следовательно, заключение о радиационном состоянии исследуемых объектов.

Отбор проб проводят специалисты соответствующих подразделений радиологического контроля. При этом используют следующие термины и определения: партия, проба, точечная проба, объединенная проба, средняя проба, навеска.

Партия – любое количество сельскохозяйственного сырья или кормов из одного пастбища, одного наименования, одного сорта, предназначенное к одновременной сдаче, отгрузке или хранящееся в одном складе, выработанное за одну смену или сутки и оформленное одним документом о качестве.

Партия мяса - любое количество мяса одного вида, категории и термической обработки, выработанное на одном предприятии, оформленное одним документом о качестве и одним ветеринарным свидетельством.

Проба – количество продукции или сырья, отобранное из контролируемой партии для принятия решения о содержании в них радионуклидов.

Точечная проба – количество продукции или сырья, взятое за один раз из одного места партии.

Объединенная проба – проба продукции или сырья, состоящая из нескольких точечных проб, отобранных из контролируемой партии.

Средняя проба – часть объединенной пробы, выделенная для проведения анализа по определению содержания радионуклидов.

Навеска – точно взвешенная часть средней пробы, выделенная для анализа.

Отбор проб различных объектов, сырья и продуктов в Республике Беларусь должен осуществляться в соответствии с действующими стандартами.

Начальным этапом отбора проб является проверка однородности партии продукции или сырья путем измерения мощности дозы гамма-излучения радионуклидов контролируемой партии с помощью дозиметра, имеющего достаточную чувствительность (нижний предел измерения не более 10 мкр/ч): СРП-68-01, СРП-88Н, ДРГ-01Т, ДБГ-06Т, ДБГ-08Т, EL-1101 и др.

Партия продукции считается однородной по содержанию в ней гамма-излучающих радионуклидов, если в разных точках контролируемой партии результаты измерений различаются не более чем на 50% от среднего значения измеренных величин. Если по результатам измерений партия неоднородна, то ее следует рассортировать на однородные группы. Если объект, подвергаемый исследованию, твердый, проводят тщательное его перемешивание в каждой исследуемой емкости.

Для отбора проб используют следующие инструменты и оборудование:

- серпы, ножи из нержавеющей стали;

- скальпели, пинцеты, шпатели, ложки, долота, пилы из нержавеющей стали;

- пробоотборники механические или ручные (щупы различных конструкций: мешочные, вагонные и др.);

- металлические или пластмассовые совки;

- цилиндрические трубки с внутренним диаметром 10 мм;

- банки с плотно закрывающимися крышками, батометры и другие емкости;

- планки деревянные со скошенными ребрами и др.

Применяемые инструменты и оборудование должны быть чистыми и после отбора проб подвергаться дезактивации моющими средствами с последующим дозиметрическим контролем.

Масса или количество средней пробы, отбираемой для радиационного анализа, определяется СТБ (ГОСТом) и регулируется методикой выполнения измерений, применяемой в подразделении радиационного контроля, проводящей измерения. Масса каждого образца зависит от средств измерения, метода исследования, применяемых для определения удельной (объемной) активности и составляет от 100 до 1000 г. При этом объем пробы, отбираемой продукции, должен быть не менее объема щтатного сосуда, входящего в комплект средств измерения.

Методы отбора проб специфичны для каждого вида продукции и включают отбор точечных проб, составление объединенной пробы и выделение средней пробы.

В случае проведения арбитражных испытаний массу средней пробы удваивают. Отобранные пробы делят на две равные части и каждую пробу помещают в отдельную тару: одну – для обычного анализа; другую – для арбитражного анализа.

К отобранным пробам прилагают акты отбора, оформленные в соответствии с требованиями. Количество экземпляров акта отбора проб должно быть не менее двух.

Каждую отобранную пробу помещают в чистую, сухую тару (емкости), соответствующую виду продукта. На тару закрепляют этикетку или бирку, которые должны сохраняться до окончания измерений. На этикетке указывают вид продукции, наименование предприятия, дату и время отбора проб. При необходимости указывают уровень гамма-фона на месте отбора пробы.

Пробы, направляемые в радиологическую лабораторию, расположенную вне места отбора, пломбируют или опечатывают. Транспортируют пробы всеми видами транспорта, в соответствии с утвержденными правилами перевозок для данного вида транспорта.

Пробы молока и молочных продуктов должны доставляться в лабораторию сразу после их отбора.

До начала измерений пробы скоропортящейся продукции следует хранить при температуре от 2 до 6 о С. Пробы остальной продукции – при температуре, предусмотренной для хранения определенного вида продукции.

После проведения радиационного контроля пробы продукции, кроме арбитражных проб, из лаборатории не выдаются. Их списывают или утилизируют по истечении 2 суток после проведения измерений. При проведении арбитражных испытаний – по истечении 7 суток после проведения измерений. Порядок списания и форма акта списания определяются организацией (лабораторией), проводившей измерения. Утилизация проб продукции животноводства осуществляется согласно нормативным документам, действующим в организации (лаборатории), проводившей измерения. По схеме радиологического контроля ветеринарной службы все поступившие в подразделение радиационного контроля на исследование образцы продукции, после проведения анализа, не выдаются и подлежат утилизации без оформления актов на списание.

Отбор проб продуктов питания и объектов ветеринарного надзора производится в строгом соответствии с требованиями действующих нормативных документов и СТБ на каждый вид продукции.

Метод отбора проб по диагонали. Этим методом отбирают пробы от вегетирующих растений, к которым имеется легкий доступ. По диагонали поля, в 7-10 точках, отступающих на равных расстояниях и в определенных интервалах, берут пробы растений в количестве, достаточном для получения объединенной пробы.

Метод отбора проб по двум смежным сторонам. Этим методом отбирают пробы от вегетирующих растений, к которым доступ в глубине поля затруднен (например, кукуруза, зерновые, рапс).

На двух смежных сторонах поля намечают три или четыре точки так, чтобы они охватывали всю длину стороны. Затем на расстоянии 5-15 м от края поля берут пробы. Общее количество отобранного материала должно соответствовать величине объединенной пробы.

Метод отбора проб с помощью пробоотборника. Этот метод используют при отборе материала из складов, средств транспорта и применяют при отборе проб сыпучих и текучих материалов, хранящихся в больших емкостях и др.

Принцип отбора проб этим методом заключается в отборе точечных проб по схеме конверта с верхнего, среднего и нижнего слоя материала, с каждого пункта конверта. При отборе проб используют различные пробоотборники и приспособления.

В случае отбора проб пробоотборником из струи жидкости или сыпучего материала метод конверта не применяют. Пробы отбирают через равные промежутки времени путем погружения пробоотборника в струю сыпучего или текучего материала.

В емкостях со съемными крышками применяют метод конверта. Если емкость имеет высоту до 2 м, пробу отбирают по всему слою при использовании соответствующего приспособления.

В этом случае, когда высота емкости превышает 2 м, пробу следует отбирать соответствующими приспособлениями с верхнего, среднего и нижнего объема емкости.

При отборе проб полутвердых и мазеобразных продуктов (например, маргарин, мед и др.), фасованных в транспортную тару (ящики, бочки и др.), точечные пробы отбирают также с трех слоев. При этом из столбика продукции, взятого с помощью пробоотборника, отбрасывают верхний слой и слой, соприкасаемый с дном емкости, толщиной 0,5-0,7 см.

Метод конверта. Этим методом отбирают сыпучий или поштучный материал, хранящийся насыпью. В зависимости от величины склада или хранилища применяют метод одиночного, двойного или тройного конверта (рисунки 2-4).

Метод квартования. Этим методом выделяется средняя проба из объединенной пробы сыпучего материала. Материал необходимо высыпать на гладкую, чистую и сухую поверхность, чтобы сформировать на ней пирамиду с основанием в форме квадрата, тщательно перемешать. С помощью двух коротких дощечек со скошенными ребрами набрать сыпучий материал с двух противоположных концов и ссыпать его с обеих дощечек на середину квадрата до тех пор, пока слой сыпучего материала не приобретет форму продолговатого холмика.

Затем набрать дощечками материал с обеих концов холмика и ссыпать его на середину. Сформированную пирамиду расплющить в слой, имеющий форму квадрата, и разделить его двумя диагоналями на четыре треугольника, из которых два противоположных отбросить, а из двух оставшихся снова создать квадрат и поделить его двумя диагоналями на четыре треугольника. Эту процедуру повторять до получения средней пробы нужной величины.