Методы исследования нуклеиновых кислот вирусов

Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций подразделяются на несколько больших групп.

- Прямые методы, состоящие в выявлении непосредственно в биологическом материале самого вируса или антител к нему.

- Непрямые методы-заключаются в искусственной наработке вируса в значительных количествах, и его дальнейшем анализе.

К наиболее актуальным в повседневной практике методам диагностики относятся:

Серологические методы диагностики - выявление в сыворотке крови пациента определенных антител или антигенов в результате реакции антиген-антитело(АГ-АТ). То есть, при поиске у пациента определенного антигена используется соответствующее искусственно синтезированное антитело, и, соответственно, наоборот-при выявлении антител используют синтезированные антигены.

Реакция иммунофлуоресценции (РИФ)

Основана на использовании меченых красителями антител. При наличии вирусного антигена он связывается с мечеными антителами, и под микроскопом наблюдается специфическая окраска, которая говорит о положительном результате. При этом методе, к сожалению, невозможна количественная интерпретация результата, а только лишь качественная.

Возможность количественного определения дает иммуноферментный анализ(ИФА). Он похож на РИФ, однако в качестве маркеров используют не красители, а ферменты, превращающие бесцветные субстраты в окрашенные продукты, что и дает возможность количественной оценки содержания как антигенов, так и антител.

- Отмывают не связавшиеся антитела и антигены.

- Добавляют бесцветный субстрат, и в лунках с антигеном, который мы определяем, произойдет окрашивание, т.к. там будет связанный с антигеном фермент, после чего на специальном приборе оценивают интенсивность свечения окрашенного продукта.

По похожей схеме происходит и выявление антител.

Реакция непрямой(пассивной) гемаглютинации (РПГА).

Метод основан на способности вирусов связывать эритроциты. В норме эритроциты падают на дно планшета, образуя так называемую пуговку. Однако если в исследуемом биологическом материале находится вирус, он свяжет эритроциты в так называемый зонтик, который не упадет на дно лунки.

Теперь остановимся на методах диагностики непосредственно нуклеиновых кислот исследуемых вирусов, и прежде всего о ПЦР ( Полимеразная Цепная Реакция) .

Суть этого метода заключается в обнаружении специфического фрагмента ДНК или РНК вируса путём его многократного копирования в искусственных условиях. ПЦР можно проводить только с ДНК, то есть для РНК-вирусов предварительно необходимо произвести реакцию обратной транскрипции.

Непосредственно ПЦР проводят в специальном приборе, под названием амплификатор, или термоциклер, который поддерживает необходимый температурный режим. ПЦР-смесь состоит из добавленной ДНК, которая содержит интересующий нас фрагмент, праймеров (короткий фрагмент нуклеиновой кислоты, комплиментарный ДНК-мишени, служит затравкой для синтеза комплиментарной цепи), ДНК-полимеразы и нуклеотидов.

Стадии цикла ПЦР:

- Деннатурация-первая стадия. Температура повышается до 95 градусов, цепочки ДНК расходятся друг относительно друга.

- Отжиг праймеров. Температуру понижают до 50-60 градусов. Праймеры находят комплиментарный участок цепи и связываются с ним.

- Синтез. Температуру вновь повышают до 72, это рабочая температура для ДНК-полимеразы, которая, отталкиваясь от праймеров, строит дочерние цепи.

Цикл многократно повторяется. Через 40 циклов из одной молекулы ДНК получается 10*12 степени копий копий искомого фрагмента.

При проведении ПЦР в режиме реального времени синтезируемые копии фрагмента ДНК метятся красителем. Прибор регистрирует интенсивность свечения и по ходу реакции строит графики накопления искомого фрагмента.

Современные методы лабораторной диагностики с высокой достоверностью позволяют выявить присутствие вируса - возбудителя в организме, нередко, задолго до появления первых симптомов заболевания.

История вирусологии. Этапы развития вирусологии

Вирусология – биологическая наука, которая изучает природу, морфологию, химический состав, взаимодействие с клеткой вирусов, которые являются неклеточными инфекционными агентами, воспроизводящимися только в живой клетке.

Вирусология как наука делится на общую и частную.

Общая вирусология изучает природу, происхождение, строение, химический состав, генетику вирусов, взаимодействие их с клеткой хозяина, противовирусный иммунитет и методы диагностики вирусных болезней.

Частная вирусология изучает свойства возбудителей вирусных инфекций растений, животных, бактерий, вопросы патогенеза (учение о развитии болезни и механизме протекания биологических процессов), лабораторной диагностики, специфической профилактики и терапии вирусных заболеваний.

Открытие вирусов связано с именем Д. И. Ивановского и датируется 1892 г.

История развития вирусологии делится на четыре периода.

Первый период (древнейший мир - 1892). Вирусология как наука не существовала, а все исследования носили эмпирический характер. Сначала английским врачом Э. Дженнером предложена живая вакцина против натуральной оспы прививая неопасный для человека вирус коровьей оспы, в качестве метода иммунизации людей против этого заболевания. В 1796г. Э. Дженнер впервые сделал прививку от оспы восьмилетнему мальчику. Э. Дженнер является основателем метода вакцинации.

Затем Л. Пастер занимается бешенством. Создав первую вакцину против вирусного заболевания, он, однако, не раскрыл сущности вирусов. Самая первая за пределами Парижа станция прививок против бешенства была создана в Одессе И.И. Мечниковым.

Преимущество вирусов перед бактериями в том, что первые изменяются быстрее, чем вторые.

После открытия вирусов, вызывающих болезни растений (мозаичная болезнь табака) и животных (ящур), были открыты возбудители желтой лихорадки человека (У. Рид). В этот период учеными доказана способность вирусов инфицировать не только клетки растений и животных, но и самих бактерий - бактериофаг (Ф. Д’Эррель, 1915г.). Этот уровень развития вирусологии назван организменным.

Третий период (1940–1960 гг.). Широкое использование в вирусологии получают культуры клеток, что дало возможность культивировать вирусы, изучать их культуральные свойства, получать вакцины. Было доказано, что вирусы способны репродуцироваться только в живой клетке, вызывая при этом специфические изменения морфологии клеток (цитопатическое действие – ЦПД) или функциональное нарушение метаболизма клеток (цитопатический эффект – ЦПЭ). Этот уровень развития вирусологии назван клеточным.

Четвертый период (1970 г. – наши дни). Вирусы стали использовать для изучения фундаментальных проблем генетики, молекулярной биологии. Этот уровень развития вирусологии назван молекулярно-биологическим.

Методы исследования, применяемые в вирусологии: вирусоскопический, выделение и культивирование вирусов, биологический, серологический

Методы исследования, применяемые в вирусологии, аналогичны методам микробиологии.

1. Вирусоскопический метод. Этот метод исследования основан на использовании различных видов микроскопов: световой, люминесцентный (МИФ – метод иммунофлуоресценции, метод флуорохромирования), электронный (изучение морфологии вирусов).

Световая микроскопия позволяет выявлять крупные вирусы (вирусы оспы, эктимы овец), обнаруживать внутриклеточные включения, а также регистрировать цитопатическое действие вирусов на чувствительных тестобъектах.

Метод флуорохромирования люминесцентной микроскопии основан на свечении (люминесценции) вирусов после обработки их веществами – флуорохромами. Этот метод позволяет решать все те же задачи, что и световая микроскопия, однако за счет различного свечения двух типов нуклеиновых кислот вирусов (РНК, ДНК) дает возможность дифференцировать их по содержанию нуклеиновой кислоты.

Метод иммунофлуоресценции люминесцентной микроскопии основан на специфическом взаимодействии вирусного антигена с антителами, меченными флуорохромами. Этот метод позволяет идентифицировать вирусы.

Электронная микроскопия позволяет визуально наблюдать вирусные частицы за счет формирования изображения в электронном микроскопе потоком электронов. При этом становится возможным изучать морфологию вирионов, что позволяет дифференцировать вирусы по семействам (прямая электронная микроскопия).

2. Выделение и культивирование вирусов. Этот метод исследования основан на способности вирусов репродуцироваться (культивироваться) в живых клетках. В вирусологической практике нашли широкое применение три типа тест-объектов: РКЭ (развивающиеся куриные эмбрионы), культуры клеток и организм лабораторных животных. Использование этих тест-объектов позволяет обнаруживать присутствие вирусов в исследуемом материале, поддерживать его в активном состоянии, титровать вирусы, изучать их патогенные свойства, а также проводить постановку реакции нейтрализации и получать вакцины для профилактики вирусных инфекций.

3. Биологический метод. Этот метод исследования заключается в постановке биопробы на лабораторных животных с целью изучения патогенности вирусов. Данный метод исследования соответствует организменному уровню исследования.

4. Серологический метод (с участием жидкости – крови). В основе этого метода лежит постановка серологических реакций, т. е. реакций взаимодействия антигена с антителом in vitro. При этом возможно проводить идентификацию вируса, а также обнаруживать противовирусные антитела в сыворотке крови животных. Это основной метод диагностики вирусных инфекций, требующий минимум затрат и времени для проведения исследования.

Вирусологи́ческие методы исследования

Методы изучения биологии вирусов и их идентификации. В вирусологии широко используются методы молекулярной биологии, с помощью которых удалось установить молекулярную структуру вирусных частиц, способы проникновения их в клетку и особенности репродукции вирусов, первичной структуры вирусных нуклеиновых кислот и белков. Развиваются методы определения последовательности составляющих элементов вирусных нуклеиновых кислот и аминокислот белка. Появляется возможность связать функции нуклеиновых кислот и кодируемых ими белков с последовательностью нуклеотидов и установить причины внутриклеточных процессов, играющих важную роль в патогенезе вирусной инфекции.

Вирусологические методы исследования основаны также на иммунологических процессах (взаимодействие антигена с антителами), биологических свойствах вируса (способность к гемагглютинации, гемолизу, ферментативная активность), особенностях взаимодействия вируса с клеткой-хозяином (характер цитопатического эффекта, образование внутриклеточных включений и т.д.).

В диагностике вирусных инфекций, при культивировании, выделении и идентификации вирусов, а также при получении вакцинных препаратов широко применяют метод культуры ткани и клеток. Используют первичные, вторичные, стабильные перевиваемые и диплоидные клеточные культуры. Первичные культуры получают при диспергировании ткани протеолитическими ферментами (трипсином, коллагеназой). Источником клеток могут быть ткани и органы (чаще почки) эмбрионов человека и животных. Суспензию клеток в питательной среде помещают в так называемые матрацы, бутыли или чашки Петри, где после прикрепления к поверхности сосуда клетки начинают размножаться. Для заражения вирусами используют обычно клеточный монослой. Питательную жидкость сливают, вносят вирусную суспензию в определенных разведениях и после контакта с клетками добавляют свежую питательную среду, обычно без сыворотки.

Клетки большинства первичных культур могут быть пересеяны, такая культура называется вторичной. При дальнейшем пассировании клеток формируется популяция фибробластоподобных клеток, способных к быстрому размножению, большая часть которых сохраняет исходный набор хромосом. Это так называемые диплоидные клетки. При серийном культивировании клеток получают стабильные перевиваемые клеточные культуры. При пассажах появляются быстро делящиеся однородные клетки с гетероплоидным набором хромосом. Стабильные линии клеток могут быть однослойными и суспензионными. Однослойные культуры растут в виде сплошного слоя на поверхности стекла, суспензионные — в виде суспензий в различных сосудах с использованием перемешивающих устройств. Существует более 400 линий клеток, полученных от 40 различных видов животных (в т.ч. от приматов, птиц, рептилий, амфибий, рыб, насекомых) и человека.

В искусственных питательных средах можно культивировать кусочки отдельных органов и тканей (органные культуры). Эти типы культур сохраняют структуру ткани, что особенно важно для выделения и пассирования вирусов, которые не репродуцируются в недифференцированных тканевых культурах (например, коронавирусы).

В зараженных клеточных культурах вирусы можно обнаружить по изменению морфологии клеток, цитопатическому действию, которое может иметь специфический характер, появлению включений, путем определения вирусных антигенов в клетке и в культуральной жидкости; установления биологических свойств вирусного потомства в культуральной жидкости и титрования вирусов в культуре ткани, куриных эмбрионах или на чувствительных животных; путем выявления отдельных вирусных нуклеиновых кислот в клетках методом молекулярной гибридизации или скоплений нуклеиновых кислот цитохимическим методом с помощью люминесцентной микроскопии.

Выделение вирусов является трудоемким и длительным процессом. Его осуществляют с целью определения циркулирующего среди населения типа или варианта вируса (например, для идентификации сероварианта вируса гриппа, дикого или вакцинного штамма вируса полиомиелита и т.д.); в случаях, когда это необходимо для проведения срочных эпидемиологических мероприятий; при появлении новых типов или вариантов вирусов; при необходимости подтверждения предварительного диагноза; для индикации вирусов в объектах окружающей среды. При выделении вирусов учитывают возможность их персистирования в организме человека, а также возникновения смешанной инфекции, вызванной двумя и более вирусами. Генетически однородная популяция вируса, полученная от одного вириона, называется вирусным клоном, а сам процесс получения его — клонированием.

Для выделения вирусов применяют заражение восприимчивых лабораторных животных, куриных эмбрионов, но чаще всего используют культуру ткани. Наличие вируса обычно определяют по специфической дегенерации клеток (цитопатический эффект), образованию симпластов и синцитиев, обнаружению внутриклеточных включений, а также специфического антигена, выявляемого с помощью методов иммунофлюоресценции, гемадсорбции, гемагглютинации (у гемагглютинирующих вирусов) и т.д. Эти признаки могут обнаруживаться лишь после 2—3 пассажей вируса.

Для выделения ряда вирусов, например вирусов гриппа, используют куриные эмбрионы, для выделения некоторых вирусов Коксаки и ряда арбовирусов — новорожденных мышей. Идентификацию выделенных вирусов проводят с помощью серологических реакций и других методов.

При работе с вирусами определяют их титр. Титрование вирусов проводят обычно в культуре ткани, определяя наибольшее разведение вируссодержащей жидкости, при котором происходит дегенерация ткани, образуются включения и вирусоспецифические антигены. Для титрования ряда вирусов можно использовать метод бляшек. Бляшки, или негативные колонии вирусов, представляют собой очаги разрушенных под действием вируса клеток однослойной культуры ткани под агаровым покрытием. Подсчет колоний позволяет провести количественный анализ инфекционной активности вирусов из расчета, что одна инфекционная частица вируса образует одну бляшку. Бляшки выявляют путем окрашивания культуры прижизненными красителями, обычно нейтральным красным; бляшки не адсорбируют краситель и поэтому видны как светлые пятна на фоне окрашенных живых клеток. Титр вируса выражают числом бляшкообразующих единиц в 1 мл.

Очистку и концентрацию вирусов обычно осуществляют путем дифференциального ультрацентрифугирования с последующим центрифугированием в градиентах концентраций или плотности. Для очистки вирусов применяют иммунологические методы, ионно-обменную хроматографию, иммуносорбенты и т.д.

Лабораторная диагностика вирусных инфекций включает обнаружение возбудителя или его компонентов в клиническом материале; выделение вируса из этого материала; серодиагностику. Выбор метода лабораторной диагностики в каждом отдельном случае зависит от характера заболевания, периода болезни и возможностей лаборатории. Современная диагностика вирусных инфекций основана на экспресс-методах, позволяющих получать ответ через несколько часов после взятия клинического материала в ранние сроки после заболевания, К ним относятся электронная и иммунная электронная микроскопия, а также иммунофлюоресценция, метод молекулярной гибридизации, выявление антител класса lgM и др.

Электронная микроскопия вирусов, окрашенных методом негативного контрастирования, позволяет дифференцировать вирусы и определять их концентрацию. Применение электронной микроскопии в диагностике вирусных инфекций ограничивается теми случаями, когда концентрация вирусных частиц в клиническом материале достаточно высокая (10 5 в 1 мл и выше). Недостатком метода является невозможность отличать вирусы, принадлежащие к одной таксономической группе. Этот недостаток устраняется путем использования иммунной электронной микроскопии. Метод основан на образовании иммунных комплексов при добавлении специфической сыворотки к вирусным частицам, при этом происходит одновременная концентрация вирусных частиц, позволяющая идентифицировать их. Метод применяют также для выявления антител. В целях экспресс-диагностики проводят электронно-микроскопическое исследование экстрактов тканей, фекалий, жидкости из везикул, секретов из носоглотки. Электронную микроскопию широко используют для изучения морфогенеза вируса, ее возможности расширяются при применении меченых антител.

Метод молекулярной гибридизации, основанный на выявлении вирусоспецифических нуклеиновых кислот, позволяет обнаружить единичные копии генов и по степени чувствительности не имеет себе равных. Реакция основана на гибридизации комплементарных нитей ДНК или РНК (зондов) и формировании двунитчатых структур. Наиболее дешевым зондом является клонированная рекомбинантная ДНК. Зонд метят радиоактивными предшественниками (обычно радиоактивным фосфором). Перспективно использование колориметрических реакций. Существует несколько вариантов молекулярной гибридизации: точечная, блот-гибридизация, сэндвич-гибридизация, гибридизация in situ и др.

Антитела класса lgM появляются раньше, чем антитела класса G (на 3—5-й день болезни) и исчезают через несколько недель, поэтому их обнаружение свидетельствует о только что перенесенной инфекции. Антитела класса lgM выявляют методом иммунофлюоресценции или с помощью иммуноферментного анализа, используя анти- μ-антисыворотки (сыворотки против тяжелых цепей lgM).

Серологические методы в вирусологии основаны на классических иммунологических реакциях (см. Иммунологические методы исследования): реакции связывания комплемента, торможения гемагглютинации, биологической нейтрализации, иммунодиффузии, непрямой гемагглютинации, радиального гемолиза, иммунофлюоресценции, иммуноферментного, радиоиммунного анализа. Разработаны микрометоды многих реакций, техника их непрерывно совершенствуются. Эти методы используют для идентификации вирусов с помощью набора известных сывороток и для серодиагностики с целью определения нарастания антител во второй сыворотке по сравнению с первой (первую сыворотку берут в первые дни после заболевания, вторую — через 2—3 нед.). Диагностическое значение имеет не менее чем четырехкратное нарастание антител во второй сыворотке. Если выявление антител класса lgM свидетельствует о недавно перенесенной инфекции, то антитела класса lgC сохраняются в течение нескольких лет, а иногда и пожизненно.

Для идентификации индивидуальных антигенов вирусов и антител к ним в сложных смесях без предварительной очистки белков используют иммуноблоттинг. Метод сочетает фракционирование белков с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующей иммуноиндикацией белков иммуноферментным методом. Разделение белков снижает требования к химической чистоте антигена и позволяет выявлять индивидуальные пары антиген — антитело. Такая задача актуальна, например, при серодиагностике ВИЧ-инфекции, где ложноположительные реакции иммуноферментного анализа обусловлены наличием антител к клеточным антигенам, которые присутствуют в результате недостаточной очистки вирусных белков. Идентификация антител в сыворотках больных к внутренним и наружным вирусным антигенам позволяет определять стадию заболевания, а при анализе популяций — изменчивость вирусных белков. Иммуноблоттинг при ВИЧ-инфекции применяют как подтверждающий тест для выявления индивидуальных вирусных антигенов и антител к ним. При анализе популяций метод используют для определения изменчивости вирусных белков. Большая ценность метода заключается в возможности анализа антигенов, синтезируемых с помощью технологии рекомбинантных ДНК, установлении их размеров и наличия антигенных детерминант.

Библиогр.: Букринская А.Г. Вирусология, М., 1986; Вирусология, Методы, под ред. Б. Мейхи, пер. с англ., М., 1988; Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, под ред. М.О. Биргера, М., 1982.

МОСКВА, 24 января. /ТАСС/. Диагностику нового типа коронавируса в РФ в связи с отсутствием специальных тестов сегодня проводят традиционным методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), сообщила журналистам в пятницу заместитель директора по научной работе Научно-исследовательского института гриппа Минздрава РФ (Санкт-Петербург), кандидат биологических наук Дарья Даниленко. По словам опрошенных ТАСС ученых, такая диагностика может занимать от нескольких часов до 2 дней.

Полимеразная цепная реакция - экспериментальный метод, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определенных фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале.

"Есть более традиционные, пускай и долгие, методы диагностики, которые очень точно позволяют установить наличие коронавируса. Это метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим секвенированием. Это сложный метод, такие исследования проводят специализированные лаборатории, и не все больницы способны проводить такие исследования", - отметила Даниленко.

Сколько длится исследование

Как пояснила ТАСС главный инфекционист Новосибирской области Лариса Позднякова (в Новосибирске расположены уникальные учреждения, ориентированные на разработку и внедрение вакцин и лекарств, в частности Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"), максимальное время диагностики таким методом - до двух суток.

"Время диагностики вируса методом ПЦР зависит от тест-системы, которая используется. Иногда анализ может занимать четыре-восемь часов, максимальное время диагностики - двое суток, но обычно результат готов в течение одних суток", - отметила Позднякова.

Тест-систем, которые позволяют быстро выявлять новый тип коронавируса, в течение нескольких минут, на данный момент нет. Однако эксперты отмечают, что в современных условиях разработать их несложно.

"На самом деле, проблем диагностики нет, системы есть, но, может, они существуют не в таком массовом масштабе, потому что ранее коронавирусная инфекция все-таки больше циркулировала среди животных, и вот только относительно недавно стало известно, что она передается человеку, поэтому ту систему, которая определяет коронавирус, нет проблем сделать. Они есть, их просто нужно массово масштабировать", - уверена Позднякова.

Особенности лечения

На данный момент не существует и специальных противовирусных препаратов, направленных непосредственно на возбудителей нового типа коронавируса. В то же время, по словам Даниленко, лечить зараженных новым типом коронавируса можно.

"Лечение понятно, потому что есть протокол ВОЗ, пациент будет изолирован и дальше в зависимости от тяжести и течения инфекции у него будет противовирусное профилактическое лечение. Но специализированных противовирусных препаратов против коронавируса пока нет", - отметила эксперт, добавив, что большинство пациентов, у которых инфекция была лабораторно подтверждена, выздоравливает. Летальные исходы, как правило, связаны с сопутствующими болезнями зараженных.

"У ряда людей с ослабленным иммунитетом может наблюдаться тяжелое течение болезни. Большинство летальных исходов связаны с тем, что у пациентов были какие-то сопутствующие заболевания, достаточно тяжелые, до того, как они заболели новым возбудителем", - отметила Даниленко.

Опасность коронавирусной инфекции в том, что осложнением является вирусная пневмония, она отличается от бактериальной, поясняет Позднякова. "У нее очень быстрое развитие, она имеет специфическую картину", - отмечает эксперт.

Вакцина от коронавируса

Чтобы разработать вакцину от нового типа коронавируса, может понадобиться несколько лет. "Должно быть проведено серьезно исследование коронавирусов. Такие исследования занимают несколько лет. Это три-пять лет. Но даже разработав такой потенциально профилактический или потенциально терапевтический препарат, потребуются годы на проведение клинических исследований", - считает заведующая лабораторией молекулярной микробиологии Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН Нина Тикунова.

Она не сомневается, что российские ученые справятся с этой задачей. В то же время Позднякова отмечает, что вирус может отступить и без вакцины. "Вирус тоже имеет свои циклические законы, поэтому на смену пиковым значениям активности, безусловно, будет и спад инфекции через 3-6 недель, но это закономерный биологический процесс. Естественно, будет снижение, даже без участия вакцинации", - подчеркнула эксперт.

Генетические тесты

Заведующий лабораторией геномной инженерии МФТИ Павел Волчков при этом рассказал, что генетические тесты на базе ПЦР, разработанные в России и Китае, могут находить даже самые незаметные следы нового коронавируса 2019-nCoV всего за три-пять часов, они станут главным инструментом для оценки масштабов распространения инфекции.

"По сравнению со вспышками лихорадки Эбола, в случае с коронавирусом сложность его обнаружения состоит в том, что порождаемые им симптомы схожи с ОРВИ, например, с гриппом. Выявить ложно позитивных-пациентов поможет молекулярно-генетическое тестирование", - сказал Волчков.

Такие системы, как отметил биолог, уже были созданы и развернуты профильными органами Китая, России и других стран. Они основываются на базе так называемой полимеразной цепной реакции (ПЦР).

"Это самый простой и быстрый по ответу тест, который можно создать. Образцом для него может служить сыворотка крови или любые другие физиологические жидкости, например, соскоб со слизистой, слюна. Из них выделяют РНК, производят реакцию обратной транскрипции, чтобы получить ДНК, и используют ее для размножения фрагментов генома вируса с помощью фермента-полимеразы", - пояснил ученый.

Сейчас, как отметил Волчков, медики оценивают масштабы распространения различных опасных инфекций, в том числе птичьего гриппа или лихорадки Эбола, используя инфракрасные камеры и другие системы наблюдений, позволяющие отслеживать внешние симптомы болезни. В случае с коронавирусом 2019-nCoV, для которого характерен длительный инкубационный период и "заурядный" характер течения болезни, схожий с гриппом, сделать это достаточно затруднительно, особенно до того, как его носитель уже успеет вступить в контакт с другими людьми.

"ПЦР-диагностика пока остается самым быстрым способом обнаружения коронавируса. Она позволяет детектировать ничтожные его количества в физиологических жидкостях за очень короткое время. С другой стороны, симптомы могут проявляться не у всех носителей коронавируса из-за инкубационного периода длиной в несколько дней. Поэтому если выяснится, что на борту самолета летел инфицированный пассажир, и его диагноз подтвердится, то в карантин попадут все его попутчики", - подытожил ученый.

Вирус живет, пока работает его нуклеиновая кислота

- Итак, инфекционные свойства вируса связаны с его нуклеиновой кислотой.

- Да, и это было доказано в нескольких крупнейших лабораториях мира.

- А какова же роль белка?

- Он защищает нуклеиновую кислоту от внешних воздействий и помогает вирусу внедриться в клетку.

Четверть века назад, в 1952 году, известнейшими американскими биохимиками Э. Херши и М. Чейз при изучении бактериофагов впервые было показано, что нуклеиновые кислоты играют главную роль в репродукции вирусов. В отличие от всех остальных вирусов бактериофаги не проникают в клетку своего хозяина - микроба, а лишь прикрепляются к его оболочке. Наблюдая с помощью электронного микроскопа за различными стадиями взаимодействия между бактериофагами и бактериями, ученым удалось увидеть, как фаг вводит внутрь микроба свою нуклеиновую кислоту. Весь белковый чехол, которым бактериофаг прикрепился к оболочке микроба, остается снаружи. Фотографии, полученные учеными, обошли весь мир, опровергая прежние утверждения о ведущей роли белка в передаче наследственной информации.

Но ведь все, что касается бактериофага, не обязательно должно повторяться при репродукции других, устроенных по-иному вирусов, утверждали скептики, у которых в голове не укладывалось, что из одной молекулы вирусной РНК в клетке может одновременно возникнуть тысяча и более новых вирусов. И вот в 1956 году X. Френкель-Конрад в США и одновременно с ним А. Гирер и Г. Шрамм в ФРГ сделали важное открытие, за которое они позднее получили Нобелевскую премию. Разрушив белковый компонент вирусной частицы табачной мозаики крепкой карболовой кислотой (фенолом), они выделили РНК и очистили её. Полученная РНК не содержала даже следов белка. Тем не менее введение ее в листья здоровых растений вызвало развитие типичной мозаичной болезни.

Сам по себе факт выделения заразного компонента вируса (его нуклеиновой кислоты) с помощью карболки, широко используемой в практической дезинфекции для разрушения самых устойчивых микроорганизмов, казался чем-то невероятным. Более того, нуклеиновую кислоту, полученную после сжигания фенолом белковых молекул вириона, осаждали и длительно хранили в чистом спирте, который также является сильнейшим дезинфицирующим средством. Несмотря на эти вреднейшие воздействия, совершенно несовместимые с существовавшими в медицине понятиями о жизни, вирусная нуклеиновая кислота отлично сохраняла свою заразительность для клеток восприимчивых растений табака.

Разрушения самых устойчивых микроорганизмов

В последние годы из многих мелких вирусов животных и человека (полиомиелит, клещевой энцефалит, вирусы, вызывающие злокачественные перерождения тканей) также удалось выделить рибонуклеиновые кислоты, обладавшие заразными свойствами. Такие вирусные РНК стали называть инфекционными, поскольку они вызывали развитие болезни в организме восприимчивых животных или же в чувствительных культурах ткани без участия вирусных частиц или их белка. Причем после каждого такого искусственного заражения с помощью инфекционной РНК в клетках исследуемого объекта появлялись вполне полноценные вирусные частицы.

Первоначально открытие инфекционных нуклеиновых кислот было встречено с недоверием. Многие, даже очень солидные, ученые-биологи думали, что инфекционный процесс вызывают не сами нуклеиновые кислоты, а сохранившиеся в растворе частицы живого вируса или примеси белка. Однако такие сомнения были быстро опровергнуты. X. Френкель-Конрад использовал самые чувствительные методы химического анализа, способные обнаружить даже отдельные белковые молекулы. Все пробы на белок были отрицательными: препараты содержали только нуклеиновую кислоту.

Теперь следовало доказать, что именно она несет в себе заразительность для здоровых растений. Для этого А. Гирер и Г. Шрамм провели специальные контрольные исследования, которые показали, что добавление фермента рибонуклеазы к препарату вирусной РНК полностью разрушало его инфекционные свойства. Это подтвердило, что вся заразительность заключена в обследуемой РНК, так как рибонуклеаза совершенно безвредна для вирусной частицы.

Исследователи установили также, что активность вирусных нуклеиновых кислот не изменялась и после добавления иммунной сыворотки. Если бы после обработки фенолом в препарате вирусной РНК сохранились даже отдельные неубитые вирусные частицы, иммунная сыворотка подавила бы их биологическую активность.

Чтобы окончательно убедиться в своей правоте, исследователи провели дополнительные испытания. Они установили, что препараты очищенной вирусной РНК крайне нестойки и быстро разрушаются даже при непродолжительном хранении в термостате или в леднике.

Напротив, частицы исходного вируса табачной мозаики сохраняли высокую устойчивость даже после продолжительного хранения в тех же условиях. Поэтому, считали ученые, вирусные частицы было бы легко обнаружить через несколько дней после хранения на леднике, когда нежные нуклеиновые кислоты полностью разрушатся. Однако все попытки оказались безуспешными: с гибелью РНК исчезала инфекционная активность очищенного препарата. Так было окончательно доказано, что именно выделенная из вируса РНК, а не остаточный вирус, вызывала заражение листьев растений.

Очищенные вирусные нуклеиновые кислоты способны заражать даже ткани, которые в естественных условиях полностью невосприимчивы, то есть устойчивы, нечувствительны к цельному вирусу. Например, вирус полиомиелита прекрасно размножается в тканевых культурах, приготовленных из клеток человека. Ведь как раз у человека этот вирус вызывает поражение спинного мозга, параличи и смерть. В то же время этот вирус не способен заразить тканевые культуры, приготовленные из клеток курицы, так же как он не может заразить и курицу.

Выделенную из вируса полиомиелита инфекционную РНК легко удалось ввести в куриные клетки, после чего в них произошло формирование сотен полноценных зрелых частиц вируса. Но в невосприимчивой ткани вирусная инфекция на этом и прекращалась. Новые вирионы, которые могли бы оказаться высокозаразными для чувствительных тканей, были часто не способны даже выйти из нечувствительных к ним клеток.

Однако с помощью электронного микроскопа ученым удалось увидеть вирусные частицы внутри клеток и выделить вирус из клеток, разрушив их ультразвуком. Такой вирус прекрасно размножался, если его переносили в другую, восприимчивую ткань.

Если учесть полную искусственность опытов с очищенной вирусной нуклеиновой кислотой, с помощью которой ученые старались заразить растения, животных или тканевые культуры, становится понятным, почему активность инфекционной вирусной РНК несравненно ниже активности исходных частиц. Для заражения культуры ткани нужно взять РНК, выделенную из 106-108 вирусных частиц или всего 4-10 вирионов. Разница огромная, и величины несопоставимые.

В естественных условиях "голая" РНК никогда не проникает в клетки извне, через клеточную оболочку. Нуклеиновые кислоты всегда попадают сюда только в составе цельной вирусной частицы, которая освобождает вирусную РНК (или ДНК) лишь внутри зараженной клетки. Хотя вирусные нуклеиновые кислоты и играют ведущую роль в размножении вирусов, однако они не обладают способностью самостоятельно переходить от клетки к клетке.

Некоторые вирусологи ошибочно рассматривают процесс размножения вируса как самостоятельную работу клетки, которая "продуцирует вирусные частицы". В действительности от начала и до конца этот процесс - результат жизнедеятельности вируса. Он осуществляет основную функцию паразита - репродукцию, то есть воспроизводство, новых потомков. Абсолютно чуждые клетке молекулы вирусных нуклеиновых кислот и белка воссоздаются в виде сотен новых копий в ее ядре и в цитоплазме под командой вируса, но за счет строительных материалов и синтетических систем клетки.