Методы обнаружения вирусов на культуре клеток

Методы обнаружения вирусов. Лабораторные методы при диагностике вирусных инфекций. Забор материала для выявления вирусов. Культуры клеток для выявления вирусов.

Лабораторные методы при диагностике вирусных инфекций включают:
• выделение и идентификацию возбудителя;
• обнаружение и определение титров противовирусных AT;
• обнаружение Аг вирусов в образцах исследуемого материала;
• микроскопическое исследование препаратов исследуемого материала.

При заборе материала для исследований необходимо выполнять следующие условия:
• образцы следует отбирать как можно раньше либо с учётом ритма циркуляции возбудителя;
• материал следует отбирать в объёме, достаточном для всего комплекса исследований;
• образцы следует доставлять в лабораторию незамедлительно (!), при относительно кратковременной транспортировке (не более 5 сут) образцы сохраняют на льду, при более длительной — при температуре -50 С.

Выделение и идентификация возбудителя — золотой стандарт в диагностике вирусных инфекций.

Вирусы размножаются только в живых клетках, и выделение возбудителя в заражённой культуре клеток — один из основных методов диагностики вирусных инфекций. Поскольку большинство патогенных вирусов отличает тканевая и типовая специфичность, то почти к каждому вирусу можно подобрать соответствующие клеточные или тканевые чультуры, а также создать стандартные условия культивирования (наличие клеток одного типа). Размножение вируса обеспечивают чувствительные (пермиссивные) клетки. Поэтому при выделении неизвестного возбудителя проводят одномоментное заражение 3

4 культур клеток, предполагая, что одна из них может оказаться пермиссивной. Культуры клеток получают диспергированием соответствующих органов и тканей, но чаще используют эмбриональные ткани (человека и животных) либо трансформированные опухолевые клетки. При помещении на соответствующую плоскую поверхность клеточные культуры обычно растут в виде монослоя. Первично-трипсинизированные культуры. Суспензии клеток получают гомогенизированием соответствующих тканей, предварительно обработанных трипсином. Культуры часто представлены клетками смешанного типа и не подлежат повторному культивированию. Жизнеспособность таких культур составляет 2-3 нед.

Полуперевиваемые линии клеток представлены диплоидными клетками человека и животных. Культуры ограниченно пригодны к повторному диспергированию и росту (как правило, не более 20-30 пересевов), сохраняя при этом жизнеспособность и не подвергаясь спонтанной трансформации.

Перевиваемые линии клеток (гетероплоидные культуры) представлены клетками, подвергнутыми длительному культивированию и спонтанным трансформациям. Культуры способны к многократному диспергированию и перевиванию. Работа с ними менее трудоёмка по сравнению с приготовлениями первичных культур; перевиваемые клетки относительно одинаковы по своей морфологии и стабильны по свойствам.

Сайт СТУДОПЕДИЯ проводит ОПРОС! Прими участие :) - нам важно ваше мнение.

В большинстве случаев перед обнаружением вируса в живой системе его следует освободить от компонентов клеток хозяина. Для этого предусмотрены следующие процедуры:

1) для разрушения клеток в материале используют трехкратное замораживание с последующим оттаиванием или растирание материала в гомогенизаторе со стерильным песком или стеклянными бусами;

2) для очистки от клеточного детрита и посторонних примесей полученный таким образом материал подвергают центрифугированию с последующим исследованием надосадочной жидкости или пропускают через бактериальные фильтры. При этом вирус ввиду малых размеров не осаждается при центрифугировании и не задерживается бактериальными фильтрами, оставаясь в жидкости;

3) полученный материал обрабатывают антибиотиками для деконтаминации и предотвращения бактериального загрязнения.

Полученный таким образом материал принято называть вируссодержащим материалом.

Для выявления вирусов в зараженном объекте в настоящее время применяют различные способы (рисунок 1).

Выявление по цитопатическому действию (ЦПД)

Обнаружение ЦПД вирусов в культуре клеток микроскопическим способом.ЦПД представляет собой дегенеративные изменения в клетках, которые появляются в результате репродукции в них вирусов. Одни вирусы проявляют ЦПД в первые дни после заражения культур клеток (вирус оспы, полиомиелита и др.), другие – значительно позже, иногда спустя 2 недели после заражения (аденовирусы, вирусы парагриппа и др.). Характер ЦПД зависит в основном от вида вируса (рисунок 2).

Рисунок 1 – Методы выявления вирусов в зараженном объекте

А – незараженный монослой; Б – зараженный монослой: видно разрушение монослоя и признаки клеточной дегенерации (а – сморщивание и образование звездчатых клеток; b – округление клеток; с – вздутие клеток; d – лизис и образование гранулярного детрита).

Рисунок 2 – Цитопатическое действие вируса полиомиелита на культуре клеток почки обезьяны в неокрашенных препаратах

Различают полную и частичную дегенерацию клеток монослоя. При полной дегенерации, вызываемой, например, вирусами полиомиелита, Коксаки и ECHO, клетки монослоя подвергаются значительным изменениям, большее их количество слущивается со стекла. Остающиеся единичные клетки сморщены (пикноз ядра и цитоплазмы), для них характерно двойное лучепреломление – сильное свечение при микроскопии. Частичная дегенерация культур клеток имеет несколько разновидностей:

а) по типу гроздеобразования – клетки округляются, увеличиваются, частично сливаются между собой с образованием особых гроздевидных скоплений (характерна для аденовирусов);

б) по типу очаговой деструкции – на фоне в целом сохранившегося монослоя появляются очаги пораженных клеток – микробляшки (характерна для некоторых штаммов вирусов оспы, гриппа);

в) по типу симпластообразования – под действием вирусов клетки сливаются между собой с образованием гигантских многоядерных клеток – симпластов, синцитиев (характерна для вирусов кори, паротита, парагриппа, респираторно-синцитиального, герпеса, иммунодефицита человека).

Пролиферативный тип изменений характерен для некоторых онкогенных вирусов, трансформирующих клетки в злокачественные, что проявляется в приобретении ими способности к неограниченному делению.

Выявление по цветной пробе. Принцип данного теста заключается в следующем. В результате жизнедеятельности клеток в питательной среде накапливаются кислые продукты. В результате цвет входящего в состав среды индикатора (фенолового красного) становится оранжевым. При заражении культуры клеток такими цитопатогенными вирусами, как энтеровирусы или реовирусы, метаболизм клеток подавляется, рН среды и ее цвет не изменяются (она остается красной).

Бляшки вирусов представляют собой очаги разрушенных вирусом клеток монослоя под агаровым покрытием. Вирусные бляшки подсчитывают для количественного анализа инфекционной активности вирусов.

Для получения бляшек разные разведения вирусной суспензии наносят на однослойные культуры ткани в плоских флаконах или чашках Петри и покрывают их слоем агарового покрытия. При этом репродукция вируса и ЦПД ограничиваются только первоначально инфицированными и соседними с ними клетками. Очаги клеточной дегенерации (бляшки) выявляют путем окрашивания культуры нейтральным красным, который либо включают в состав агарового покрытия, либо добавляют непосредственно перед учетом результатов. Бляшки состоят из погибших клеток, не окрашиваются нейтральным красным и поэтому выглядят в виде светлых пятен на фоне розово-красного монослоя.

Известны и другие способы выявления вирусных бляшек в культурах клеток. Так, например, используется определение бляшек под бентонитовым покрытием. Мелкодисперсный очищенный бентонит добавляют к жидкой питательной среде, и этой смесью заливают инфицированный монослой клеток. В результате адсорбции частиц бентонита на поверхности клеток монослой приобретает молочный цвет. В месте размножения вируса, где клетки частично или полностью слущены со стекла, бентонитовое покрытие нарушено (бляшки).

Для выявления вирусных бляшек под бентонитовым питательным покрытием применяют многослойные культуры перевиваемых клеток человека или животных, чувствительные к исследуемому вирусу, пригодны 2-суточные негустые монослои клеток. Готовят 10-кратные разведения из исследуемого материала, каждым разведением инфицируют не менее двух матрацев (колб Эрленмейера или пенициллиновых флаконов) с культурой клеток. После адсорбции вируса (от 30 до 40 мин) монослои от 3 до 4 раз отмывают стерильным ИХН и заливают бентонитовым питательным покрытием: бидистиллированная вода – 415 мл, 6 %-й гель бентонита – 5 мл, раствор Эрла (десятикратный концентрат) – 50 мл, нативная бычья сыворотка – 15 мл, 7,5 %-й раствор гидрокарбоната натрия – 15 мл, пенициллин – 200 ЕД/мл, стрептомицин или линкомицин – 100 ЕД/мл. Монослой зараженных клеток в колбах Эрленмейера емкостью 50 мл заливают от 20 мл до 30 мл бентонитового покрытия, а монослой клеток на дне пенициллинового флакона – от 5 мл до 6 мл.

Гель бентонита получают из сухого минерала. Чтобы улучшить сорбционные свойства бентонита, его насыщают катионами натрия. Затем его стерилизуют 40 мин при 111 °С. Сорбционные свойства геля бентонита не изменяются в процессе хранения при комнатной температуре в течение ряда лет.

Время бляшкообразования под бентонитовым покрытием для различных вирусов неодинаково. Результаты образования бляшек для энтеровирусов, например, учитывают через промежуток времени от 36 до 48 ч. Культуральные сосуды переворачивают монослоем вверх, смывая средой дегенерировавшие клетки. Бляшки, образуемые различными типами энтеровирусов, отличаются по величине, интенсивности развития и характеру краев. Поскольку одна вирусная инфекционная частица (вирион) образует одну бляшку, метод бляшкообразования позволяет точно определить количество инфекционных единиц в материале, а также измерить нейтрализующую активность вирусных антител.

Выявление по реакции гемадсорбции (РГАд)

Реакцию гемадсорбции (РГАд) применяют для индикации в зараженных культурах клеток вируса, обладающего гемагглютинирующей активностью. Сущность реакции заключается в том, что на поверхности клеток, зараженных вирусами, адсорбируются эритроциты, чувствительные к гемагглютинирующему действию вирусов. Так, например, на клетках, зараженных вирусом натуральной оспы, адсорбируются эритроциты кур; вирусом кори – эритроциты обезьян; аденовирусами – обезьян и крыс и др. (рисунок 3).

1 – островковый тип адсорбции эритроцитов на зараженных клетках; 2– незаряженные клетки.

Рисунок 3 –Реакция гемадсорбции

Методика РГадс следующая. Из пробирок с зараженными и незараженными культурами клеток удаляют питательную среду и вносят по 0,2 мл 0,4 % взвеси в изотоническом растворе хлорида натрия трижды отмытых эритроцитов. Пробирки оставляют в наклонном положении на промежуток времени от 20 до 30 мин при температуре 37 °С, 22 °С или 4 °С. Затем пробирки осторожно встряхивают и исследуют под малым увеличением микроскопа. На клетках монослоя, зараженных вирусом, наблюдается диффузная или локальная адсорбция эритроцитов в виде скоплений, гроздей и розеток. При отрицательном результате на монослое адсорбируются лишь единичные эритроциты. Гемадсорбция предотвращается обработкой зараженного вирусами монослоя специфической сывороткой.

Эта реакция позволяет выявить вирусы до развития ЦПД благодаря адсорбции эритроцитов на поверхности клеток, инфицированных гемадсорбирующими вирусами. Эти сложные вирусы имеют в составе супер-капсида специфические гликопротеиды – гемагглютинины (например, орто- и парамиксовирусы). Для воспроизведения РГАд в культуру клеток (контрольную и зараженную вирусом) после определенного для каждого вируса срока инкубации добавляют 0,2 мл 0,5 %-й взвеси эритроцитов так, чтобы был покрыт монослой и оставляют ее на время от 15 до 20 мин при 4 °С, 20 °С или 37 °С (в зависимости от свойств вируса). Затем пробирки встряхивают для удаления неадсорбированных эритроцитов и учитывают под малым увеличением микроскопа скопление их на отдельных клетках или на всем монослое. На незараженных клетках эритроцитов не должно быть. Следует отметить, что не все вирусы, агглютинирующие эритроциты in vitro, способны вызывать гемадсорбцию в культуре клеток. Гемадсорбция наблюдается лишь в том случае, если в процессе взаимодействия вируса с клеткой вирусный гемагглютинин встраивается в структуру наружной клеточной мембраны и тем самым изменяет ее свойства.

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

О наличии и размножения вируса в клетках узнают по так называемому цитопатическому эффекту: в результате размножения вируса клетки гибнут, и под микроскопом заметны дегенеративные изменения клеток. Пласты зараженных клеток отслаиваются от стенки пробирки или флакона. Так как рост клеток прекращается, pН среды мало изменяется по сравнению с контролем (клетки без вируса).

1. Развитие специфической дегенерации клеток – смотрят под микроскопом: образование многоядерных гигантских клеток, округление клеток, очаги клеточной пролиферации.

2. Обнаружение внутриклеточных включений – в цитоплазме или ядре (окрашивают и смотрят под микроскопом).

3. Обнаружение специфического Аг методом иммунофлюоресценции.

4. Положительная реакция гемадсорбции.

5. Положительная реакция гемагглютинации.

6. Образование бляшек – появляются обесцвеченные участки в культуре, состоящие из погибших клеток – это колонии вируса. Окрашивают красным красителем – бляшки круглые, светлые.

Цитопатический эффект, определение, классификация.

Цитопатическии эффект - дегенерация клеток, возникающая под действием размножающегося в культуре ткани вируса. Микроскопически цитопатическое действие, выражается в различных изменениях морфологии клеток, образовании гигантских многоядерных клеток (симпластов), пикнозе ядер и, наконец, в полной деструкции клеток. Макроскопически заметно слущивание клеток со стенок пробирки. Характер клеточной дегенерации зависит, в основном, от вида вируса.

12. Методы типирования вирусов:

Определение типа вирусов в вирусосодержащем материале основа­но на нейтрализации вируса типоспецифическими сыворотками. Конечный результат реакции может быть установлен на основании следующих признаков:

2)нейтрализация реакции гемадсорбции;

4)задержка (торможение) гемагглютинации;

5)свечение клеток, содержащих вирус, под влиянием типоспецифиаческих флуоресцирующих сывороток;

6)нейтрализация в опыте на животных.

Сущность реакции гемадсорбции.

Гемадсорбция - адсорбция эритроцитов на поверхности пораженных вирусом клеток.

Методика реакции. В пробирки о зараженной вирусом культурой ткани вносят 0,2 мл 0,4%-ной взвеси эритроцитов. Пробирки встряхивают и оставляют в наклонном положении. Длительность контакта эритроцитов с клетками зависит от температуры инкубация и вида вируса. Учет реакции производят под малым увеличением микроскопа после непродолжительного покачивания пробирки для отделения неадсорбированных эритроцитов от поверхности клеток. При вирусной гемадсорбции эритроциты прочно фиксированы на клетках и сохраняются на них после 1-2-кратного отмывания. Адсорбируясь на поверхности пораженных вирусом клеток, эритроциты образуют характерные скопления.

Сущность метода цветных проб.

Цветная реакция. В основу реакции положено то обстоятельство, что в процессе размножения и роста клеток в питательной среде накапливаются кислые продукты обмена веществ, снижающие рН среды. В ткани, зараженной вирусом, наступает дегенерация клеток, в силу чего подавляется их метаболизм и не происходит изме­нение рН среды. Для выявления этих изменений в питательную среду добавляют индикатор феноловый красный. При рН выше 7 цвет индикатора красный, при рН 7 - оранжевый и при рН ниже 7 - желтый.

Если клетки не заражены вирусом (или он нейтрализован специфической сывороткой), рH питательной среды сдвигается в кислую сторону, и она становится желтой. В случае размножения вируса клетки дегенерируют, и среда сохраняет исходный красный цвет.

Метод цветных проб может быть использован для титрования ви­руса или вируснейтрализирующих антител.

Сущность метода бляшек.

В основе метода лежит появление в монослое зараженных вирусом клеток обесцвеченных участков, состоящих из дегенерированных клеток. Эти участки, получившие название бляшек, представляют собой колонии вируса, образующегося из одной вирусной частицы.

Метод заключается в следующем. В специальном флаконе на стенке монослой клеток, затем удаляют питательную среду. Клетки заражаю вирусом и заливают агаром, содержащим индикатор нейтральный красный. Там, где происходит рост клеток, среда изменится в кислую сторону и индикатор окрасится в розовый цвет. На тех участках, где клетки погибли под действием вируса, рН среды и, следовательно, цвет индикатора не изменяется. Такие островки неокрашенной среды имеют вид беловатых бляшек.

Сущность реакции гемагглютинации дляобнаружения вирусов.

Реакция гемагглютинации. Аллантоисную жидкость проверяют на содержание вируса путем агглютинации куриных эритроцитов на стекле (и в пробирках - титрование вируса). Для постановки реакции на стекле к капле вируссодержащего материала добавляют одну каплю 5%-ной взвеси эритроцитов. Реакция проходит в течение 5 минут.

Методы микробиологической диагностики вирусных инфекций.

1.Вирусоскопический - обнаружение в исследуемом материале с помощью методов электронной микроскопии вирионов или с помощью светооптических микроскопов внутриклеточных включений.

2.Обнаружение вирусов с помощью методов иммуноэлектронной микроскопии.

3.Вирусологические методы - выделение чистых культур вирусов с использованием культур клеток или куриных эмбрионов.

4.Серологические методы - обнаружение противовирусных антител в сыворотке больного или реконвалесцента с помощью реакций нейтрализации вирусов, реакции связывания комплемента, реакции торможения гемагглютинации, реакций иммуноферментного метода (ИФМ), радиоиммунного метода, (РИМ), реакции пассивной гемагглютинации (РПГА), реакции гемагглютинации иммунного прилипания (комплекс АГ+АТ в присутствии комплемента адсорбируется на эритроцитах),реакций преципитации в агаре, имлунофлуоресцентного метода. В принципе эти реакции могут быть использованы и для обнаружения вирусных ан­тигенов.

5.Биологические методы - заражение чувствительных к данному вирусу лабораторных животных с целью воспроизведения заболевания или последующего выделения вируса.

Что такое вирусоскопический метод диагностики.

Материал со слизистой носа, зева эмульгируют в физиологическом растворе, осаждают и из осадка готовят мазки.

Мазки после высушивания обрабатывают типоспецифическими люминесцирущими сыворотками и микроскопируют с помощью люминесцентно­го микроскопа. Клетки, содержащие соответствующий вирус, адсорби­руют специфические люминесцирующие антитела и светятся.

Что такое вирусологический метод диагностики.

Типы вирусных инфекций.

1.Вирусы с непродолжит пребыванием вируса в организие

-острая; -бессимптомная; -абортативная инфекция

2. Вирусы с продолжит пребывание вируса в организме

-латентные; -Хронические; -медленные

Особенности и механизмы противовирусного иммунитета.

1. Активность Т-цитотоксических лимфоцитов(Т-киллеров) и др киллерных клеток

2. Активность системы интерферона

3. Образование вируснейтрализирующих систем

Механизмы персистирования вирусов в организме.

1. Вирус находится в дефектном состоянии, он не способен размножаться и индуцировать эффект иммунного ответа

2. вирус находится в клетке в виде свободной геномной нукл к-ты, не достает действия антител

3. Геном вируса интегрирован в хромосому клетки-мишени (вирогения)

Для выявления (индикации) вирусов применяются следующие методы.

Индикация вирусов в культуре клеток осуществляется, прежде всего, по цитопатическому действию (ЦПД) вирусов, сроки и характер которого зависят от свойств вируса, проявляясь дегенеративными изменениями клеток с последующей их гибелью и отслаиванием от стекла (рис. 29).

Полная дегенерация клеток сопровождается значительными изменениями в виде пикноза ядра и цитоплазмы, отслаиванием клеточного монослоя от стекла.

Частичная дегенерация культур клеток может протекать по следующим типам:

- гроздеобразования (округление, увеличение и слияние клеток с образованием гроздевидных скоплений, типично для аденовирусов),

- очаговой деструкции (очаги пораженных клеток на фоне в целом сохранившегося монослоя), характерной для вирусов гриппа;

- симпластообразования (слияние клеток с образованием гигантских многоядерных клеток в виде симпластов или синцитиев, характерных для вирусов кори, паротита, парагриппа, респираторно-синцитиального, герпеса, иммунодефицита человека).

Пролиферативный тип ЦПД с трансформацией клеток в злокачественные, обладающие неограниченными потенциями к росту, способны вызывать онкогенные вирусы.

Сроки, в течение которых наступает ЦПД, вариабельны (например, 1-2 дня у полиовирусов, 7-14 суток у аденовирусов).

А б

Рис. 29. Культура клеток почек обезьян (а – незараженная, б – цитопатическое действие вируса) х 200

Индикация вирусов с помощью реакции гемадсорбции (РГад).

Сущность этой реакции заключается в способности эритроцитов человека или животных адсорбироваться на поверхности клеток, инфицированных рядом вирусов (например, орто и парамиксовирусов и др.) в ранние сроки их репродукции (до развития ЦПД) в результате действия гемагглютининов – гликопротеидов, входящих в состав суперкапсида вируса. Для постановки РГад в культуру клеток добавляют 0,2 мл 0,5%-й взвеси эритроцитов, выдерживают 15-20 мин при температуре 4 0 , 20 0 или 37 0 С в зависимости от свойств вируса, после чего взвесь эритроцитов удаляют и производят учет реакции под малым увеличе­нием микроскопа по скоплению эритроцитов на отдельных клетках или на всем монослое.

Индикация вирусов по цветной пробе.

Принцип метода основан на определении кислых продуктов метаболизма, накаливающихся в клетке в процессе ее жизнедеятельности с помощью индикатора фенолового красного, меняющего свой цвет с красного в щелочной среде на оранжево-желтый в кислой среде. При заражении культуры клеток вирусами, вызывающими ЦПД (например, аденовирусы, энтеровирусы и др.), ме­таболизм клеток подавляется, рН среды не меняется и она остается окрашенной в красный цвет.

Индикация вирусов по внутриклеточным включениям.

Репродукция некоторых вирусов (оспы, герпеса, бешенства) приводит к образованию внутриклеточных включений, локализующихся в ци­топлазме или в ядре клеток и представляющих собой скопления вируса (или его антигенов). Включения выявляют путем световой микроскопии культур клеток, окрашенных по Романовскому - Гимзе или другими методами, а также с помощью прямого флюорохромирования (например акридиновым оранжевым) с последующей микроскопией препаратов в люминесцентном микроскопе.

Индикация вирусов с помощью прямой РИФ – выявлениевирусных антигенов, находящихся в инфицированной клетке культуры ткани, с помощью антител диа­гностической иммунной сыворотки, специфических иммуноглобулинов или моноклональных анти­тел, меченых флюорохромом, обычно флюоресцеином (рис. 30).

Индикация вирусов с помощью электронно-микроскопического метода (ЭММ) применяется, в основном, в научных исследованиях. Материал для ЭММ концентрируют различными методами (ультрацентрифугирование, хроматография на колонках, адсорбцией с помощью специальных сор­бентов или антител – для метода иммунной электронной микроскопии). ЭММ позволяет обнаружить в ядре или цитоплазме клеток отдельные вирионы, а также их скопления. В практических целях ЭММ может быть полезен для индикации и идентификации вирусов с типичной морфоло­гией (оспенные вирусы, ротавирусы, коронавирусы, ВИЧ и т.д.).

Рис. 30. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) – выявление вирус-специфических антигенов. х 900

Индикация вирусов по образованию бляшек - очагов разрушенных вирусом монослоя культуры клеток под ага­ровым покрытием. Количество бляшек отражает инфекционную активность вируса.

Для постановки этой пробы вирусную суспензию в разных разведениях вносят в культуры ткани, находящиеся в плоских сосудах, после чего монослой клеток заливают гелем (слой агара или бентонита с индикатором нейтральным красным). Время бляшкообразования для большинства вирусов, обладающих ЦПД, варьирует от 36 до 48 ч. Бляшки выглядят в виде неокрашенных светлых пятен на розово-красном фоне окрашенного монослоя. В бентонитовом методе монослой клеток молочного цвета, бляшки прозрачные.

Зараженные РКЭ инкубируют в термостате при 35- 37 0 С в течение 48 -72 ч., после чего производят их вскрытие, амниотическую и аллантоисную жидкость отсасывают шприцем, а оболочки и эмбрион извлекают и помещают в стерильные чашки Петри. При репродукции некоторых вирусов (натуральной оспы, осповакцины, простого герпеса) на ХАО кури­ных эмбрионах появляются характерные бляшки - беловатые пятна диаметром 1-2 мм, количество которых соответствует числу инфекционных ча­стиц.

В аллантоисной и амниотической жидкости зараженных эмбрионов ряд вирусов (например, ортомиксовирусы, парамиксовирусы, аденовирусы и т.д.) может быть выявлен с помощью реакция гемагглютинации (РГА). Принцип реакции состоит в способности гемагглютининов - поверхностных вирусных структур гликопротеидной при­роды этих вирусов склеивать (агглютинировать) эритроциты опреде­ленных видов животных, птиц или человека. РГА не относится к иммунологи­ческим реакциям, поскольку в ее основе отсутствует взаимодействие АГ и AT.

Гемагглютинационный титр (макси­мальное разведение вирусосодержащей жидкости, вызывающее аг­глютинацию эритроцитов - одна гемагглютинирующая единица вируса,1 ГЕ) соответствует концентрации вируса. Агглютинацию эритроцитов могут вызывать также некоторые бактерии (стафилококки, эшерихии, сальмо­неллы, шигеллы, холерный вибрион Эль-Тор), что необходимо учитывать при трактовке результатов РГА при исследовании вирус-содержащего материала, загрязненного бактериальной микрофлорой.

Определение титра вирусов можно проводить также на хорионаллантоисной оболочке.Для этого в лунки стерильных полистироловых пластин помещают кусочки скорлупы 11-12-дневного куриного эмбриона с неповрежден­ной ХАО, добавляют вирусосодержащую жидкость в десятикратных разведениях на буфере, накрывают пластины фоль­гой и инкубируют при 35-37 0 С в течение 24-72 часов. После этого скорлупу удаляют, добавляют 0,5% взвесь куриных эритроцитов и производят учет реакции по эффекту гемагглютинации, который свидетельствует о репродукции вируса.

Рис. 31. Реакция гемагглютинации для выявления вируса гриппа в хорион-аллантоисной жидкости куриного эмбриона.

Индикация вирусов в организме лабораторных животных находится в зависимости от вируса и вида чувствительного лабораторного животного, будет описана в лабораторной диагностике конкретных вирусных инфекций.

Идентификация вирусов проводится с помощью следующих методов .

Учет вирусиндуцированных патологических изменений в чувстви­тельных живых системах.

Изучение антигенных свойств вирусов в серологических реакциях с противовирусными сыворотками является основным методом идентификации вирусов. Для этого используют ряд иммунологических реакций.

Реакция нейтрализации основана на способности антител нейтрализовать инфекционную активность вирусов в культурах ткани, РКЭ, чувствительных лабораторных животных. Из вирус-содержащего материала готовят десятикратные разведе­ния и добавляют к ним специфическую сыворотку в разведении в соответствии с титром, указанным на этикетке ампулы. Смеси вирус-сыворотка инкубируют 30 — 60 мин при 37 °С для обеспече­ния связывания антигенов с антителами, после чего смесью за­ражают культуру ткани, куриные эмбрионы или лабораторных животных. Контролем является чувствительная биосистема, заражен­ная вирусом без сыворотки.

Реакция считается положительной в случае нейтрализации ЦПД в культуре клеток, а также при отсутствии патологических изменений в куриных эмбрио­нах или в организме животных. По результатам РН высчитывается индекс нейтрализации (ИН - отношение титра вируса в контроле к титру вируса в опыте). При ИН менее 10 реакция расценивается как отрицательная, от 11 до 49 — сомнительная, от 50 и выше — положительная.

РН может быть поставлена в наиболее чувствительном варианте - подавления вирусного бляшкообразования под действием вирусспецифической антисыворотки. Для этого к вирус-содержащему материалу добавляют соответствующую искомому вирусу антисыворот­ку и после инкубации в термостате при 37 0 С течение 30-60 мин смесь вносят в культуру чувствительных клеток. Бляшкообразование выявляют в слое агара или бенто­нита. Идентичность вируса антителам сыворотки проявляется подавлением бляшкообразования.

Другим вариантом РН является цветная проба. Положительный результа­т пробы в случае соответствия вируса противовирусным антителам проявляется блокадой репродукции вируса, клетка при этом остается жизнеспособной, вырабатывая кислые продукты метаболизма, под влиянием которых цвет индикатора (фенолового красного) меняется с красного на желтый. Для постановки пробы в пробирки вносят по 0,25 мл рабочего разведения вируса и соответствую­щую антисыворотку.

Смесь выдерживают при комнатной температуре 30-60 мин, добавляют в каждую пробирку по 0,25 мл клеточной суспензии и закрывают их резиновыми пробками. Пробирки инкубируют в термостате при 37 0 С 6-8 дней, результаты реакции учитыва­ют по изменению цвета индикатора (красный цвет индикатора соответствует щелочному характеру рН - 7,4 указывая на репродукцию вируса и подавление метаболизма клеток; желтый цвет свидетельствует о кислом рН - ниже 7,2 в результате нейтрализации вируса антителами и активном метаболизме клеток с выработкой кислых продуктов обмена).

Перед постановкой РТГА сыворотки обрабатывают периодатом калия, каолином, бентонитом, ацетоном или други­ми веществами для удаления неспецифических ингибиторов гемагглютинации. После этого к двукратным разведениям сыворотки добавляют равное количество вируссодержащей жидкости с активностью 4 ГЕ, смесь инкубиру­ют 30-60 мин при оптимальной для данного вируса температуре (4 0 , 20 0 , 37 0 С), а затем добавляют равный объем 0,5-1,0% взвеси эритроцитов. Смесь снова инкубируют 30-45 мин и производят учет результатов реакции. Титром сыворотки считают ее наибольшее разведение, которое вызывает торможение гемагглютинации.

Реакция торможения гемадсорбции (РТГадс) ос­нована на нейтрализации эффекта адсорбции эритроцитов на по­верхности клеток, инфицированных вирусами, способными вызывать гемадсорбцию. Для постановки реакции по 0,2 мл специфической сыворотки, разведенной 1:5, вносят в пробирки, инкубируют 30-60 мин в термостате при оптимальной для данного вируса температуре, затем добавляют по 0,2 мл 0,5% взвеси эритроцитов. Контрольные пробы содержат неиммунную сыворотку и эритроциты. Пробирки снова инкубируют 20-30 мин, после чего производят учет реакции. Идентификация вируса основывается на признаке отсутствия адсорб­ции эритроцитов на клетках в присутствии иммунной сыворотки при наличии гемадсорбции в конт­рольных пробирках.

Для антигенной идентификации вирусов в клетках культу­р тканей используются также РПГ, РСК, РИФ, РОПГА ИФА, РИА со специфическими иммунными противовирусными сыво­ротками или моноклональными AT.

- выявление вирусной НК методами генодиагностики с помощью метода молекулярной гибридизации и ПЦР;

- электронно-микроскопическое изучение вирусов (см. выше).

Читайте также:

• Базылхан дюсупов о гепатите
• К кому обратиться если обнаружили цитомегаловирус
• Можно ли заразится зубной пастой гепатитом с
• Партнерские роды анализы гепатит
• Как избавиться от гриппа на ногте