Методы определения вирусов картофеля

Вирусные заболевания картофеля представляют значительную опасность для сохранности посевных качеств и урожайности. Вирусы - это неклеточные организмы, которые могут воспроизводиться только внутри живых клеток, используя генетический материал хозяина для собственного размножения. Будучи мельчайшим из всех живых организмов, вирус состоит из нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), заключённой в белковую оболочку. Поскольку вне клетки хозяина вирус не проявляет признаков живого организма и слишком мелок для световых микроскопов, диагностика картофеля для клонального размножения и анализ качества посадочного материала картофеля осуществляется лабораторными молекулярными методами: иммуноферментным анализом (ИФА) или полимеразной цепной реакцией (ПЦР).

Вирусы вызывают ряд общих симптомов на наземной части поражённого растения. Это, как правило, общее угнетение растения, скручивание, морщинистость или пятнистость (мозаичность) листьев. Симптомы могут быть типичными для какого-то определённого вируса, но, в большей степени, разные вирусы могут вызвать схожие симптомы. Более того, различные сорта картофеля могут по-разному реагировать на заражение одним и тем же вирусом. В некоторых случаях, вирусные инфекции протекают бессимптомно.

Несмотря на то, что вирусы редко убивают картофельное растение, они могут оказывать существенное негативное влияние на развитие растений, урожайность и качество клубней и являются основной причиной дегенерации (вырождения) картофеля. Поскольку картофель размножают вегетативно и возбудители болезней картофеля могут переходить в дочерние клубни, доля заражённых вирусами растений увеличивается по мере размножения посевного материала. Диагностика вирусов картофеля проводится для того, чтобы выяснить, заражен посевной материал или нет.

Производство и сертификация семенного картофеля требуют полного отсутствия вирусов в исходном материале и, по возможности, поддержания безвирусного статуса растений при их размножении. Введение картофеля в стерильную культуру с использованием апикальной меристемы в сочетании с термической обработкой позволяет получить безвирусный материал. Как правило, в развитых хозяйствах исходный материал культивируемых сортов поддерживается в стерильной культуре клональным размножением и новые партии семенного картофеля получают из этих тщательно контролируемых и свободных от вирусов и бактериальных патогенов фондов. Иммуноферментный анализ на вирусы картофеля обычно используется для контроля заболеваний в большинстве диагностических лабораторий.

На настоящий момент, известно более 50 видов вирусов картофеля, большинство из которых, либо не вызывают серьёзных проблем, либо имеют очень узкий ареал распространения. В России согласно ГОСТ Р 53136-2008 семенной материал высоких репродукций должен быть свободен от 5 вирусов: Y-, X-, S-, M-вирусов картофеля и вируса скручиваемости листьев картофеля.

Вирус Y (PVY) является одним из тяжелейших вирусов картофеля по степени воздействия на снижение урожайности. В зависимости от условий, сорта и присутствия других вирусов в поражённом растении потери могут достигать 70 %. Симптомы первичного заражения вирусом весьма разнообразны и определяются не только сортом картофеля и условиями культивирования, но и штаммом вируса. Как правило, это черно-коричневые угловатые некрозы листьев, пятнистость, пожелтение, пониклость или опадение листьев и преждевременное отмирание растений. Симптомы вторичного заражения выражаются в карликовости растения и пятнистости и морщинистости листьев. Симптомы заражения вирусом Y картофеля могут проявляться как на всём растении, так и на нескольких листьях или отдельных побегах.

Наряду с Y вирусом, вирус скручиваемости листьев картофеля (PLRV) один из самых тяжелых вирусов. Потери урожая при высоком уровне заражения могут достигать 50%. Симптомы, характерные для первичного и вторичного заражения различны. При первичном заражении, происходящем в текущем сезоне, как правило, повреждаются верхние листья – они скручиваются внутрь, бледнеют и, иногда, несколько краснеют. Вторичная инфекция, развивающаяся из заражённых клубней, протекает с гораздо более тяжёлыми симптомами – повреждение листьев начинается снизу и распространяется по всему растению. Листья скручиваются, бледнеют, краснеют и усыхают. Повреждённые растения формируют нормальные по форме, но более мелкие клубни. Развивается некроз флоэмы, который в клубнях носит название сетевой некроз.

Следующими по значимости являются вирусы Х (PVX) и А (PVA). Они проявляют схожие симптомы, выражающиеся в мозаичности листьев. Оба вируса встречаются везде, где выращивают картофель. Незначительные уровни инфекции практически не отражаются на урожайности, тогда как массовое поражение может приводить к потере урожайности на 20-40%. Однако, в развитых странах контроль за распространением этих вирусов позволил значительно снизить их влияние на выращивание картофеля.

Вирусы S и М, как правило, не проявляют симптомов и не оказывают серьёзного влияния на урожайность поражённых растений. Однако, эти вирусы усиливают негативные эффекты, вызванные другими вирусами в случае совместного заражения растений.

Вирусные болезни картофеля не поддаются лечению. Они передаются с насекомыми, в первую очередь, тлями и при механическом контакте с инфицированными растениями. Таким образом, профилактика и борьба с вирусными заболеваниями сводится к использованию здорового посадочного материала. Необходимы своевременный анализ качества семенного материала картофеля, контроль за появлением и распространением вирусов и своевременное удаление заболевших растений, уничтожение насекомых, аккуратность при проведении полевых работ и работ, связанных с хранением, обработкой и транспортировкой клубней.

Помимо вирусных существуют также инфекционные заболевания картофеля - вы можете ознакомиться с ними в соответствующем разделе.

Применение ультрафиолетового свечения для диагно­стики вирусных заболеваний показало, что выбраковка клубней, пораженных тяжелыми формами морщинистой мозаики, вполне возможна. Такие клубни у всех сортов имеют характерное голубое разных оттенков, но неизмен­но интенсивное свечение, преимущественно по кольцу пучков, нередко переходящее в синий цвет. Разделенный на фракции по типу свечения семенной материал испытывался нами в полевых, условиях. Из данных видно, что во всех случаях картофель, имеющие тип свечения интенсивно голубой, переходящий в ярко-синий, характерный для клубней, пораженных ви­русами, оказывались преимущественно вырожденными и с более низкой продуктивностью. Таким образом, опыты показали, что выбраковка клубней, пораженных тяжелыми формами морщинистой мозаики, по типу свечения вполне возможна.

Сопоставление метода серологических реакций на Х-вирус и метода отбора по люминесцентному свечению показывает, что имеется некоторое совпадение результа­тов. Расхождение результатов люминесцентного и сероло­гического анализов составляет 30—40%. Это, очевидно, можно объяснить тем, что низкие концентрации вируса люминесцентным методом обнаружить не удается.

Из изложенного вытекает, что люминесцентный метод представляет определенный интерес для картофелевод­ства. По интенсивно голубому свечению устанавливается тяжелая степень заболевания, например морщинистой мозаикой, дающей реакцию, близкую к некрогеннон. Од­нако определение Х-вируса в низкой концентрации не дает отчетливых результатов, что снижает ценность лю­минесцентного метода. Но отбор относительно более здоровых клубней, имеющих лучшую урожайность, в большинстве случаев возможен и может широко приме­няться. В наших опытах весь картофель с желтоватым оттен­ком имели в большинстве случаев повышенное содержание крахмала и меньший процент азотистых веществ. Наоборот, клубни с той или иной степенью голубого или синего свечения имели более низкое содержание крах­мала и повышенное количество азотистых веществ (П. И. Адьсмик, А. Л. Амбросов, 1960).

Возможности применения диагностических сывороток для точного определения вирусов известны уже давно. Начало этому методу положил Дворак (Dvorak, 1927), который показал, что фитопатогенные вирусы могут, 86 дать антигенными свойствами. В его исследованиях сыворотка, приготовленная путем введения сока больного картофеля в кровь кроликам, реагировала с соком больного растения сильнее, чем с соком здорового. Однако более точное доказательство возможности использования сывороток для диагностики фитопатогенных вирусов получено в опытах, проведенных Биль (Beale; 1928, 1929, 1931, 1934). Полученные ею сыворотки путем вытяжек из здорового табака, а также из табака, зараженного вирусом табачной мозаики, обладали некоторыми общи­ми антигенными свойствами. Но когда антисыворотка к инфекционному соку была полностью адсорбирована здоровым соком, она не теряла антигенное свойство по отношению к инфекционному соку и давала преципитацию с % ним. Сок других растений, содержащий вирус табачной мозаики, положительно реагировал с этой сывороткой, тогда как сок этих же растений, содержащий другие вирусы, давал отрицательную реакцию.

Таким образом, было установлено, что фитопатоген­ные вирусы при введении их в организм животных вызывают образование в крови антител, которые обладают способностью вступать в специфические реакции с вирусами, вводимыми в организм животным, т. е. обнаружена строгая специфичность: антитела вступают в реакцию только с тем вирусом, который вводился в кровь живот­ным. В завершение, следует отметить, что компания IPM Potato предоставляет возможность купить семенной картофель в Украине, на сегодняшний день есть в наличии более десяти сортов элитных голландских сортоф картофеля.

Для диагностики вирусных болезней применяются макро- и микроскопические, биологические, физические, химические, индикаторный и серологический методы. Наиболее распространены визуальный и серологический методы.

Визуальный метод – определение заболевания по внешним признакам (хлороз, деформации, чрезмерное ветвление, язвы, некрозы, мозаики) непосредственно в поле (скручивание листьев, полосчатая мозаика,бактериоз стеблей, бурая бактериальная гниль, аукуба – мозаика, морщинистая мозаика, столбур). Этот метод часто не дает надежных результатов при определении вирусов Х,S,M,A, вызывающих слабозаметные симптомы или находящихся в латентном состоянии.

Эффективность визуального метода оценки выше, если учитывать комплекс основных и второстепенных признаков в динамике. Например, слабые признаки обыкновенной мозаики лучше заметны на молодых растениях до цветения, затем они ослабевают или исчезают; закручивание листьев сильно проявляется во время бутонизации, позднее исчезает; признаки полосчатой мозаики проявляются после цветения и усиливаются с возрастом растений.

Наиболее типичные проявления вирусной инфекции на картофеле - мозаики, деформации, хлорозы, некрозы, желтая мозаика.

При тяжелых формах вирусных болезней отмечаются следующие признаки.

Для морщинистой мозаики (вирус У, часто – вместе с вирусами Х,S и А) характерны мозаичность и морщинистость листьев, торможение роста жилок долей в длину, края листьев загибаются книзу, на листьях – некрозы, нижние листья засыхают.

При полосчатой мозаике (чаще вирус У) обнаруживаются темные штрихи (некрозы) и пятна на нижней стороне листа, а также на черешках листьев и стеблях.

При закручивании листьев (вирус М) проявляются мозаичность, искривления и волнистость верхних листьев, края их долей загнуты вверх или доли слегка сложены вдоль средней жилки. Признаки болезни хорошо различаются только на молодых растениях.

Складчатая мозаика (вирус А) характеризуется разнообразными деформациями долей листа, часто сопровождающимися мозаичностью.

К группе желтух относится скручивание листьев (вирус L): нижние листья скручиваются в трубочки, становятся жесткими и шуршат, что особенно заметно во время цветения.

Крапчатость и обыкновенная мозаика (вирусы Х и S) проявляются на листьях в виде размытых светлых пятен различной величины, иногда наблюдается слабая деформация листьев.

Для выявления поражения картофельного растения вирусом скручивания листьев применим гистохимический анализ (выявляются патологические изменения в структуре клеток и тканей, биохимическом составе растений). Во флоэме стебля отмечается отмирание клеток (некроз), а в ситовидных трубках клубней – накопление полисахарида каллозы, выявляемое по окрашиванию тканей фуксином и резорцином.

Серологический метод – выявление скрытой инфекции с помощью диагностических сывороток. Основан на антигенных свойствах вирусов: при смешивании диагностических сывороток с соком проверяемых растений, листьев, клубней, ростков, вытяжек из них, семян в случае их зараженности одним или несколькими вирусами наблюдается хлопьевидный осадок. Метод широко применяется в первичном семеноводстве и селекции картофеля. Дает возможность выявить растения, зараженные латентными формами вирусов Х,S, М,У,А и скручивания листьев. Оптимальные сроки анализа для вирусов Х и М – во время бутонизации, вируса У – через 20-25 суток после всходов, вируса S – во время цветения. Серологическую оценку рекомендуется проводить не менее 2х раз. Для этого у полевых растений отбирают концевые доли 3-х полностью развитых листьев (верхнего, среднего и нижнего) и выдерживают при t 3-5 0 С не менее 2 ч, а при анализе растений, полученных из глазков в теплице, берут 2-3 листа целиком с верхней частью стебля. Для получения более достоверных серологических реакций следует: химические обработки посевов, подлежащих проверке, прекращать за 2-3 недели до начала анализов; проверять только молодые растения; отбирать листья с разных ярусов; брать сок из свежесорванных листьев; между отжатием сока и смешиванием его с сывороткой не допускать перерыва более 30 мин; анализы проводить при t 18…22 0 C; смешанные капли выдерживать не менее 20 мин.

Разновидность этого метода – иммуноферментный анализ ,основанный на использовании сывороток, глобулины которых соединены с ферментом (Элиза – тест). Вначале материал проверяют с помощью капельного серологического, индикаторного и других методов и только после этого для окончательной проверки используют данный метод.

Сущность иммуноферментного анализа заключается в следующем: на стадии выделения иммуноглобулинов добавляют небольшое количество фермента пероксидазы или кислой фосфатазы, что позволяет резко повысить чувствительность метода благодаря цветной реакции. При этом дается не только качественная характеристика , но и количественная. В настоящее время освоены методы получения конъюгата (иммуноглобулины, меченые указанными выше ферментами) для выявления вирусов Х,У, S, М.

Среди модификаций ИФА предпочтение отдается Сэндвич – методу. Им можно одновременно определить растения на зараженность Х,S, М,У, F,L – вирусами.

Оборудование для ИФА: автоматические пипетки от 50 до 200 мкл, полистироловые пластины с 96 лунками; фотометр, холодильник на -20 0 С, термостат на +37 0 С, сушильный шкаф, диагностические наборы на вирусы, которые заказывают в НИИКХ. Анализ проводят при t 18…25 0 С. Весь процесс определения длится 1,5 дня и состоит из следующих этапов:

1. Нанесение антител. Специфические антитела разбавляют в буфере и наливают по 100 мкл (0,1 мл) в лунки платы, накрывают крышкой и инкубируют в течение ночи при + 4 0 или 2 часа при + 37 0 С в термостате.

Промывка. Раствор удаляют из платы. Для этого нужно резко перевернуть плату и вытряхнуть содержимое. Промывают лунки 3 раза промывочным буфером. Избыточную влагу удаляют из лунок фильтровальной бумагой.

2. Нанесение анализируемых образцов. Буфером экстрагируют сок из растения картофеля и наливают по 0,1 мл суспензии исследуемого материала, а также контрольные растворы в лунки платы. Закрывают плату крышкой и инкубируют в течение ночи при + 4 0 С или 1 ч при + 37 0 С.

В качестве отрицательного контроля используют сок листьев или ростков заведомо здоровых растений и клубней или вносят в лунку вместо него буфер для проб и коньюгата в объеме не больше 0,1 мл ( во избежание появления неспецифической реакции).

При взятии проб необходима тщательная промывка проточной водой инструментов и посуды с последующей дезинфекцией.

3. Нанесение коньюгата. Наливают в лунки по 0,1 мл рабочего раствора коньюгата (специфическое антитело, меченое ферментом), накрывают плату крышкой, инкубируют 1 ч при +37 0 С. Промывку проводят аналогично п.1.

4. Проведение ферментативной реакции. Наливают по 0,1 мл субстрата и инкубируют при комнатной t 0 в течение 30…40 мин для окрашивания.

Оценка результатов. Наличие или отсутствие вируса может быть определено визуально или спектрофотометрически. При визуальной оценке, дающей информацию типа “да” “или нет”, интенсивность окраски в лунках с анализируемыми пробами сравнивают с интенсивностью окраски в лунках с отрицательным контролем. Результаты анализа можно фиксировать условными обозначениями: - - вирус отсутствует; + - материал заражен; ++- материал сильно заражен.

Антитела, нанесенные на планшет и высушенные на воздухе, рекомендуется хранить при – 20 0 С. В этих условиях они в течение нескольких месяцев не теряют способности взаимодействовать с вирусом.

Контроль пробирочных растений методом Элиза – теста (ИФА) осуществляют при черенковании растений.

Метод электронной микроскропии. Объект, приготовленный для просмотра на электронном микроскопе, должен быть монтирован на очень тонких (толщиной 20 нм) пленках формваровых или коллодиевых.

Для получения пленки готовый коллодий дополнительно высушивают в вакууме и растворяют в амилацетате (1-1,5 % раствор).

На сетки (диски 3 мм с отверстиями, изготовленные из меди) наносят плёнку.

Для нанесения объекта на сетку с пленкой готовят предметное стекло с наклеенной тонкой полоской пластыря посередине, по обе стороны которого по краям слегка прикрепляют по 10 сеток с пленкой.

Край исследуемого листа отрезают лезвием и место среза погружают на 1-2 сек. в каплю дистиллированной воды, помещенную на сетку с пленкой. Каждый новый срез делают чистым лезвием. После высыхания и напыления препарат готов для просмотра.

Контрастирование напылением производят в вакуумной установке. Для достоверности готовят по два препарата исследуемого объекта и просматривают по 10 полей каждого препарата. Для напыления применяют металлы. Препараты просматривают при увеличении в 40-60 тыс. раз.

Метод индексации. Для выявления вирусных болезней в зимний период применяют метод индексации, т.е. определение зараженности клубней вирусами по их частям (индексам). Он основан на способности некоторых вирусов давать внешнее проявление заболевания за короткое время в условиях повышенной температуры. Для чего в зимний период после естественного начала прорастания клубней или искусственного прерывания периода покоя путем обработки стимуляторами в верхушечной части клубня вырезают глазок (индекс) вместе с мякотью диаметром до 1,5 см. Индексы высаживают в горшочки с торфокрошкой и выращивают из них растения в условиях теплиц. При этом номер каждого глазка (индекса) такой, как у клона, из которого взят клубень для проведения анализа.

При высоте растений 18-20 см растения тщательно осматривают на выявление внешних признаков заболеваний. Все больные растения бракуют и записывают в журнал их номера. Внешне здоровые проверяют на выявление скрытой инфекции серологическим или иммуноферментным методами. При анализе растений, полученных из глазков в теплице, берут целиком 2-3 листа с верхней части стебля. Все растения с положительной реакцией бракуют, а их номера отмечают в журнале. По данным визуальной и серологической оценок растений, выращенных из глазков (индексов), проводят браковку клонов. По результатам оценки бракуют целиком все клоны, номера которых совпадают с номерами выбракованных растений в теплице.

Задания для самостоятельной работы.

1. Ознакомиться с методикой и техникой визуальной диагностики вирусных болезней, учитываемых в семеноводстве картофеля, и получить практические навыки.

2. Ознакомиться с методикой и техникой проведения анализов по диагностике болезней в скрытой форме и получить практические навыки.

3. Получить практические навыки по освоению методов иммуноферментного анализа и метода индексации.

Картофель во всем мире является вторым хлебом и считается одним из важнейщих сельскохозяйственных продуктов для употребления в пищу человечеством. Среди изученных до ХХ в. из 400 видов фитопатогенных вирусов [1] около 20 видов вирусов [2, 3] поражают картофель. Исследования, проведенные в последующие годы, показали, что картофель поражается более 52 видами фитопатогенных вирусов [1, 4]. К ним относятся такие вирусы, как вирус скручивания листьев картофеля – ВСЛК (potato leaf roll virus, PLRV); Y вирус картофеля – YВК (Potato virus Y, PVY); X вирус картофеля – ХВК (Potato virus X, PVX); S вирус картофеля – SBK (Potato virus S, PVS); M вирус картофеля – МВК (Potato virus M, PVM) [5]. Каждая из них имеет своеобразный симптом поражения: ВСЛК вызывает симптом скручивания листьев картофеля, YВК – мозаичное скручивание, а ХВК – крапчатую мозаику. Признаки поражения проявляются в различных симптомах в зависимости от вида вируса, экологических условий а также от сорта картофеля [4, 6]. Из перечисленных вирусов ВСЛК снижает урожайность картофеля до 80 %, а в случае ХВК поражение, не проявляя видимых симптомов из года в год, через клубеньки передаётся следующему поколению, урожайность снижается до 10–25 %, а при смешанных инфекциях (S + X + A), снижая урожайность до 40 %, приносит большой ущерб сельскому хозяйству [7, 8].

ВСЛК относится к семейству Luteoviridae, роду Polerovirus, форма вириона сферическая, передаётся с помощью Myzus persicae, во всем мире распространена во всех хозяйствах, выращивающих картофель, и является вирусом, приносящим большой вред картофелеводству [4, 8].

ХВК относится к семейству Alphaflexiviridae, роду Potexvirus, является одним из широко распространённых вирусов во всех континентах, легко передаётся механически, контактным путём, а также почвенными грабами [1]. Является одним из фитопатогенных вирусов, приносящим большой вред картофелеводству. Основой разработки мер борьбы против этого вируса является изучение его распространения в определённых регионах и определение его естественных растений-резерваторов в этом регионе. Исследования, проведённые в последние годы, указывают на широкое распространение этих вирусных заболеваний картофеля в Узбекистане [9].

Исходя из вышеизложенного, целью исследований является изучение распространения и естественных растений-резерваторов ВСЛК и ХВК в некоторых районах Самаркандской области.

Материалы и методы исследования

Основные материалы для проведения ИФА: антитела к ХВК (IgG), конъюгат (IgG + фермент), полистироловые платы и химические реактивы, полученные из организaции Internotional Centre of Potato (CIP). Для выявления вируса методом ИФА, первоначально листья картофеля с симптомами поражения и листья индикаторных растений, зараженных с препаратом ХВК, который очищен из смещенных инфекций, были собраны в отдельные полиэтиленовые мешочки. Затем, добавляя фосфатный буфер (Ф.Б.) в соотношении 1:1 (состав для 1 литра – NaСl, KH2PO4, Na2HPO4, KCl, NaN3, рН-7,4), их гомогенизировали и приготовили гомогенат. В полистироловые платы иммобилизировали АТ вируса (IgG) в течение 5–6 ч при 37 °С, не связавшиеся антитела (АТ) смыли с помощью Ф.Б. с твином (на 1 литр Ф.Б. добавили 20 капель (0,5 мл) твина PBS-T). Затем налили гомогенат антигена (АГ), приготовленный из листьев определяемого растения, и инкубировали в течение 3–4 часов при 37 °С. Не связавшиеся АГ смыли Ф.Б. с твином. Затем в полистироловые платы налили конъюгат (IgG + фермент), поместили их в полиэтиленовые мешочки и хранили 3–4 ч при 37 °С. Не связавшиеся конъюгаты смыли Ф.Б. с твином. Затем в каждую полистироловую плату налили по 80 мкл субстрата (состав: диэтаноламин, 37 % HCl, дистиллированная вода и таблетки субстрата – р-нитрофенилфосфат) и наблюдали за проявлением реакции. Реакция проявлялась в течение 30–60 мин в виде изменения окраски. Результаты зафиксировались.

Результаты исследования и их обсуждение

Похожие темы научных работ по промышленным биотехнологиям , автор научной работы — Дрыгин Ю. Ф., Чирков С. Н., Кондакова О. А., Зиновкин Р. А., Иванов П. А.

ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ и ВИРОИДНОЙ ИНФЕКЦИЙ КАРТОФЕЛЯ

Ю.Ф.ДРЫГИН С.Н. ЧИРКОВ О.А. КОНДАКОВА Р.А. ЗИНОВКИН П.А. ИВАНОВ А. Н. БЛИНЦОВ ЕС. ТАВРЮ ШИНА

Московский государственный университет А.В. ЖЕРДЕВ НА. БЫЗОВА Б. Б. ДЗАНТИЕВ

Институт биохимии им. А.Н. Баха И.Г. АТАБЕКОВ

Московский государственный университет

Одна из главных причин хронически низкой урожайности картофеля в РФ — практически повсеместное использование семенного материала, зараженного вирусными, вироидными и бактериальными патогенами. Контроль его качества, начиная с элиты и при последующем репродуцировании недостаточно эффективен, поскольку проводится только путем визуальной оценки. Формирование рынка семенного картофеля в России вызвало необходимость коренного улучшения контроля его качества и сертификации. На сегодняшний день система сертификации оригинального (предбазисного) семенного материала предусматривает его обязательную лабораторную проверку на зараженность возбудителями наиболее вредоносных вирусных и бактериальных болезней в испытательных лабораториях, аккредитованных для выполнения такого рода работ. Диагностика вирусных и ви-роидных заболеваний, помимо сертификации семян, в массовых масштабах применяется для контроля процесса оздоровления растений, фитосанитарного мониторинга посевов и карантинной проверки импортируемого посадочного материала.

Современные методы лабораторной диагностики основаны на высокой специфичности молекулярного взаимодействия антител с антигеном или нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) между собой. Высокая их чувствительность обеспечивается усилением (в миллионы раз) сигнала взаимодействия молекул специальными биохимическими системами (ферментными в ИФА и множительными в ПЦР). Разработано несколько технологий молекулярной диагностики вирусных и вироидных заболеваний картофеля, которые применяются или могут быть использованы в элитном семеноводстве.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Сегодня в странах с развитым картофелеводством, в том числе и в России, лабораторная диагностика вирусной инфекции семенного материала осуществляется в ос-

новном с помощью ИФА. Этот метод обладает высокой специфичностью и чувствительностью, позволяющей количественно определять вирусы в экстракте вплоть до концентрации 1 нг/мл. Важнейшее его достоинство — высокая производительность, которая дает возможность проанализировать сотни образцов за короткое время (2 суток). Иммуноспе-цифические реагенты, диагностические наборы и приборы для выполнения ИФА производят многие фирмы и широко представлены на рынке.

Метод иммунохроматографии. Для большинства практически значимых вирусов и вироида картофеля разработаны методы молекулярной диагностики, основанные на выявлении вирус-специфического белка (иммунохимические методы) или вирусных нуклеиновых кислот [ПЦР, РНК(ДНК) зонды]. Они характеризуются исключительно высокой чувствительностью, которая позволяет выявлять минимальные количества вируса. Как уже отмечалось, инструментальные методы анализа, согласно действующей системе сертификации, надлежит использовать для лабораторной проверки оригинального семенного материала (микрорастения, мини-клубни, первое полевое поколение из мини-клубней и супер-суперэлита). В то же время, они достаточно трудоемки, сложны, занимают много времени, требуют высококвалифицированного персонала и дорогостоящего оборудования, что ограничивает

иммунохроматографии — высокая чувствительность и скорость (исчисляемая минутами) анализа, простота подготовки образца и выполнения анализа, не требующего лабораторного оборудования или реагентов. В результате совместной работы кафедры вирусологии биологического факультета МГУ им. М.ВЛомоносо-ва и лаборатории иммунобио-химиии Института биохимии РАН были разработаны тест-полоски для экспресс-анали-женного картофеля сорта за вирусов X и У картофеля. С Невский; В — экстракт из

Рис. 1. Определение вируса У картофеля методом иммунохроматографии: А — препарат вируса У картофеля (5 мкг/мл); Б — экстракт из листьев зара-

листьев здорового растения картофеля; Г— экстракт из листьев картофеля сорта Невский, зараженного ХВК. Аналитическая область отмечена стрелкой.

альную оценку. Кроме того, этот метод можно применять для экспресс-анализа импортируемого картофеля на карантинные и другие особо вредоносные вирусы, а также в личных, подсобных, мелких фермерских хозяйствах, в которых сегодня сосредоточено основное производство картофеля в России.

МГА-ИФА технология. На сегодняшний день в ряде регионов РФ наиболее распространенное и экономически самое опасное заболевание, вызываемое вироидом веретеновидности клубней картофеля (ВВКК) [ 13]. ВВКК — это небольшая (около 360 нуклеотидов) кольцевая молекула РНК с сильно развитой вторичной структурой [14]. Вироиды не кодируют белков и поэтому не определяются с помощью им-муноферментного анализа. Их можно обнаружить методами, основанными на молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот. Обычно диагностические фирмы для детекции вироидов используют метод молекулярной гибридизации с кРНК-зондами, меченными дигоксигенином, или ПЦР.

Мы разработали технологию МГА-ИФА (рис. 2), в которой для выявления ВВКК используют кДНК-

их помощью указанные патогенны определяются в экстракте из зараженного растения картофеля в концентрации до 0,2 мкг/мл. Результат анализа можно получить через 5 мин.

По нашему мнению, наиболее эффективно тест-полоски можно использовать, например, при сертификации элитного и репродукционного семенного материала, что будет существенно дополнять визу-

Рис. 2. Схема технологии МГА-ИФА (на примере диагностики ВВКК)

зонды, меченные хлордиэтилентриаминоплатиной хлористой — (диен)Р1. ДНК-зонд синтезируют на основе рекомбинантной плазмиды, содержащей вставку кДНК длиной 300 и более нуклеотидов (фрагмент ДНК, комплементарный РНК вироида и способный с ней специфически гибридизоваться).

Рекомбинантные ДНК получают методами генной инженерии, клонируют в бактериях и выделяют в препаративных количествах из размноженной бактериальной массы.

Для получения зонда мы метим рекомбинантную плазмиду комплексным соединением платины — (диен) [4]. Выбор этой метки вызван чрезвычайной простотой процедуры мечения, заключающейся в обыч-

ном смешивании ДНК с (диен)Р1, и количественным их связыванием (таким образом отпадает необходимость дополнительной очистки зонда). При этом наличие метки практически не отражается на специфической гибридизации кДНК-зонда с вироидной РНК. Еще одно важное преимущество диен-платиновой метки — высокая иммуногенность ее комплекса с ДНК, что позволяет получать аффинные антитела с высокой специфичностью, узнающие любую ДНК, меченную (диен)Р1.

Технология МГА-ИФА включает несколько этапов. Она начинается с подготовки образца к анализу, а именно, с депротеинизаци и выделения нуклеиновых кислот клеточного экстракта.

Сегодня для выделения нуклеиновых кислот из зараженных растений применяют токсичные реагенты (фенол, хлороформ и гуанидинизотиоцианат). Мы разработали новый метод, в котором оно осуществляется с использованием водорастворимого нетоксичного хаотропного агента — НТХА (находится на стадии патентования) и дешевого доступного сорбента, что заметно упрощает подготовку образцов к анализу. Выходы РНК, а также их спектральные и электрофоретические характеристики при этом соответствуют высокоочищенным вирусным РНК и идентичны для препаратов, полученных новым методом и путем фенольной депротеинизации (рис. 3).

РНК ХВК РНК втм

Рис. 4. Определение ВВКК с использованием диен-платино-вого ДНК-зонда в препаратах вироидной РНК (ряды 2-4), полученных из листовой ткани картофеля (ряды / и 5 — из здоровых растений); колонка А — фенольным методом; В— гунидин-тиоцианатным методом с последующей сорбцией РНК на силикагель; С — с применением НТХА.

Сравнение результатов анализов методом МГА-ИФА препаратов, полученных разными способами (фенольная депротеинизация с использованием гуани-динтиоцианата [9], сорбция на силикагель [11] и с помощью НТХА) показало, что эффективность экстракции и определения вироидной РНК, выделенной из одинакового количества листовой ткани картофеля, совпадает (рис. 4).

Технология МГА-ИФА позволяет выявить до 100 молекул РНК вироида на клетку [3, 5]. Последние несколько лет она успешно используется для практической диагностики вироида в элитном семеноводстве картофеля РФ.

МГА-ИФА технологию, первоначально разрабатывавшуюся для диагностики вироида, можно применять для определения вирусов картофеля (рис. 5).

Количество рекомбинантной Количество суммарной

плазмиды в положительном контроле (1), ПГ РНК в образцах (2-5), иг

Рис. 3. Сравнение электрофоретической подвижности препаратов РНК ВТМ и РНК ХВК, выделенных из очищенных вирусов с помощью НТХА (/ и 3) и методом фенольной депротеинизации (2 и 4).

Рис. 5. Определение вируса X картофеля (ХВК) технологией МГА-ИФА 1 — рекомбинантная плазмида риС-19, содержащая вставку кДНК ХВК, пг. 2-5 — препараты суммарной РНК, полученные из здоровых (2, 4) и зараженных ХВК (3, 5) растений картофеля (сорт Невский) фенольным методом (4, 5) и с помощью НТХА (2, 3). Препараты суммарной РНК из анализируемых пробирочных растений картофеля наносили на нитратцеллюлозную мембрану и фиксировали облучением УФ-светом.

На сегодняшний день получены кДНК-копии РНК вирусов: X, У, А, Б, М, аукуба-мозаики картофеля, ВСЛК, ВМВК. Созданы и клонированы рекомбинантные плазмиды со вставками их кДНК.

Следует отметить, что МГА-ИФА технология имеет ряд важных преимуществ перед традиционной диагностикой вирусов с помощью серологических методов. В частности, она не требует получения вирусного антигена, иммунизации животных для получения специфических к каждому вирусу антител, так как их детекция осуществляется в конечном итоге с помощью универсальных антител к (диен)Р1>ДНК.

Технология ОТ-ПЦР. Для проверки на зараженность вирусами и вироидом коллекционных сорто-образцов необходима предельно высокая чувствительность определения РНК патогена с большой степенью надежности. Это приобретает особую важность в связи с началом работ по созданию в РФ ге-нобанка здоровых сортов картофеля [6]. Один из наиболее чувствительных методов обнаружения молекул нуклеиновых кислот — полимеразная цепная реакция (ПЦР или ОТ-ПЦР), которая позволяет размножить копию молекулы нуклеиновой кислоты патогена в анализируемом препарате в десятки миллионов раз. Его недостатки — высокая стоимость и трудность идентификации размноженной вирусной ДНК из-за присутствия артефактных зон.

Для оптимизации метода ОТ-ПЦР исследование проводили на модельной системе с высокоочшцен-ными образцами РНК ХВК, а затем на тотальных препаратах нуклеиновых кислот, полученных из инфицированных и здоровых пробирочных растений. В ка-

честве затравок для реакций обратной транскрипции (ОТ) РНК ХВК использовали комбинацию олигонуклеотидов РУХ5755+/РУХ6105-. В этом случае нам уда-лось детектировать до 1 фг вирусной РНК, что соответствует уровню 300 молекул вирусной РНК для реакции ОТ и всего лишь 30 молекул кДНК в полимеразной цепной реакции (рис. 6).

рядок, но ее достаточно для детекции с помощью комбинированной технологии ОТ-ПЦР — МГА-ИФА одной молекулы РНК фитопатогена в анализируемой пробе.

Для сравнения чувствительности используемых технологий молекулярной диагностики препараты РНК, полученные с помощью НТХА, амплифицировали по технологии ОТ-ПЦР и продукты анализировали по флуоресценции в геле с помщью МГА-ИФА и технологии ОТ-ПЦР — МГА-ИФА (рис. 8). Результаты исследований показывают, что по чувствительности детекции патогена перечисленные методы можно расположить следующим образом: МГА-ИФА Не можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

ка вирусных и вироидных инфекций достигла пре- Авторы выражают глубокую благодарность колле-

дельной чувствительности, когда в соответствующих гам из ВНИИ картофельного хозяйства имЛГЛорха

условиях реальным становится определение единич- и ВНИИ фитопатологии за помощь в постановке этого

ных молекул фитопатогена в целом растительном исследования.

организме. Дальнейшее их совершенствование будет Работа поддержана грантом РФФИ N2 06-04-

определяться техническим упрощением каждой ста- 08290.

2. Бобкова А.Ф., Блинцов А.Н, Чирков С.Н. (2003). Пиротест — метод иммуноферментного анализа вирусов картофеля. Аграрная Россия, 3:23 — 27.

3. Дрыгин Ю.Ф., Мусин С.М., Кондакова ОА., Савенков Е.И., Соломатин С.В.,Можаева К.А., Атабеков И.Г. (1996), Молекулярная диагностика зараженности оздоровленных сортообразцов картофеля Российской Федерации вироидом веретеновидности клубней. Доклады РАСХН 6:24-25.

4. Киселева В.И., Турчинский М.Ф., Колесник Т.Б., Поверенный А. М. (1994). Использование диэтилентриаминхлорплатины в гибридиза-ционном анализе специфических последовательностей нуклеиновых кислот. Биоорган, хим. 20:14-20.

5. Кондакова, О А., Дрыгин, Ю.Ф. (1999). Диагностика вироидного заболевания картофеля зондами (диен)Р1-ДНК. Биотехнология 4: 83-90.

6. Симаков ЕА., и др. О совершенствовании научного обеспечения производства оригинального, элитного и репродукционного семенного картофеля в России (2004). М., ВНИИКХ.

7. Чирков С.Н., Новиков В.К., Бобкова А.Ф., Атабеков И.Г. (2000). Пиротест — усовершенствованный вариант иммуноферментного анализа вирусов картофеля. Защита и карантин растений, 12:15-16

9. Chomczynski, P. and N. Sacchi (1987). Single-step method of RNA isolation by acidguanidinium thiocyonate-phenol-chloro/orm extraction. Anal Biochem. 162: 156—159.

10. Clark, M.F. and A. N Adams (1977). Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection ofplant viruses. J. gen. Virol. 34:475—483.

11. Malinowski, T. (1996). In: H.-WDehne, GAdam. etal. (Eds.) Developments in Plant Pathology, vol.ll, KluwerAcad. Publishers, .445-448.

12. Mizenina, О. А., О. V. Borisova, V. К Novikov, O. A. Evtushenko, A. A. Baykov and J. G Atabekov (1991). Inorganic pyrophosphatase from E. coli as a label for the detection ofplant viruses by ELISA. J. Phytopathol. 133:278-288.

13. Mozhaeva, K.A., NVGirsova, N. V. and T.B. Kastalyeva (2002). Main causes of Potato Spindle Tuber Viroid distribution in seed potato in Russia in 1990s. J. Russ. Phytopath. Soc. 3: 39-42.

14. Semancik, J.S. Viroids and Viroidlike Pathogens (1987). (Semancik, J. S., Ed.). CRC Press, Boca Raton, FL 127-160.

15. Surguchova N., Chirkov S., Atabekov J. (1998) ELISA-test bei Nepoviren mit einem neuen Enzym — einer anorganischen Pyrophosphatase aus Escherichia coli. Arch.Phytopath.Pflanz., 31: 535-541.

ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРИМЕНЕНИЯ УДОБРЕНИЙ В КАРТОФЕЛЕВОДСТВЕ РОССИИ

А. В. КОРШУНОВ Л.С. ФЕДОТОВА

ВНИИ картофельного хозяйства им. А.Г.Лорха

НИИ агрохимии им. Д.Н.Прянишникова

В российском земледелии существует неадекватное суждение об оценке экологических последствий химизации сельского хозяйства, которое сильно преувеличено в сторону ее издержек.

Конечно, экологический риск необдуманного применения средств химизации существует. Однако рациональное использование удобрений не представляет существенной опасности для окружающей среды. Гораздо хуже, если элементы минерального питания не

будут вноситься или их дозы окажутся необоснованно малы. Даже сторонники органобиологического земледелия признают необходимость минеральных удобрений для восполнения выноса питательных элементов с урожаями сельскохозяйственных культур. Поэтому для современного картофелеводства решение экологических проблем применения агрохимикатов заключается в оптимизации их доз, а не в отказе или минимальном применении. Именно рациональные дозы минеральных удобрений, химическая и биологическая мелиорация в совокупности с оптимальной агротехникой и севооборотами, адаптированными к почвенно-климатическим условиям, способствуют поддержанию устойчивости и высокой продуктивности агроценозов.

Известный немецкий ученый в области биологического растениеводства Г.Кант [2] допускает разумное использование минеральных удобрений и пестицидов. По его утверждению, агроландшафт выпол-