Молекулярно генетические исследования на гепатит

Молекулярно-генетическое исследование для определения генотипа вируса гепатита С.

Применяемый набор реагентов может быть использован для диагностики вируса гепатита С и наиболее распространенных на территории России генотипов HCV (1a, 1b, 2, 3a и 4) in vitro.

Вирус гепатита С (ВГС).

Hepatitis C Virus (HCV) Genotyping, HCV Subtype.

Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией в режиме реального времени.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

• Не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Вирус гепатита С (ВГС) способен поражать клетки печени, а также некоторые клетки крови (нейтрофилы, моноциты, В-лимфоциты). В основном инфекция передается через кровь (препараты для переливания элементов крови и плазмы, донорские органы, нестерильные шприцы, иглы, инструменты), реже вероятно заражение половым путем.

Острый вирусный гепатит, как правило, протекает бессимптомно и в большинстве случаев остается невыявленным. У 60-85 % инфицированных развивается хроническая инфекция, которая увеличивает риск развития цирроза, печеночной недостаточности и гепатоцеллюлярной карциномы. За свое скрытое, но разрушительное действие инфекция получила неофициальное название "ласковый убийца".

ВГС обладает наибольшей вариабельностью среди всех возбудителей вирусных гепатитов и благодаря высокой мутационной активности способен избегать воздействия защитных механизмов иммунной системы. Геномы вируса значительно отличаются в разных странах мира и имеют различную чувствительность к препаратам интерферонов.

Существует 6 основных генотипов вируса гепатита С и около 500 субтипов. Наиболее распространен в мире генотип 1 (40-80 %). 1а тип часто выявляется в США, 1b характерен для Западной Европы и Южной Азии. Генотип 2 встречается с частотой 10-40 %. Генотип 3 распространен в Шотландии, Австралии, Индии и Пакистане. ВГС 4 типа характерен для Средней Азии и Северной Африки, генотип 5 – для Южной Африки, 6 – для некоторых стран Азии. В России преобладает генотип 1b, далее с убывающей частотой - 3, 1a, 2, в США – 1a/1b, 2b, и 3a.

Противовирусная терапия, направленная на подавление прогрессирования заболевания, в редких случаях может ускорить развитие осложнений со стороны печени. Это происходит при неправильной оценке клинических и лабораторных показателей. Генотипирование РНК вируса гепатита С позволяет спрогнозировать эффект от планируемой терапии.

Генотип 1 хуже поддается лечению, чем генотипы 2 и 3. Кроме того, биопсию печени важнее провести именно при генотипе 1. Повышенные дозы препаратов интерферона рекомендованы для пациентов с 1-м и 4-м генотипами. Курс терапии у таких пациентов должен быть продлен до 48 недель даже при отсутствии вируса в крови более 24 недель. В случае успешности лечения, которая подтверждается снижением вирусной нагрузки крови ( Для чего используется исследование?

• Чтобы определить необходимость лечения и спрогнозировать течение заболевания.
• Для планирования длительности противовирусной терапии и дозировки лекарств.
• Для прогнозирования эффективности лечения.
• Для принятия решения о биопсии печени.

Когда назначается исследование?

• При обнаружении РНК вируса гепатита С и планировании противовирусной терапии.

Что означают результаты?

Референсные значения: РНК HCV не обнаружена.

При обнаружении указывается генотип:

Результат

Значение

Очень высокий риск хронизации инфекции и развития тяжелых осложнений. Необходимо лечение более высокими дозами интерферона в течение 48 недель.

В большинстве случаев в течение 24 недель достигается планируемый терапевтический эффект.

Труднее поддается лечению, требует доз препаратов, отличных от применяемых при терапии с генотипами 2 или 3.

Что может влиять на результат?

• Генотип вируса гепатита С иногда не выявляется при концентрации вируса в крови менее 1,25*10^3 МЕ/мл.



• Решение о длительности терапии, необходимой дозе препаратов и прекращении лечения может принять только лечащий врач на основании биохимических анализов функции печени, биопсии (при необходимости) и вирусной нагрузки.
• Существует вероятность повторного заражения вирусным гепатитом С другого генотипа из-за отсутствия перекрестного иммунного ответа и стойкого иммунитета.

Количественная ПЦР – молекулярно-биологический анализ, при котором подсчитывается количество генетического материала возбудителя в крови. Исследование на гепатит С (количественно) выполняется после подтверждения диагноза для определения вирусной нагрузки. Полимеразная цепная реакция характеризуется высокой специфичностью и чувствительностью. Поэтому анализ считается золотым стандартом в диагностике гепатита С.

Что такое количественный анализ на гепатит С

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – анализ, который основан на определении участков РНК или ДНК, специфичных для возбудителя инфекции. В качестве исследуемого материала чаще используется венозная кровь. Тест обладает высокой специфичностью, так как при исследовании плазмы выявляется генетический материал конкретного вируса.

Метод полимеразной цепной реакции впервые был запатентован в 1983 году Кэри Мюллисом. Внедрение в клиническую практику молекулярно-биологического анализа совершило переворот в диагностике бактериальных, грибковых и вирусных болезней.

ПЦР количественный при гепатите С – исследование, при котором подсчитывается количество РНК ВГС (HCV RNA). По результатам определяют вирусную нагрузку, от которой зависят:

1. дозировка медикаментов;
2. продолжительность противовирусной терапии (ПВТ);
3. вероятность осложнений;
4. успешность лечения.

РНК вируса гепатита С (ВГС) обнаруживается спустя 10-12 суток после заражения, когда до первых симптомов еще далеко. Поэтому исследование применяется для ранней диагностики HCV-инфекции.

Когда нужно сдать тест

Молекулярно-биологический анализ назначается при положительном результате скринингового обследования на гепатит – ИФА и качественной ПЦР. Исследование применяется для:

• подтверждения диагноза;

• определения уровня виремии (вирусной нагрузки);

• прогнозирования течения болезни;

• оценки результативности лечения;

• диспансерного обследования после ПВТ.

ПЦР-диагностика рекомендована всем людям с вирусным гепатитом. Точность исследования варьируется в пределах 97-99%, поэтому риск ложных результатов минимален.

Показания для анализа:

• обнаружение антител к вирусу гепатита С (anti-HCV);
• признаки воспаления печени;
• качественное выявление РНК ВГС;
• острый и вялотекущий гепатит;
• микст-гепатиты.

Количественный тест выполняется на всех этапах заболевания. Чтобы оценить результативность терапии, вирусную нагрузку определяют перед, во время и после ПВТ. Если уровень виремии высокий, увеличивается риск цирроза и рака печени. Поэтому для профилактики осложнений назначают антивирусные средства в больших дозах.

Подготовка и сдача крови

Количественный анализ ПЦР проводится в лабораторных условиях. Домашних тестов для выявления числа вирусов в крови не существует.

Объективность результатов зависит от правильности подготовки к исследованию. Чтобы снизить вероятность погрешностей, нужно:

1. сдавать венозную кровь натощак;
2. выполнять процедуру до 12 часов дня;
3. не есть за полсуток до визита в лабораторию;
4. отказаться от газированных напитков и кофе в день обследования.

Забор крови у женщин рекомендуется выполнять за 1-2 дня до менструации. В этот период иммунная защита ослабевает, поэтому сывороточная концентрация возбудителя максимальная.

За 5-7 суток до анализа исключают алкогольные напитки, жирную и острую пищу. Врачи не советуют курить за 2-3 часа до забора крови.

Точность ПЦР-диагностики на гепатит С во многом зависит от правильности сбора и транспортировки биоматериала:

• забор крови осуществляют в условиях процедурного кабинета;
• пользуются только одноразовыми стерильными шприцами;
• для исключения заражения биоматериала соблюдают правила асептики и антисептики.

Контейнер с пробой маркируют в присутствии пациента, после чего отправляют в лабораторию.

Как выполняют подсчет вирионов

Во время количественной ПЦР возбудителя идентифицируют путем обнаружения РНК в плазме крови. Это возможно за счет удвоения участка нуклеиновой кислоты вируса в среде фермента РНК-полимеразы. Во время анализа копируются (амплифицируются) только определенные участки генома.

Подсчет количества РНК вируса гепатита осуществляют в 3 этапа:

1. Выделение генетического материала. Чтобы очистить вирусную РНК от крови и белковых включений, биоматериал пропускают через сорбенты, отмывают в растворе, центрифугируют, а потом обезвоживают. В результате остается осадок с вирусными частицами, который растворяют в специальной жидкости. На выходе получается РНК вируса гепатита в элюенте.
2. Амплификация. Анализ выполняется в приборе-термостате, в котором периодически подогревают и охлаждают пробирки. При одном исследовании делают до 35 циклов, состоящих из 3 фаз: денатурация (разрушение) РНК, отжиг и синтез нуклеиновых кислот матричной цепи. За несколько десятков циклов в пробирке образуется множество фрагментов РНК, достаточное для подсчета количества генетического материала.
3. Электрофорез. Пробирку с копиями вируса гепатита помещают в агарозный гель. Образец подключают к источнику тока, под действием которого фрагменты РНК разделяются. Благодаря электрофорезу копии нуклеиновых кислот становятся различимыми в свете ультрафиолета. Затем с применением специального оборудования подсчитывают количество РНК вируса.

В настоящее время для определения уровня виремии все чаще проводят ПЦР-диагностику в реальном времени (Real-Time PCR). В отличие от стандартного анализа, в образец крови вводят раствор с флуоресцентными метками. Благодаря этому удается подсчитать количество амплифицированной РНК ВГС в реальном времени после каждого цикла.

Результаты количественного определения РНК

Количественная оценка позволяет судить об уровне виремии, то есть активности вирусного процесса. С учетом результатов анализа гепатолог подбирает дозу лекарства, определяет продолжительность терапии гепатита С.

Расшифровка количественного анализа на гепатит С:

Данные количественной ПЦР, в МЕ/мл	Трактовка
не обнаружено	вариант нормы, вируса в крови нет
менее 150	содержание РНК ниже линейного диапазона концентраций, минимальная вирусная нагрузка
150-3*10 4	низкий уровень виремии
от 3*10 4 до 8*10 5	средняя вирусная нагрузка
более 8*10 5	содержание РНК ВГС выше линейного диапазона концентраций

Вирусная нагрузка – важный показатель, который учитывается при разработке схемы терапии. Если уровень виремии минимальный или низкий, прогноз течения гепатита и результативности ПВТ благоприятный. Ситуация ухудшается при средней и высокой вирусной нагрузке. Такие пациенты подвержены осложнениям – фиброзу, жировому гепатозу, циррозу.

Уровень виремии не отражает степень повреждения печеночной паренхимы или тяжесть течения гепатита. Чтобы определить серьезность изменений в печени, прибегают к инструментальному обследованию – фибросканированию, биопсии и гистологическому анализу.

Сколько по времени делается качественный и количественный анализ и примерная цена

Чтобы провести исследование на гепатит С (качественный и количественный ПЦР-анализ), посетите лабораторное отделение поликлиники, частную клинику или лабораторию. Стоимость диагностики в Москве зависит от:

1. типа анализируемого биоматериала;
2. чувствительности применяемой тест-системы;
3. количества определяемых инфекций.

Примерная стоимость лабораторного анализа

Тип анализа	Цена в рублях
забор крови	170-200
качественная ПЦР	750-1000
количественная ПЦР (реал-тайм)	3800-4000
генотипирование	1350-1400

Анализ ПЦР на гепатит С делается не более 3 часов. Забрать окончательные результаты можно уже в течение 1-2 суток.

Бывает ли ложный результат

Генетический материал возбудителя гепатита выявляется в крови спустя 1.5 недели после заражения. До этого периода содержание РНК ВГС в крови так мало, что ее нельзя обнаружить в лабораторных условиях. Для оценки вирусной нагрузки рекомендуется пользоваться высокочувствительными тест-системами: 150-1*10 8 МЕ/мл.

ПЦР-диагностика – исследование, достоверность результатов которого достигает 97-99%. Искажение данных возможно при:

1. игнорировании правил подготовки к исследованию;
2. нарушении требований антисептики;
3. несоблюдении методики анализа крови;
4. неправильном заборе и хранении биоматериала.

Перед обследованием пациент должен сообщить врачу о приеме медикаментов, так как их компоненты могут влиять на активность возбудителя и результаты исследования.

ПЦР-диагностика – высокоточное исследование, при котором определяют наличие и количество копий возбудителя инфекции. Получение ложноотрицательных результатов почти невозможно. Погрешности выявляются в единичных случаях при диагностике хронического гепатита вне обострения.

Молекулярно-генетические исследования в эпидемиологии вирусных гепатитов: достижения и перспективы

Вирусные гепатиты являются широко распространёнными инфекционными болезнями и остаются значимой проблемой здравоохранения во всем мире. Развитие молекулярно-генетических методов исследования позволило значительно расширить представления о биологии возбудителей этих инфекций. В статье описаны современные взгляды на генетическую классификацию вирусов гепатитов А и В, приводятся данные о распространенности их генотипов и субтипов в мире и в России. На примере возбудителей этих инфекций раскрываются возможности и перспективы использования молекулярно-генетических подходов для изучения характеристик эпидемического процесса вирусных гепатитов.

С развитием молекулярно-генетических методов и появлением возможности определять генетические характеристики возбудителей инфекционных болезней было положено начало новому направлению эпидемиологических исследований. Использование молекулярно-генетических методов позволяет идентифицировать возбудителя инфекции, более эффективно устанавливать связь между случаями инфицирования, определять факторы передачи возбудителя, проводить мониторинг географического распространения генетических вариантов возбудителя, выявлять генетические маркеры факторов вирулентности и идентифицировать факторы риска.

Вирусные гепатиты до настоящего времени остаются значимой проблемой здравоохранения как в России, так и в мире. По оценкам ВОЗ, в мире ежегодно регистрируется около 1,5 млн случаев гепатита А [1], а общее число заболевших может составлять десятки миллионов в год [2]. Число больных хроническими формами гепатита В в мире оценивается в 240 млн человек и около 600 тыс. человек в год умирают от острых форм инфекции и исходов хронического гепатита В [3]. В России в течение последних лет наблюдается неуклонное снижение заболеваемости гепатитом А, однако в 2012 г. ее показатель оставался достаточно высоким – 5,5 на 100 тыс. населения. Заболеваемость хроническими формами инфекции, вызванной вирусом гепатита В (ВГВ), в 2012 г. составляла 33,7 случаев на 100 тыс. населения и в 23,7 раза превышала заболеваемость острым гепатитом В. В настоящей статье на примере гепатитов А и В раскрываются современные возможности и перспективы использования молекулярно-генетических подходов к изучению эпидемического процесса вирусных гепатитов.

На основе гомологии нуклеотидных последовательностей региона VP1/2A генома вируса гепатита А (ВГА) было выделено 6 его генотипов (I–VI) [4]. Генотипы I и II были изолированы только от больных людей, генотипы IV–VI – только от обезьян, генотип III был выявлен как у человека, так и у приматов. Каждый из генотипов I, II и III подразделяется на 2 субтипа – A и B. Наиболее распространенными в мире является субтипы IA и IIIA.

Особенности циркуляции генетических вариантов ВГА на различных территориях изучались в ряде работ. В исследовании, положившем начало генетической классификации ВГА, было показано, что в пределах субтипа IА существует филогенетическое родство изолятов, циркулирующих в одном географическом регионе. Были выявлены кластеры изолятов из Японии и Китая, с территории бывшего СССР и Таиланда [4]. О.V. Nainan и соавт. [5] проанализировали более 3500 изолятов ВГА из США и других стран мира и доказали наличие географической кластеризации штаммов ВГА.

Нами были изучены генетические характеристики 1071 изолята ВГА из 30 регионов РФ, входящих в состав всех восьми федеральных округов (ФО), а также ряда стран СНГ. В результате исследования было установлено, что большинство (73%) изолятов ВГА из РФ относятся к субтипу IA, а оставшиеся 27% принадлежат субтипу IIIA. Случаи гепатита А, вызванные субтипом IB, в РФ единичны и, за редким исключением, являются завозными [6].

Во всех ФО доминирующим субтипом ВГА является субтип IA, доля которого составляет от 62% (Дальневосточный ФО) до 94% (Уральский ФО). В ряде регионов значительное место среди выявленных изолятов ВГА занимает субтип IIIA. Так, более четверти всех случаев гепатита А было вызвано данным субтипом вируса в Центральном (30%) и Дальневосточном ФО (38%) (рис. 1, см. на вклейке). Наибольшая доля (62%) субтипа IIIA была выявлена в Республике Саха.

В странах Средней Азии (Таджикистан, Кыр­гызстан) доминирующим является субтип IIIA ВГА, который составляет более 70% всех случаев. В Украине доминирующим субтипом ВГА является субтип IA, доля которого превышает 85%.

При филогенетическом анализе изолятов ВГА субтипа IA из России и стран СНГ было выявлено, что большинство из них статистически достоверно группируются в 2 отдельных кластера, отличных от средиземноморского, американских и азиатско-тихоокеанских. Выявленные особенности кластеризации штаммов ВГА субтипа IА, циркулирующего в РФ, странах СНГ и других странах мира, доказывают возможность использования филогенетического анализа для подтверждения фактов завозных случаев гепатита А из стран дальнего зарубежья.

В пределах крупных географических кластеров филогенетически родственных штаммов ВГА субтипа IA часто можно выделить подкластеры штаммов, циркулирующих на отдельных ограниченных территориях. Так, для юга Таиланда было показано существование характерных для данной территории штаммов ВГА, выявленных на протяжении 4 лет наблюдения [7]. Изоляты ВГА, циркулирующие на территории центрального и южного районов Туниса на протяжении 2001–2004 гг., формируют на филогенетическом дереве соответствующие кластеры родственных штаммов [8].

Интересные данные были получены по филогеографии ВГА в Южной Америке. В работе M. Costa-Mattioli и соавт. [9] было показано, что изоляты ВГА IA, циркулирующие на территории Аргентины, Уругвая и Чили, обладают высокой генетической вариабельностью, и кластеризация штаммов на дереве по географическому признаку не обнаруживается. В последующем детальном исследовании ВГА в Аргентине было показано, что штаммы из этой страны образуют 2 статистически значимых кластера, при этом географически штаммы перемешаны – на одной территории встречаются штаммы из обоих кластеров [10]. Интересно, что штаммы только одного из этих кластеров группируются с референс-штаммами из Италии, Туниса и США.

Иная картина наблюдается с разнообразием штаммов ВГА на территории Амазонии (Бразилия), где инфицирование гепатитом А происходит, в основном, в детском возрасте, а заболеваемость взрослого населения исключительно низка. В работе V.S. De Paula и соавт. [11] было установлено, что большинство штаммов ВГА, циркулирующих на территории Амазонии, группируется в отдельный кластер и имеет филогенетическое сходство со штаммами, циркулирующими на других территориях Бразилии.

Многолетняя циркуляция штаммов ВГА на одной территории также была показана для развитых стран – Италии [12], Японии [13] и США [5]. Штаммы, циркулирующие на территории США, группируются на дереве в 3 различных кластера. Один из этих кластеров включает штаммы, циркулирующие на территории соседней Мексики. При этом на территории США штаммы из этой группы преимущественно встречались у выезжавших в Мексику либо у контактировавших с приезжими из этой страны и вызывали пищевые вспышки, связанные с употреблением зеленого лука, импортируемого из Мексики [14].

Детальный анализ филогенетических взаимоотношений штаммов субтипа IA, выявленных в РФ и странах СНГ, показал, что можно выделить ряд статистически достоверных кластеров, соответствующих отдельным географическим регионам. Единый кластер формируют изоляты ВГА, выявлявшиеся у больных гепатитом А, из регионов Европейской части РФ. Два кластера соответствуют изолятам ВГА, выявленным на территории Южного и Северо-Кавказского ФО и в Украине. Большинство изолятов IA субтипа, выявленных в Таджикистане и Кыргызстане, группируются также в два кластера. Отдельную ветвь на филогенетическом дереве формируют изоляты, циркулирующие в Республике Тыва. Изоляты ВГА субтипа IA, выявленные в Сахалинской области и Хабаровском крае, также формируют отдельный кластер. Таким образом, анализ позволил выявить 7 кластеров ВГА субтипа IA, характерных для регионов России и стран СНГ: кластер Европейской части РФ, 2 южных кластера, 2 среднеазиатских кластера, тувинский кластер и дальневосточный кластер (рис. 2, см. на вклейке).

Необходимо отметить, что штаммы кластера Европейской части РФ являются наиболее распространенными на территории РФ и вызывают большинство вспышек гепатита А. Штаммы тувинского кластера субтипа IA были обнаружены только в данном регионе, что, вероятно, связано с особенностями его географического и социально-экономического положения. Штаммы, формирующие дальневосточный кластер, филогенетически близки к средиземноморским штаммам, выявлявшимся в Тунисе, Италии и Испании. Анализ генетического разнообразия штаммов ВГА в Сахалинской области и Хабаровском крае на протяжении 2006–2007 гг. показал, что генетические варианты, формирующие дальневосточный кластер, циркулируют на данной территории на протяжении длительного времени и не являются генетически идентичными. Это свидетельствует о длительной эволюции описанных штаммов ВГА на данной территории, и случаи гепатита А, ими вызванные, не могут считаться завозными. Филогенетический анализ штаммов III генотипа ВГА выявил наличие трех кластеров для штаммов субтипа IIIA, один из которых (основной кластер) содержал абсолютное большинство российских штаммов и штаммов стран СНГ. Абсолютное большинство штаммов из стран Средней Азии, выявленных в данной работе, образовывали единый кластер. Штаммы субтипа IIIA, обнаруженные на территории Республики Саха (Якутия), образовывали целую группу кластеров, филогенетически отличных от среднеазиатских. Отдельным кластером, достоверно отличающимся от других, были представлены штаммы, выявленные в Кемеровской области [15].

Таким образом, филогенетический анализ штаммов ВГА субтипов IA и IIIA, циркулирующих в РФ, Украине, Таджикистане и Кыргызстане, позволил выявить ряд географических кластеров, характерных для стран Средней Азии и отдельных регионов РФ. Это демонстрирует возможность использования данного подхода при эпидемиологической диагностике не только для установления факта завоза случаев гепатита А из стран дальнего зарубежья, но и для выявления завозных случаев заболевания из отдельных регионов РФ и стран СНГ.

ВГА является одним из самых стабильных РНК-содержащих вирусов. Скорость его генетической эволюции составляет 9,76 x 10-4 нуклеотидных замен на сайт в год [16]. Скорость эволюции в синонимичных позициях кодона составляет 1,3–4,0 x 10-3, что на порядок ниже, чем оценки для других членов семейства Picornaviridae [16, 17].

Следствием относительно небольшой скорости эволюции вируса является генетическая однородность вирусной популяции, выявляемой у пациентов во время вспышек гепатита А. Изоляты, выделенные во время вспышек и охарактеризованные по наиболее вариабельным фрагментам генома, обычно относятся к одному штамму (генетически идентичны у всех пациентов по маркерным последовательностям генома) [18]. Во время вспышек с установленным источником инфицирования изоляты ВГА, выделенные от пациентов, идентичны между собой и идентичны изолятам, выделенным из источника [19, 20]. Описаны случаи вспышек с продолжительным подъемом заболеваемости, при которых выявлялись несколько генетически различных штаммов в пределах одного населенного пункта или района и в группах риска [21–23]. Также выявление нескольких штаммов ВГА было описано во время массовых пищевых вспышек, источником которых были морепродукты [24].

За период с 2005 по 2010 г. нами было проанализировано 20 вспышек гепатита А, имевших место в 7 ФО. В 5 (25%) ведущим был установлен водный путь, в 4 (20%) – пищевой путь и в 9 (45%) – контактно-бытовой путь передачи возбудителя. 2 (10%) вспышки имели смешанный характер, при них отмечались как контактно-бытовой, так и водный пути передачи. 15 (75%) вспышек были вызваны субтипом IA ВГА, тогда как остальные 5 – субтипом IIIA. При филогенетическом анализе была выявлена значительная генетическая гетерогенность как среди изолятов субтипа IA, так и среди изолятов субтипа IIIA. Анализ штаммов ВГА, циркулировавших в пределах каждой из изученных вспышек, позволил в ряде случаев установить не только характер вспышки (завоз или распространение локального штамма), но также выдвинуть гипотезы о механизме ее развития и доказать единство фактора передачи возбудителя, подтвердить или опровергнуть связь как отдельных случаев заболевания, так и отдельных вспышек между собой [25]. Анализ молекулярно-генетических характеристик штаммов ВГА, циркулирующих во время вспышки, дает ценную дополнительную информацию для установления источника возбудителя инфекции, путей и факторов передачи, а также временных и пространственных границ очага.

В 70-х годах прошлого века в ряде исследований, выполненных с использованием моноклональных антител, было выделено 9 различных субтипов (серотипов) HBsAg (ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4, adrq-, adrq+) [26]. Определение субтипа HBsAg пытались применить для изучения географической распространенности вариантов вируса гепатита В (ВГВ), однако дальнейшие исследования показали, что субтипы HBsAg не отражают истинного генетического разнообразия вируса [27]. К 1988 г. были секвенированы полные нуклеотидные последовательности 18 изолятов ВГВ различных субтипов, что послужило основой для разработки первой генетической классификации. H. Okamoto и соавт. [28] первоначально разделили имеющиеся изоляты ВГВ на 4 генетических группы, обозначенные A, B, C, D. Две новые группы, обозначенные Е и F, были выделены на основе анализа вариабельности в S-гене подтипов ayw4 и ayd4 [29]. Позднее были описаны еще 2 генотипа – G и H [30]. В последние несколько лет в литературе появились сообщения об обнаружении в азиатском регионе новых генетических вариантов ВГВ – I и J [31, 32].

Генотипы A, B, C, D и F сегодня принято разделять на ряд субгенотипов, которые обозначают арабскими цифрами. Для генотипа А известно 3 субгенотипа – А1, А2, А3. Для генотипа В точно установлено существование шести субгенотипов, для генотипов С и D – пяти субгенотипов и для генотипа F – четырех субгенотипов [33, 34]. Возможно, субгенотипическая классификация генотипов ВГВ будет дополняться, так как имеются сообщения о выделении ранее неизвестных генетических вариантов вируса.

Генотип А встречается во всех регионах земного шара, однако превалирует в Северной Америке, Западной Европе и Центральной Африке. Генотипы В и С встречаются в Юго-Восточной Азии. Генотип D является вторым по распространенности генотипом и доминирует в странах Средиземноморья, Индии, Восточной Европе и Северной Америке [35]. Генотип Е превалирует в Западной Африке; генотип F – в Южной и Центральной Америке, на Аляске; генотип G – в Центральной и Северной Америке, а также в Европе [36–39]. Генотип Н был обнаружен в Центральной Америке, Мексике и США [40]. Генотипы I и J были выявлены в Лаосе и Японии соответственно [31, 41]. Однако набирающие силу с каждым годом миграционные процессы приводят к постепенному стиранию четких границ географической распространенности тех или иных генотипов. В крупномасштабном исследовании, охватившем 17 гепатологических центров в США, были зарегистрированы 7 генотипов ВГВ: А (33%), В (21%), С (34%), D (9%), E (1%), F (1%) и G (1%). Кроме того, была выявлена достоверная зависимость между расовой принадлежностью и генотипом ВГВ. Так, генотип А был выявлен у белых и афроамериканцев, в то время как генотипы В и С превалировали среди азиатов. У американцев, родившихся в США, Европе, на Дальнем Востоке и в Юго-Восточной Азии, с наибольшей частотой выявлялись генотипы А, D, С, В соответственно [42].

Нами были изучены генетические характеристики 4328 изолятов ВГВ из 36 регионов РФ, входящих в состав всех восьми ФО, и из ряда стран СНГ. Результаты исследования показали, что в РФ большинство изолятов ВГВ (85%) относится к генотипу D, вторым по частоте (10,7%) является генотип А, 3,2% изолятов принадлежит генотипу С и в 1,1% случаев выявляются другие генотипы, сочетанные генотипы и рекомбинантные штаммы вируса [15, 43]. Во всех ФО доминирующим генотипом ВГВ был D, доля которого варьировала от 70 до 97,9%. В отдель­ных субъектах РФ [Республика Саха (Якутия), Кабардино-Балкарская Республика] значительную долю составлял генотип А (от 40 до 50%), а в Чукотском АО была существенно больше доля генотипа С (24,3%). Выявленные особенности могут быть следствием как географических характеристик территории, так и этнических различий, определяющих условия относительной изоляции популяции, проживающей на данной территории. В Армении, Украине и Кыргызстане доминирующим также был генотип D, который составлял более 80% случаев. Вторым по частоте встречаемости был генотип А (рис 3., см. на вклейке).

При анализе возрастных особенностей распределения генотипов ВГВ в РФ было выявлено, что наибольшая доля (17,7%) больных с генотипом А наблюдалась в возрастной группе 21–30 лет, несколько меньшая – в возрастных группах 15–20 и 31–40 лет (14,5 и 9,3% соответственно). Наименьшая доля больных с генотипом А ВГВ была в возрастных группах 0–14, 41–50 лет и 51 год и старше (4,4, 7,2 и 3,2% соответственно). Выявленные отличия распределения генотипов ВГВ в различных возрастных группах были статистически достоверны (критерий Краскела–Уоллиса; p 0