Набор антигенов и сывороток для диагностики гриппа птиц в ртга

2. БОЛЕЗНИ ЛОШАДЕЙ

2.2. НАСТАВЛЕНИЕ ПО ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА АНТИГЕНОВ И СЫВОРОТОК ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ГРИППА ЛОШАДЕЙ

УТВЕРЖДЕНО 27 февраля 2004 г., б/н

1. Общие положения

1.1. Набор антигенов и сывороток предназначен для диагностики гриппа лошадей путем идентификации выделенных штаммов вируса и исследования сывороток крови лошадей, больных и переболевших этой болезнью.

1.2. Диагностический набор содержит:

- сухие инактивированные антигены 1 (H N ) и 2 (H N ) серотипов вируса гриппа лошадей - по 2 флакона (ампулы) каждого вида;

- сухие гипериммунные сыворотки к 1 (H N ) и 2 (H N ) серотипам вируса гриппа лошадей - по 2 флакона (ампулы) каждого вида;

- сыворотка нормальная - 1 флакон (ампула).

1.3. Специфические антигены представляют собой сухую аморфную массу беловато-серого цвета; специфические сыворотки - розовато-кремового цвета.

1.4. Антигены и сыворотки расфасовывают по 1,0 см во флаконы (ампулы). Флаконы (ампулы) укладывают в картонные или полистироловые коробки, обеспечивающие неподвижность и целостность флаконов (ампул).

Каждая коробка представляет собой набор антигенов и сывороток для диагностики гриппа лошадей. В каждую коробку вкладывают наставление по применению.

1.5. На флаконы (ампулы) наклеивают или несмываемой краской по стеклу наносят этикетки с указанием:

- для антигенов - названия антигена, объема, титра в РГА, даты изготовления и номера серии;

- для сывороток - наименования гипериммунной сыворотки к подтипу вируса, на который она получена, титра в РТГА, объема фасовки, даты изготовления и номера серии.

На коробках с набором указывают наименование предприятия-изготовителя и его товарный знак; полное название препарата; количество флаконов (ампул) каждого компонента, входящего в препарат; название антигенов, сывороток и их серотипов; дату изготовления; срок годности; номер серии; номер контроля; условия хранения и обозначение ТУ.

1.6. Набор хранят в сухом темном помещении при температуре от 2 до 8°С. Допускается хранение при любой минусовой температуре.

1.7. Срок годности набора - 3 года с даты изготовления.

2. Принцип метода

Сущность метода основана на способности сывороток крови лошадей, содержащих специфические антитела, тормозить гемагглютинирующую активность антигена (вируса) гриппа лошадей соответствующего серотипа.

3. Порядок применения набора

3.1. Антигены в ампулах (флаконах) разводят физиологическим раствором (рН 7,2. 7,4) до первоначального объема, т.е. добавляют к содержимому по 1,0 см физиологического раствора. Сухая масса должна полностью раствориться при встряхивании в течение 3. 5 мин и представлять собой гомогенную взвесь желтоватого цвета.

3.2. Сыворотки в ампулах (флаконах) разводят дистиллированной водой в соотношении 1:10. Сухая сыворотка должна растворяться при встряхивании в течение 3. 5 мин и представлять собой прозрачную жидкость розовато-кремового цвета. Разведенную сыворотку прогревают на водяной бане при температуре 56°С в течение 5 мин. Надосадочную часть сыворотки собирают для постановки РТГА. Разведенные антигены и сыворотки хранят при температуре от 2 до 8°С не более 24 ч.

3.3. Приготовление 1%-ной суспензии эритроцитов петуха

Для получения 1%-ной суспензии эритроцитов используют петухов старше 6 мес.

Взятие крови у петухов производят из подкрыльцовой вены. Набирают необходимое количество крови в стеклянную пробирку с 2. 3%-ным раствором лимоннокислого натрия на физиологическом растворе (рН от 7,2 до 7,4) в соотношении 2:1.

Полученную кровь трижды отмывают физиологическим раствором, осаждая эритроциты на центрифуге в течение 10 мин при 1500 об/мин.

Из осадка эритроцитов готовят 1%-ную суспензию, которую хранят при температуре от 2 до 8°С не более 4 сут.

3.4. Идентификация выделенного из патологического материала больных лошадей вируса в реакции торможения гемагглютинации (РТГА).

3.4.1. С целью выделения вируса используют носовые смывы от больных лошадей в первые 2. 3 дня от начала заболевания. Для идентификации вируса в РТГА используют вируссодержащий материал с титром гемагглютинации не ниже 1:8.

3.4.2. Постановка реакции гемагглютинации

Для идентификации гриппа млекопитающих и птиц наиболее простым и высоко достоверным методом является РТГА. РН - штаммоспецифическая и также высоко достоверная, но используется в диагностике значительно реже. Ее обычно применяют при некоторых неясных и спорных случаях.

Реакция связывания комплемента. Используют для определения типоспецифичности выделенного вируса, когда в РТГА не удается установить родственных связей между выделенным и эталонными штаммами вируса гриппа по антисывороткам к ним. В этом случае в РСК с эталонными иммунными сыворотками против вирусов гриппа типов А, В и С устанавливают типовую принадлежность штамма.

В последнее время для типирования нейраминидазы вируса начали применять РТНА, но в диагностической ветеринарной практике она пока еще не применяется. Ее используют, в основном, для изучения АГ связей различных штаммов вируса гриппа.

Реакция торможения гемагглютинации. Идентификацию испытуемого вируса проводят с набором эталонных штаммоспецифических гриппозных сывороток к его АГ вариантам. Для дифференциации в реакцию вводят сыворотку против вируса НБ. РТГА ставят микро- или макрометодом по общепринятой методике.

Иммуноферментный метод. Может быть использована как экспресс-метод диагностики гриппа птиц. Препараты готовят непосредственно ex tempore от убитой больной или свежепавшей птицы. Прямой метод ИФ позволяет определять АГ ВГП в мазках-отпечатках тканей птиц, идентифицировать АГ данного вируса из различных тканей организма, инкубационных яиц, печени зараженных эмбрионов и культур клеток фибробластов; выявить вирусный АГ даже в тех случаях, когда вирус из пораженных тканей выделить не удается.

В ветеринарной диагностической практике для идентификации выделенного вируса РДП не используют, так как необходимы концентрированные и очищенные АГ. В основном применяют ее для изучения АГ структуры вирусов гриппа. Разработаны наборы для ИФА с монАТ, непосредственно обнаруживающие ГА, нуклеокапсидный или матриксный белки вируса гриппа. Идентификацию вирусспецифической нуклеиновой последовательности предлагается осуществлять ПЦР с 2-мя типами праймеров (на основе генов неструктурного белка и ГА). Тест стандартизован для определения AT к ВГП в сыворотке крови у индеек.

Минимальные АГ различия между вариантами и родительским вирусом выявлялись только монАТ, продуцируемыми клетками гибридомы PEG-1 или фрагментами селезенки гипериммунных животных. МонАТ дают возможность точно проследить филогенетические взаимоотношения между вирусными штаммами в составе субтипа, а в сочетании с методами пептидного картирования и определения последовательности а.к. - выяснить молекулярную структуру АГ участка ГА.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. Обнаружение анти-ГА, ВНА и КСА - надежный признак протекающей или уже прошедшей инфекции ГП в стаде.

РТГА. Исследование парных сывороток проводят с диагностической целью при атипичном, часто вялом течении болезни с поражением органов дыхания. Сыворотку от диких птиц на присутствие противогриппозных AT исследуют при изучении роли перелетных птиц в распространении гриппа. Обязательным условием для ретроспективной диагностики ГП является одновременное исследование парных сывороток, так как для диагностических целей имеет значение сравнительный титр AT против вирусов различных серологических подтипов в 1-й и 2-й пробах сыворотки. Первую пробу сыворотки хранят при 4°С или в замороженном виде. Обе пробы исследуют одновременно. Перед постановкой реакций сыворотки прогревают при 60°С 30 мин, а затем освобождают от термостабильных ингибиторов, используя СО₂, КО₄ и др. методы. Если титр AT во 2-й пробе сыворотки (через 10-14 дн после заболевания) превышает не менее чем в 4 раза титр AT к тому же типу вируса в 1-й пробе, то РТГА считается положительной, подтверждающей диагноз гриппа птиц. При постановке РТГА с парными сыворотками больных птиц необходимо использовать не только набор эталонных штаммов (например, к вирусам A/Fowl plague, A/Chick/Scotland, A/Turkey, A/Duck), но и местные штаммы того птицехозяйства, где зарегистрирована болезнь. При анализе результатов РТГА необходимо указывать, сколько сывороток было с низким, средним и высоким титром к тому или иному штамму вируса гриппа. В ряде случаев вместо индивидуальных сывороток показатели иммунитета стада (после переболевания или прививки живой вакциной) можно изучить на сыворотках,.полученных от нескольких птиц. В этих случаях испытуемые сыворотки, взятые от отдельных птиц, нужно соединять в равных объемах. На протяжении опыта (120 дн после реконвалесценции) в сыворотках кур находили анти-ГА: до 75-го дня титры сохранялись примерно на одном уровне (5-5,8 log₂), а в дальнейшем снижались (до 4,4-4,6 log₂).

РСК применяют для обнаружения АГ и AT в целях ранней и ретроспективной диагностики гриппа. Ставят с аллантоисными жидкостями КЭ или с очищенными диагностикумами. РДП широкого применения не нашла, так как необходимы высокие концентрации чистых АГ. Среди исследователей нет единого мнения о чувствительности этой реакции. Некоторые авторы указывают, что чувствительность РДП сравнительно невысока, поскольку достоверные положительные результаты получали лишь при исследовании сывороток с титром AT в РТГА 1:80 и выше.

Реакция радиального гемолиза. В настоящее время используется для сероэпидемиологических исследований и при оценке эффективности противогриппозных вакцин. РРГ с ВГ А обладает выраженной штаммовой специфичностью: диаметр зон гемолиза с гомологичными АГ при исследовании сывороток хорьков, зараженных 6-ю различными вирусами, были в 1,5-3 раза больше, чем с гетерологичными. При правильном подборе штамма РРГ может быть с успехом использована для определения анти-ГА.

Показано хорошее совпадение результатов титрования AT в ELISA, РСК и ИФ. Однако в ELISA значительно выше (титр 1:481-1:1520), чем в РСК и РИФ. Сенсибилизацию лунок панелей проводят РНК-АГ вируса гриппа А. Предложен новый метод приготовления AT эритроцитарных диагностикумов к вирусам гриппа, которые с успехом могут быть изготовлены на основе любых штаммов вируса гриппа. Они позволяют определять типовую принадлежность эпизоотических и межэпизоотических штаммов ВГП, свиней и лошадей. В практической работе врачу ветеринарной лаборатории, возможно, придется встретиться не только с гриппом кур и уток, но и с гриппом индеек.

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

от 3 апреля 2006 г. N 105

ОБ УТВЕРЖДЕНИИ ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРАВИЛ

ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ГРИППА A ПТИЦ

В целях повышения эффективности борьбы с гриппом птиц и в соответствии с пунктом 5.2.11 Положения о Министерстве сельского хозяйства Российской Федерации, утвержденного Постановлением Правительства Российской Федерации от 24 марта 2006 г. N 164 (Собрание законодательства Российской Федерации, 2006, N 14, ст. 1543), приказываю:

утвердить Ветеринарные правила лабораторной диагностики гриппа A птиц согласно приложению.

к Приказу Минсельхоза России

от 3 апреля 2006 г. N 105

ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ГРИППА A ПТИЦ

1. Область применения

1.1. Настоящие Правила устанавливают обязательные требования к организации лабораторной диагностики гриппа A птиц (далее - грипп птиц).

1.2. Положения настоящих правил обязательны для выполнения на территории Российской Федерации органами государственной власти, предприятиями или иными хозяйствующими субъектами, учреждениями, организациями, общественными объединениями, независимо от их подчинения и форм собственности, должностными лицами и гражданами.

2. Общие положения

2.1. Диагностические лабораторные исследования и серологические тесты по определению напряженности поствакцинального иммунитета (далее - лабораторные тесты) проводят в специализированных ветеринарных учреждениях.

2.2. Лабораторная диагностика гриппа птиц направлена на выявление в исследуемых объектах ветеринарного надзора:

вируса гриппа птиц;

РНК вируса гриппа птиц;

антигенов вируса гриппа птиц;

антител к вирусу гриппа птиц.

2.3. При проведении лабораторных тестов могут быть использованы методы лабораторных исследований, применяющие:

тесты, утвержденные в установленном порядке;

тесты, которые реализуются с использованием тест-систем, зарегистрированных в установленном порядке в Российской Федерации.

3. Обязательные требования по отбору проб

для проведения диагностики гриппа птиц

3.1. Отбор проб крови и патологического материала проводит ветеринарный работник, имеющий специальную подготовку.

3.2. Пробы маркируются и опечатываются. К пробам прилагается сопроводительный документ, содержащий сведения о дате и месте отбора проб, юридическом или физическом лице - владельце птицы и месте его нахождения, виде, возрасте птицы и ее состоянии на момент отбора проб.

3.3. Для проведения исследований осуществляют отбор проб патологического материала (органы, ткани головного мозга, легких, трахеи, селезенки, участков кишечника, почек, сердца) от павшей или убитой с диагностической целью птицы.

3.4. От каждого стада птицы отбирают для исследований 5 - 10 трупов или патологический материал от 5 - 10 трупов, клоакальные и/или трахеальные смывы от 10 - 15 голов, 1 - 10 сборных проб помета от стада.

У мелких видов птиц для отбора проб используют свежий помет.

Пробу помета рекомендуется отбирать из расчета 1 грамм помета на 60 точек птичника (выгула или вольеры), выбранных по диагонали крест-накрест.

3.5. Пробы крови для определения антител к вирусу гриппа птиц рекомендуется отбирать у 25 - 30 птиц из стада (партии), из одного птичника (зала) или одного населенного пункта, местности (водоема).

Пробы крови отбирают из подкрыльцовой вены в пробирки, увлажненные физиологическим раствором. Кровь выдерживают до образования сгустка при комнатной температуре или в термостате при 37 град. C в течение 1 - 2 часов, затем обводят иглой или пастеровской пипеткой, отслаивая сгусток крови от стенок пробирки, и оставляют на 16 - 18 часов при температуре 2 - 4 град. C. Образовавшуюся прозрачную без признаков гемолиза сыворотку отбирают с помощью пипетки в отдельные, чистые пробирки.

Отбор крови допускается проводить с помощью иглы и шприца (или вакуумной пробирки).

Рекомендуется проводить центрифугирование проб крови для получения сыворотки в течение 10 - 15 минут при 1000 об./мин. для осаждения свободных эритроцитов.

Для серодиагностики используют парные пробы сывороток крови, полученные от больных или инфицированных птиц, в начале заболевания и через 4 - 10 дней.

3.6. Пробы транспортируются во влагонепроницаемой таре, в контейнере с хладоэлементами или в термосе со льдом. Допускается однократное замораживание сывороток.

При транспортировке проб соблюдают установленные ветеринарно-санитарные правила и меры безопасности, предъявляемые к транспортировке биологических материалов, содержащих инфекционные агенты 3-й группы патогенности.

3.7. Если немедленное исследование проб невозможно, допускается сохранять образцы на протяжении 4 дней при температуре 4 град. C.

При необходимости для увеличения срока хранения диагностические образцы и/или изолят помещают в морозильную камеру с температурой -80 град. C.

4. Методы и сроки проведения лабораторных исследований

4.1. Для установления диагноза на грипп птиц допускается применение следующих методов:

а) для выявления вируса гриппа птиц - биопроба на СПФ (свободных от патогенной микрофлоры) - цыплятах с обязательным последующим подтверждением специфичности биологической реакции;

б) для выделения вируса гриппа птиц - метод выделения вируса на СПФ - куриных эмбрионах или в культуре клеток;

в) для обнаружения антигенов вируса гриппа птиц;

иммуноферментный анализ (ИФА) для обнаружения одного или нескольких белков вируса;

иммунопреципитация (двойная иммунодиффузия по Оухтерлони (далее - РДП) или иммуноэлектроосмофорез (далее - ИЭОФ);

иммунохроматографические методы (далее - ИХА);

радиоиммунный анализ (далее - РИА);

непрямая гем- и латексагглютинация;

реакция связывания комплемента (далее - РСК);

г) для обнаружения гемагглютинина (гемагглютинирующей активности) вируса гриппа птиц:

реакция гемагглютинации (далее - РГА) с подтверждением специфичности в реакции торможения гемагглютинации (РТГА);

ИФА на основе моноспецифических сывороток или моноклональных антител к вирусному гемагглютинину;

д) для обнаружения РНК вируса:

полимеразная цепная реакция (далее - ПЦР);

ПЦР с последующим секвенированием ее продуктов;

Дот-блот и блот гибридизация нуклеиновых кислот;

е) для обнаружения антител к вирусу гриппа птиц:

ж) для субтипирования вируса по гемагглютинину и нейраминидазе:

сиквенс к ДНК или ПЦР-продукта;

Дот-блот и блот гибридизация нуклеиновых кислот;

ИФА на основе моноспецифических сывороток или моноклональных антител к вирусному гемагглютинину;

з) для субтипирования противовирусных антител по гемагглютинину:

ИФА на основе моноспецифических сывороток или моноклональных антител к вирусному гемагглютинину.

4.2. Применение иных тестов допускается для получения предварительных результатов.

4.3. Методы проведения лабораторных исследований реализуются на основе утверждаемых в установленном порядке методик проведения обязательных диагностических исследований.

4.4. Сроки проведения лабораторных исследований устанавливаются в зависимости от метода исследования и не могут превышать 1 месяца.

Приложение
к приказу Минсельхоза РФ
от 3 апреля 2006 г. N 105

Ветеринарные правила
лабораторной диагностики гриппа А птиц

1. Область применения

1.1. Настоящие Правила устанавливают обязательные требования к организации лабораторной диагностики гриппа А птиц (далее - грипп птиц).

2. Общие положения

вируса гриппа птиц;

РНК вируса гриппа птиц;

антигенов вируса гриппа птиц;

антител к вирусу гриппа птиц.

тесты, утвержденные в установленном порядке;

3. Обязательные требования по отбору проб для проведения диагностики гриппа птиц

3.4. От каждого стада птицы отбирают для исследовании 5-10 трупов или патологический материал от 5-10 трупов, клоакальные и/или трахеальные смывы от 10-15 голов, 1-10 сборных проб помета от стада.

У мелких видов птиц для отбора проб используют свежий помет.

3.5. Пробы крови для определения антител к вирусу гриппа птиц рекомендуется отбирать у 25-30 птиц из стада (партии), из одного птичника (зала) или одного населенного пункта, местности (водоема).

Пробы крови отбирают из подкрыльцовой вены в пробирки, увлажненные физиологическим раствором. Кровь выдерживают до образования сгустка при комнатной температуре, или в термостате при 37°С в течение 1-2 часов, затем обводят иглой или пастеровской пипеткой, отслаивая сгусток крови от стенок пробирки, и оставляют на 16-18 часов при температуре 2-4°С. Образовавшуюся прозрачную без признаков гемолиза сыворотку отбирают с помощью пипетки в отдельные, чистые пробирки.

Отбор крови допускается проводить с помощью иглы и шприца (или вакуумной пробирки).

Рекомендуется проводить центрифугирование проб крови для получения сыворотки в течение 10-15 минут при 1000 об/мин для осаждения свободных эритроцитов.

3.7. Если немедленное исследование проб невозможно, допускается сохранять образцы на протяжении 4 дней при температуре 4°С.

При необходимости для увеличения срока хранения диагностические образцы и/или изолят помещают в морозильную камеру с температурой -80°С.

4. Методы и сроки проведения лабораторных исследований

4.1. Для установления диагноза на грипп птиц допускается применение следующих методов:

б) для выделения вируса гриппа птиц - метод выделения вируса на СПФ - куриных эмбрионах или в культуре клеток;

в) для обнаружения антигенов вируса гриппа птиц;

иммуноферментный анализ (ИФА) для обнаружения одного или нескольких белков вируса;

иммунохроматографические методы (далее - ИХА);

радиоиммунный анализ (далее - РИА);

непрямая гем- и латексагглютинация;

реакция связывания комплемента (далее - РСК);

г) для обнаружения гемагглютинина (гемагглютинирующей активности) вируса гриппа птиц:

реакция гемагглютинации (далее РГА) с подтверждением специфичности в реакции торможения гемагглютинации (РТГА);

ИФА на основе моноспецифических сывороток или моноклональных антител к вирусному гемагглютинину;

д) для обнаружения РНК вируса:

полимеразная цепная реакция (далее - ПЦР);

ПЦР с последующим секвенированием ее продуктов;

Дот-блот и блот гибридизация нуклеиновых кислот;

е) для обнаружения антител к вирусу гриппа птиц:

ж) для субтипирования вируса по гемагглютинину и нейраминидазе:

сиквенс к ДНК или ПЦР-продукта;

Дот-блот и блот гибридизация нуклеиновых кислот;

ИФА на основе моноспецифических сывороток или моноклональных антител к вирусному гемагглютинину;

з) для субтипирования противовирусных антител по гемагглютинину:

ИФА на основе моноспецифических сывороток или моноклональных антител к вирусному гемагглютинину.

4.2. Применение иных тестов допускается для получения предварительных результатов.

Цель: определение а/т к вирусу гриппа в сыворотке крови и их нарастание в парных сыворотках.

Компоненты: сыворотка крови, антиген вируса гриппа (гемагглютинин) и эритроциты.

Ход: РТГА это вариант РН, основана на нейтрализации гемагглютинирующих свойств вирусов специфическими а/т находящимися в сыворотки больного, что проявляется отсутствием агглютинации эритроцитов с формированием на дне лунки компактного осадка (точечка, а не зонтик). Сыворотки крови обрабатывают периодатом калия для устранения неспецифических ингибиторов агглютинации, затем к разным разведениям сыворотки добавляют равное кол-во известных вирусных частиц (антигенов) и инкубируют. После чего добавляют, равны объем 1,0% взвеси эритроцитов, инкубируют и читают результат. Диагностическим титром считают наибольшее разведение, в котором тормозится гемагглютинация.

Выявление вируса гепатита А при иммунной электронной микроскопии:

Цель: выявление обнаружение вируса в материале и идентификация:

Компоненты: материал от больного, противовирусной сыворотки, контрастирующее вещество.

Ход: материал содержащий вирусов обрабатывают противовирусной сывороткой содержащей антилела к HAVAg, затем добавляют фосфорно-вольфрамовую кислоту для контрастирования. Смесь наносят на пленку и высушивают. Затем микроскопируют в электронном микроскопе и находят скопление вирусных частиц.

Экспресс-Ds-ка ротавирусной инфекции в реакции гемадсорбции на твердой основе (РГагТО):

Цель: определение антигенов ротавируса вируса в материале.

Компоненты: противоротавирусная сыворотка (а/т), материал от больного с вирусом и его а/г, сенсибилизированные иммуноглобулином эритроциты.

Ход: лунки полистироловых планшетов обрабатывают противоротавирусной сывороткой, затем вносят в них исследуемый вируссодержащий материал и через 30-60 минут лунки промывают буферным раствором, после чего добавляют взвесь сенсибилизированных специфическим иммуноглобулином эритроцитов и через 30-60 минут читают результат. Если в материале был вирусный антиген, он соединяется с антителами сыворотки адсорбированными на поверхности лунки, а затем с иммуноглобулином на поверхности эпитроцитов и происходит гемагглютинация.

Выявление антигенных маркеров вируса бешенства при помощи РИФ:

Цель: выявление а/г вируса бешенства.

Компоненты: культура клеток инфицированная материалом от больного (с а/г), антирабического иммуноглобулина или моноклинальных антител, меченных флюорохромом (флюорисцином).

Ход: культуру клеток обрабатывают меченым иммуноглобулином и микроскопируют. При наличии вируса в клетке а/т адсорбируются на клетке и наблюдается ее свечение.

Идентификация вируса гриппа в аллантоисной жидкости РКЭ в РТГА:

Цель: идентификация вируса гриппа по известным антителам.

Компоненты: аллантоисная жидкость инфицированного вирусом РКЭ, противогриппозные диагностические сыворотки типа А, В, С и эритроциты кур.

Ход: Р-я основана на нейтрализации гемагглютинирующей активности вируса различных типов вируса гриппа А, В, С соответствующими сыворотками. Смесь соответствующей сыворотки и аллантоисной жидкости смешивают с эритроцитарный взвесью. Отсутствие гемагглютинации с одной из сывороток, указывает на тип вируса.

Идентификация вируса гриппа в аллантоисной жидкости РКЭ в РГА:

Цель: определение вируса или его а/г в материале.

Компоненты: Аллантоисную жидкость РКЭ инфицированного материалом от больного, эритроциты кур.

Ход: Аллантоисную жидкость титруя разводят от 1:10 до 1:52 и вносят по 0,5 мл в лунки планшета, и добавляют по 0,5 мл 1% взвеси эритроцитов кур, инкубируют 40 минут и читают результат. Гемагглютинация говорит о наличии вируса в аллантоисной жидкости.

Серологическая диагностика кори при помощи РНГА:

Цель: выявление а/т к вирусу кори в сыворотки крови и нарастание их титра.

Компоненты: сыворотка крови больного, эритроцитарный коревой диагностикам.

Ход: Основана на способности эритроцитов с адсорбированными на их поверхности а/г к вирусу кори взаимодействовать с а/т в сыворотке крови и образовании на дне луки в виде фестончатого осадка (зонтик с неровными краями).

Серологический метод диагностики клещевого энцефалита при помощи РСК:

Цель: определение а/т в сыворотки крови и нарастание их титра.

Компоненты: парные сыворотки крови больного, а/г клещевого энцефалита для РСК, гемолитическая сыворотка и эритроциты барана.

Ход: 1 фага – антитела в сывороточных разведениях взаимодействуют с а/г диагностикума, в результате чего происходит связывание комплимента. 2 фаза – индикаторная – определение в смеси наличия свободного комплемента путем добавления гемолитической системы (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка), если комплимент свободен, то происходит гемолиз эритроцитов (РСК отрицательная), а если комплимент связан, то гемолиз не наступает (РСК положительная).

Определение антител к вирусу ВИЧ при помощи ИФА:

Цель: определение а/т в ВИЧ.

Компоненты: антигены ВИЧ, сыворотка крови больного, антиглобулиновую человеческую сыворотку меченую ферментом пероксидазой хрена субстрат для фермента.

Ход: сыворотку крови добавляют в лунки планшета с адсорбированными а/г ВИЧ и инкубируют. Затем лунки отмывают и добавляют антиглобулиновую сыворотку меченую ферментом., затем снова отмывают и добавляют субстрат для фермента с индикатором. Если в сыворотке а/т нет, то адсорбция последующих компонентов реакции и разложение субстрата не наблюдается.

Определение маркеров вируса гепатита В при помощи ИФА:

Цель: выявление а/г HBsAg в сыворотки крови больного.

Компоненты: сыворотка крови, антитела к HBsAg.

Цель: выявление а/т в ВИЧ.

Ход: на полоски наносят сыворотку крови и инкубируют, затем отмывают и наносят меченую антиглобулиновую сыворотку. Образовавшийся комплекс а/г-а/т-анти-а/т выявляют добавлением субстрата, изменяющего окраску при действии фермента.

Читайте также: