Набор для выявления антигена вируса чумы плотоядных иммуноферментным анализом ифа

Многообразие различных форм течения чумы затрудняет своевременную постановку диагноза. Наличие катарального синдрома, сопровождающегося двухфазовым повышением температуры тела и нервными симптомами, позволяет поставить предварительный диагноз. Следует учитывать также и эпизоотическую ситуацию на данной территории, в питомнике, а также возможный контакт собаки с больным чумой животным. Окончательный диагноз может быть установлен только с помощью лабораторных методов исследования.

Метод флуоресцирующих антител (МФА) при чуме собак применяют уже более 20 лет как рутинный при экспресс-диагностике. Широкое признание получил прямой метод, когда меченные ФИТЦ антитела наносят непосредственно на мазки-отпечатки. По чувствительности он незначительно уступает иммуноферментному анализу (ИФА). Однако в редких случаях у вакцинированных собак против чумы отмечена неспецифическая положительная реакция. Сущность метода заключается в соединении меченых антител со специфическим антигеном и в обнаружении светящихся комплексов антиген - антитело под люминесцентным микроскопом.

Материалом для исследований служат мазки крови, а также фракции лейкоцитов, взятые в первые дни заболеваний, мазки-отпечатки со слизистых оболочек глаз, век, носовой полости и других отделов респираторного тракта, мочевого пузыря, миндалин, лимфатических узлов.

В связи с отсутствием стандартных по активности и специфичности коммерческих флуоресцирующих сывороток МФА как перспективный метод не нашел должного применения на практике.

Сущность метода заключается во взаимодействии антигена с антителами, находящимися в лунках полистеролового планшета с последующим выявлением полученного комплекса иммунопероксидазным конъюгатом, вызывающим разложение субстрата индикаторного раствора и окрашиванием содержимого лунок планшета при положительной реакции.

С помощью ПЦР следует исследовать материал от невакцинированных собак с обязательным подтверждением диагноза другими методами.

Гистологический метод основан на обнаружении эозинофильных цитоплазматических включений, образованных вирусом, у больных и павших от чумы собак. Эти включения могут быть обнаружены в лейкоцитах, ретикулярных, эпителиальных и нервных клетках. При остром течении болезни их можно выявить практически во всех тканях организма. Срезы из органов и тканей окрашивают гематоксилин-эозином: цитоплазма клеток сиреневая, а тельца-включения - малиново-красного и розового цвета соответственно. Размер включений в цитоплазме бывает до 20 нм, а число их достигает до 10 в одной клетке. В большинстве случаев их легко можно обнаружить в мазках крови (лейкоциты, эритроциты) на 2-9-е сутки после заражения. Постмортальные клеточные тельца-включения чаще всего находятся в ЦНС. Гистологический метод выявления этих телец на слизистой оболочке мочевого пузыря несколько потерял свое значение с внедрением живых вирус-вакцин для профилактики чумы, так как с помощью него довольно трудно отличить поствакцинальные изменения от постинфекционных. Существенное влияние на результат исследования могут оказать давность и качество приготовленных красителей, а также ряд других факторов, искажающих его достоверность. Официально этот метод не зарегистрирован в нашей стране, однако его используют как дополнительный тест при постановке диагноза.

Для постановки диагноза применяют биопробу. В качестве материала берут кровь от больных собак в начальной стадии в период повышения температуры тела, а от павших - патматериал: селезенку, печень, почки, головной мозг. Готовят 10%-ю суспензию на физиологическом растворе или питательной среде, центрифугируют и внутримышечно вводят щенкам собак или тхорзофреткам. За подопытными животными ведут наблюдение в течение 1-1.5 месяцев. Наиболее чувствительными являются тхорзофретки, которые погибают через 7-10 суток с характерными клиническими признаками чумы. Щенки собак могут погибнуть значительно позже (1.5-2 месяца), иногда нельзя получить четких результатов, так как многие животные являются носителями антител к вирусу чумы плотоядных. Несмотря на то что этот метод дорогостоящий, он позволяет в короткий срок получить положительные результаты, и лучше всего на тхорзофретках.

С помощью этого метода в культуре клеток можно выделить вирус. Его изолируют из смывов слизистых оболочек носовой полости, конъюнктивы, крови и патматериала. С диагностической целью этим пользуются довольно редко из-за сложности и длительности проведения, так как к изолятам вируса не все культуры клеток обладают чувствительностью и требуется его адаптация путем серийных пассажей, на что уходит много времени.

Серологические тесты, основанные на исследовании сывороток крови собак в РН и РНГА, показывают, что титры специфических антител к ВЧП широко варьируют у разных пород собак в зависимости от давности и тяжести течения инфекции.

Иммуноферментный анализ (ИФА) — метод лабораторной диагностики, позволяющий обнаруживать специфические антитела и антигены при самых разных патологиях.

ИФА — один из самых распространенных и точных методов для выявления инфекций, передающихся половым путем, в частности ВИЧ, ВПЧ, гепатита В.

Для того чтобы результаты анализов были максимально достоверными, необходимо правильно подготовиться к их сдаче.

Спецпредложения, скидки и акции помогут существенно сэкономить на медицинском обследовании.

Контроль качества лабораторных исследований, осуществляемый по международным стандартам, — дополнительная гарантия точности результатов анализов.

Современная диагностика в медицине немыслима без высокочувствительных лабораторных анализов. Прежде для установления причин тех или иных симптомов врачи были вынуждены ориентироваться на косвенные признаки болезни, а также проводить многоступенчатые микроскопические исследования в попытке обнаружить возбудителя инфекции. Сегодня достаточно одного-единственного теста — такого как иммуноферментный анализ — чтобы подтвердить или опровергнуть первоначальный диагноз.

Основные понятия и принцип метода иммуноферментного анализа

Существует несколько разновидностей антител, каждая из которых вступает в действие на определенном этапе иммунного ответа. Так, первыми в ответ на проникновение антигена в организм синтезируются иммуноглобулины класса М (IgM). Содержание этих антител наиболее высоко в первые дни инфекционного процесса.

Следом за ними иммунная система выбрасывает в кровь иммуноглобулины класса G (IgG), которые помогают уничтожать антигены до полной победы над инфекцией, а также продолжают циркулировать по сосудам в дальнейшем, обеспечивая иммунитет к повторному заражению. На этом явлении основана вакцинация: благодаря прививкам, содержащим ослабленные антигены микробов и вирусов, в нашей крови появляется большое количество IgG, которые при контакте с реальной угрозой быстро подавляют инфекцию — до того, как она нанесет вред здоровью.

Как узнать, какие именно антигены или антитела присутствуют в организме человека? Когда врач предполагает, что причиной заболевания является определенная инфекция, или желает измерить концентрацию определенного гормона, он назначает пациенту иммуноферментный анализ.

ИФА бывает качественным и количественным. В первом случае подразумевается однозначный ответ: искомое вещество или найдено, или не найдено в образце. В случае с количественным анализом более сложная цепь реакций дает возможность оценить концентрацию антител в крови человека, что в сравнении с результатами предыдущих тестов даст ответ на вопрос о том, как развивается инфекционный процесс.

Бесспорные преимущества ИФА — высокая чувствительность и специфичность метода. Чувствительность — это возможность распознать искомое вещество, даже если его концентрация в образце невысока. Специфичность же подразумевает безошибочность диагностики: если результат положительный, значит, найдены именно те антитело или антиген, которые предполагались, а не какие-то другие.

Высокая степень технологичности проведения иммуноферментного анализа минимизирует влияние человеческого фактора, что снижает вероятность ошибки. Большинство используемых в современных лабораториях тест-систем и реактивов для ИФА выпускаются в промышленных условиях, что гарантирует точный результат.

В случае диагностики инфекционных заболеваний иммуноферментный анализ не может найти возбудителя и определить его специфичные свойства: он лишь указывает на наличие антител в крови у больного, косвенно свидетельствующих о присутствии чужеродного микроорганизма в теле человека.

ИФА — крайне точный, но не дешевый метод, поэтому обращаться к нему нужно с умом, а интерпретацией результатов должен заниматься квалифицированный врач.

Невозможно охватить полный список показаний к проведению ИФА. Вот наиболее распространенные цели анализа:

Диагностика острых и хронических инфекционных заболеваний:
- IgM и IgG к вирусным гепатитам А, B, C, E, а также антигенов гепатитов В и С;
- IgG к ВИЧ;
- Ig M и IgG к цитомегаловирусной инфекции;
- Ig M и IgG к вирусу Эпштейна-Барр;
- Ig M и IgG к герпетическим инфекциям;
- Ig M и IgG к токсоплазмозу;
- Ig M и IgG к кори, краснухе, сальмонеллезу, дизентерии, клещевому энцефалиту и другим заболеваниям;
- IgG к паразитарным заболеваниям;
- Ig M и IgG к инфекциям, передающимся половым путем;
- IgG к хеликобактерной инфекции.
Общая оценка показателей иммунитета человека и маркёров некоторых аутоиммунных заболеваний.
Выявление онкологических маркёров (фактора некроза опухоли, простатспецифического антигена, раково-эмбрионального антигена и других).
Определение содержания гормонов в сыворотке крови (прогестерона, пролактина, тестостерона, тиреотропного гормона и других).

Основной биоматериал для проведения ИФА — это сыворотка крови: в лаборатории у пациента берут образец крови из вены, из которого в дальнейшем удаляют форменные элементы, затрудняющие проведение анализа. В некоторых других случаях для анализа используется спинномозговая жидкость, околоплодные воды, мазки слизистых оболочек и т.д.

Для того чтобы избежать искажений в результатах, рекомендуется сдавать кровь натощак, а за две недели до исследования (если целью является диагностика хронических, скрыто протекающих инфекционных заболеваний) необходимо отказаться от приема антибиотиков и противовирусных препаратов.

При наличии необходимых реактивов и хорошей организации работы лаборатории результат анализа вы получите в течение 1–2 суток после забора крови. В некоторых случаях, при необходимости получения экстренного ответа, этот срок может быть сокращен до 2–3 часов.

IgM — наличие этого класса иммуноглобулинов говорит об остром инфекционном процессе в организме. Отсутствие IgM может говорить как об отсутствии конкретного возбудителя в организме, так и о переходе инфекции в хроническую стадию.
IgA при отрицательном результате теста на IgM чаще всего свидетельствует о хронической или скрыто протекающей инфекции.
IgM и IgA (совместное присутствие) — два положительных результата говорят о разгаре острой фазы заболевания.
IgG говорит либо о хронизации заболевания либо о выздоровлении и выработке иммунитета к инфекционному агенту.

В зависимости от содержания анализа в бланке могут быть представлены данные в виде таблицы с перечислением всех антител или антигенов с пометками об отрицательной или положительной реакции, либо будет указано количественное значение результата (отрицательный, слабоположительный, положительный или резко положительный). Последний вариант определяет, сколько антител содержится в анализируемом образце.

Еще один количественный показатель — индекс авидности антител, выраженный в процентах. Он указывает, сколько времени прошло от начала инфекционного процесса (чем выше индекс — тем больше).

Сегодня выпускаются тысячи видов тест-систем ИФА, позволяющих обнаруживать специфические антитела и антигены при самых разных патологиях. Поэтому этот анализ используется практически во всех медицинских отраслях. Диагноз, поставленный с помощью ИФА, — это гарантия назначения адекватной терапии и эффективного лечения заболевания.

Информативность ИФА делает этот анализ важным инструментом в работе многих медицинских центров. Но можно ли доверять такую диагностику государственным лабораториям или лучше самим выбрать, где провести такое исследование?

І. Заболевания свиней

▪ Актинобациллезная плевропневмония
▪ Атрофический ринит
▪ Африканская чума свиней (АЧС)
▪ Болезнь Ауески
▪ Грипп А свиней
▪ Классическая чума свиней (КЧС)
▪ Лептоспироз
▪ Парвовирусная инфекция свиней (ПВИС)
▪ Пастереллез
▪ Репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС)
▪ Ротавирусная инфекция свиней (РВС)
▪ Сибирская язва
▪ Трансмиссивный гастероэнтерит свиней (ТГС)
▪ Туберкулез
▪ цирковирусная инфекция свиней (ЦВС-2)
▪ Энзоотическая пневмония (микоплазмоз)
▪ Эпизоотическая диарея свиней (ЭДС)

ІІ. Заболевания крупного рогатого скота (КРС)

▪ Блютанг
▪ Бруцеллез
▪ Вирусная диарея КРС
▪ Гиподерматоз
▪ Инфекционный ринотрахеит
▪ коронавирусная инфекция КРС
▪ Лейкоз
▪ Лептоспироз
▪ Лихорадка долины Рифт
▪ Парагрипп-3
▪ Респираторно-синцитиальная инфекция КРС
▪ ротавирусная инфекция КРС
▪ Сибирская язва
▪ Туберкулез
▪ Ящур

III. Заболевания мелких домашних животных

▪ Аденовирусная инфекция плотоядных
▪ Лептоспироз
▪ Парвовирусная инфекция собак
▪ Панлейкопения кошек
▪ Чума собак
▪ Энтерит норок

Диагностические исследования инфекционных заболеваний мелких домашних животных
Кат. №	Наименование заболевания	Вид исследования		Исследуемый биоматериал	Диагностический набор
69	Аденовирусная инфекция плотоядных	Выявление антител к аденовирусу	РН	сыворотка крови
70	Аденовирусная инфекция плотоядных	Обнаружение антигена аденовируса плотоядных	ИФА	фекалии, моча, назальные и фарингеальные смывы, дефибринизированная кровь	Набор для выявления антигенов аденовирусов плотоядных иммуноферментным анализом (ИФА)
71	Лептоспироз	Выявление антител к патогенным лептоспирам	РМА	cыворотка крови
72	Лептоспироз	Обнаружение патогенных лептоспир	ПЦР	сердце, почки, перикард. жидкость, спинномозговая жидкость, кровь, моча, сперма	Тест-система для обнаружения патогенных лептоспир методом полимеразной цепной реакции
73	Парвовирусная инфекция собак	Обнаружение антигена парвовируса собак	ИФА	фекалии, дефибринизированная кровь, кишечник	Набор для выявления антигена парвовирусного энтерита собак, панлейкопении кошек и вирусного энтерита норок (Парво-Тест)
74	Панлейкопения кошек	Обнаружение антигена вируса панлейкопении кошек	ИФА	фекалии, дефибринизированная кровь, кишечник	Набор для выявления антигена парвовирусного энтерита собак, панлейкопении кошек и вирусного энтерита норок (Парво-Тест)
75	Чума собак	Выявление антител к вирусу чумы собак (ВЧП)	РН	сыворотка крови
76		Обнаружение антигена вируса чумы собак	ИФА	назальные и конъюнктивальные смывы, дефибринизированная кровь, головной мозг	Набор для выявления антигена вируса чумы собак иммуноферментным анализом (ИФА)
77		Обнаружение вируса чумы собак	ПЦР	печень, почки, легкие, назальные и конъюнкти-вальные смывы, кровь, фекалии	Тест-система для обнаружения вируса чумы плотоядных методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)
78	Вирусный энтерит норок	Обнаружение антигенов возбудителя энтерита норок	ИФА	фекалии, дефибринизированная кровь, кишечник	Набор для выявления антигена парвовирусного энтерита собак, панлейкопении кошек и вирусного энтерита норок (Парво-Тест)
79	иммунодефицит кошек	Обнаружение антител к антигену р24 вируса иммунодефицита кошек	ИХМ	сыворотка крови, плазма крови	Набор для выявления антител к вирусу иммунодефицита кошек (ВИД-Тест)
80	Вирусная лейкемия кошек	Обнаружение антигена р24 вируса лейкемии кошек	ИХМ	сыворотка крови, плазма крови	Набор для выявления вируса лейкемии кошек (Лейко-Тест)
81	Инфекционный перитонит кошек	Обнаружение антител к коронавирусам кошек	ИФА	сыворотка крови	Набор для диагностики инфекционного перитонита кошек иммуноферментным анализом (ИФА)

IV. Заболевания птиц

▪ Грипп А
▪ Инфекционный бронхит кур (ИБК)
▪ Инфекционная бурсальная болезнь птиц (ИББ)
▪ Лейкоз
▪ Микоплазмоз
▪ Ньюкаслская болезнь (НБ)
▪ Реовирусная болезнь птиц (РВП)
▪ Синдром снижения яйценоскости (ССЯ)
▪ Энцефаломиелит птиц (ЭП)

Диагностические исследования инфекционных заболеваний птиц
Кат. №	Наименование заболевания	Вид исследования	Тест-система	Исследуемый биоматериал
Кат. №	Наименование заболевания	Вид исследования	Тест-система	И с следуемый биоматериал
82.	Грипп А птиц	Выявление антител к вирусу гриппа А	ИФА	cыворотка крови
83.		Обнаружение вируса гриппа А	ПЦР	трахея, легкие, печень, трахеальные и клоакальные смывы
84.		Обнаружение и дифференциация вируса гриппа А подтипов Н5 и Н7	ПЦР	трахея, легкие, печень, трахеальные и клоакальные смывы
85.		ПЦР для обнаружения и дифференциации вируса гриппа А подтипа Н5N1	трахея, легкие, печень, трахеальные и клоакальные смывы
86.		Обнаружение и дифференциация вируса гриппа А подтипов Н5	ПЦР в реальном времени	трахея, легкие, печень, трахеальные и клоакальные смывы
87.	Инфекционный бронхит кур (ИБК)	Выявление антител к вирусу ИБК	ИФА	cыворотка крови
88.	Инфекционная бурсальная болезнь птиц (ИББ)	Выявление антител к вирусу ИББ	ИФА	cыворотка крови
89.	Лейкоз	Обнаружение вируса лейкоза птиц	ИФА	cыворотка крови, белок яиц
90.	Лейкоз	Обнаружение и дифференциация вирусов лейкоза птиц типов A-D и J	ПЦР	лимфоузлы, белок яиц, вагинальные и клоакальные смывы, кровь
91.	Микоплазмоз	Выявление антител к Mycoplasma Gallisepticum и Mycoplasma Synoviae	ИФА	cыворотка крови
92.	Ньюкаслская болезнь (НБ)	Выявление антител к вирусу НБ	ИФА	cыворотка крови
93.	Ньюкаслская болезнь (НБ)	Выявление антител к вирусу НБ	РТГА	cыворотка крови
94.	Реовирусная болезнь птиц	Выявление антител к реовирусу птиц (РВП)	ИФА	cыворотка крови
95.	Синдром снижения яйценоскости (ССЯ)	Выявление антител к вирусу ССЯ	РТГА	cыворотка крови
96.	Энцефаломиелит птиц (ЭП)	Выявление антител к вирусу ЭП	ИФА	cыворотка крови

- Иммуноферментный анализ (ИФА)

Метод основан на взаимодействии антигена со специфическими антителами и применим как для выявления антигена, так и для детекции специфических антител. К основным преимуществам ИФА относятся: высокая чувствительность, использование микроколичеств реагентов, относительная быстрота проведения анализа (3-4 часа). Возможность автоматизации всех стадий процесса с последующей компьютерной обработкой результатов позволяет применять данный метод для проведения массовых серологических исследований.

- Иммунохроматографическая экспресс-диагностика

Новый высокотехнологичный метод, позволяющий получить результат в течение 5-20 минут. Другими преимуществами данной тест-системы являются ее высокая специфичность и уникальная чувствительность, позволяющие детектировать следовые количества антигена в исследуемом патматериале.

- Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Метод молекулярной биологии, позволяющий значительно увеличить количество специфических фрагментов ДНК возбудителя, находящейся в биологическом материале в малых концентрациях. Метод основан на ферментативном многократном копировании определенного участка ДНК возбудителя in vitro, благодаря чему выявлять инфицированных животных можно задолго до появления у них клинических симптомов заболевания.

- Реакция нейтрализации (РН)

- Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

Серологическая реакция, основанная на подавлении специфическими антителами гемагглютинирующей активности вируса. Достоинствами данного метода являются простота, специфичность, относительная бытрота (5-6 ч).

- Реакция микроагглютинации на стекле (РМА)

Серологический метод, широко применяющийся для диагностики лептоспироза, являющийся достаточно простым, и в то же время высокочувствительным и специфичным.

Достоверность результатов диагностических исследований во многом зависит от качества проб патматериала и сыворотки крови, направляемых в лабораторию.
Сыворотка крови должна быть без признаков гемолиза, бактериального и грибкового роста, объем 1 пробы должен составлять не менее 2-3 мл. Каждая проба сыворотки должна быть герметично упакована и промаркирована. Пробы замораживают и хранят при 18˚С и ниже. Не допускается многократное замораживание-оттаивание проб.
Для исследования постинфекционного иммунитета сыворотки крови отбирают не ранее 3-х недель от начала заболевания (в случае репродуктивно-респираторного синдрома – не ранее 3-х недель после аборта), на напряженность поствакцинального иммунитета – не ранее 3-х недель после вакцинации. При эпизоотологическом мониторинге хозяйств отбирают парные пробы сывороток с интервалом в 2-3 недели.
Пробы патматериала отбирают от 2-4 особей со сходными клиническими признаками заболевания не позднее 2-3 часов после гибели животных. Пробы герметично упаковывают, маркируют и замораживают.

Материал для диагностических исследований следует транспортировать в замороженном состоянии, в максимально короткие сроки с сопроводительными документами, в которых указываются: наименование хозяйства, почтовый адрес, банковские реквизиты, контактное лицо, номера телефона и факса, E-mail, даты отбора проб, опись проб со сквозной и индивидуальной нумерацией, желательно с указанием клинико-эпизоотологических данных, пола и возраста животных, сведения о вакцинации, перечень инфекций, которые необходимо исключить.

В. Лабораторная диагностика

2.6. Патологический материал

От больных животных берут кровь в период лихорадочного состояния, а также фракции лейкоцитов, мазки из носа и конъюнктивы. От свежих трупов (не менее чем 3-4) мазки-отпечатки со слизистых оболочек глаз, век, носовой полости и других отделов респираторного тракта, мочевого пузыря, миндалин, лимфатических узлов, кусочки лёгкого, трахеи, селезёнки, почек, головного мозга, мочевой пузырь.

Для серологических исследований берут кровь как можно быстрее после проявления клинических признаков и повторно спустя 14-21 день. Материал отправляют нарочным в термосе со льдом. Подготовку материала для выделения вируса проводят общепринятым методом.

2.10. Индикация вируса

Был предложен экспресс-метод индикации в РИГА антител к вирусу чумы плотоядных, позволяющий получить результат в течение 3 часов. Желательно исследовать парные пробы сывороток (с определенным интервалом), чтобы проследить рост или спад титров антител, однако и однократного взятия бывает достаточно для заключения о состоявшемся контакте непривитого животного с вирусом чумы. По чувствительности несколько превосходит РН.

Предлагалось много других методов — РДП, РСК и др., но широкое их применение не состоялось. Не оправдал себя и гистопатологический метод выявления цитоплазматических телец-включений в эпителии слизистых оболочек (мочевого пузыря и др.) из-за того, что после прививки живой вирус-вакциной образуются аналогичные включения (Уласов В.И., 2001) и др. Кроме того, ряд авторов признают, что на результат гистологических исследований влияют профессионализм исследователя, качество и давность приготовления красителей, наличие секундарной микрофлоры у павшего животного. И, наконец, обнаружение включений в клетках различных тканей должно быть интерпретировано только как предостережение, т.к. многие дегенеративные поражения клеток, фагоцитоз, другие вирусные инфекции (герпесвирусная, бешенство) могут приводить к образованию сходных структур. В то же время ультраструктурные и иммуногистохимические исследования предоставляют возможность отдифференцировать эти включения и избежать ошибок. Однако поствакцинальные включения надежнее всего можно исключить лишь с учетом времени прививок — вакцинный вирусный антиген сохраняется в лимфоидной системе норок 6-12 дней (Blixenkrone-Moller М., 1989), у собак — еще дольше. Геллер В.И. и др. (2003) указывают, что поствакцинальные включения у пушных зверей исчезают через 60 дней. Однако, как бы то ни было, диагностика по тельцам-включениям или вирусному антигену даже с учетом вышеизложенного не может быть точной, так как в зависимости от давности заражения они могут или не развиться, или уже исчезнуть. Официально этот метод не зарегистрирован в нашей стране, однако его используют как дополнительный тест при постановке диагноза.

Однако в нашей стране все еще производится индикация вируса с помощью таких методов, как РДП, РИФ, МФА.

Реакция диффузной преципитации (РДП). Преципитирующий АГ появляется в органах животных на 3-4-й день болезни и всегда обнаруживается в органах павших животных. В качестве антигенов используют 10%-ую суспензию органов больных животных (селезенка, лимфоузлы, костный мозг, тимус, головной мозг, легкие, печень, почки, слюнные железы, поджелудочная железа, моча, перитоне-альная жидкость). Свиньи - хорошим источником антисывороток против ВЧП (2,4,5).

Реакция иммунофлуоресценции (РИФ). Позволяет поставить быстрый и ранний прижизненный диагноз. У хорьков самые надежные результаты при исследовании мазков крови. РИФ используют также для исследования кусочков органов от павших животных. Наиболее пригодны мозжечок, желудок, легкие, большой и продолговатый мозг. В РИФ антигены вируса чумы обнаруживали в мазках костного мозга, фиксированных ацетоном, в лейкоцитах крови и эпителиальных клетках конъюнктивы. В мононуклеарных клетках крови его обнаруживали на 2-3-й день после экспериментального заражения. Ряд авторов рекомендуют применять ИФ для обнаружения вирусного АГ в ЦНС, а также проводить гистологическое исследование препаратов мочевого пузыря, почечной лоханки и кожи.

Иммуноферментный анализ (ИФА) позволяет обнаружить вирус в секретах и экскретах животных одновременно с появлением клинических признаков болезни. Shestopalov A.M. et al. (1996), Сазонкин В.Н. (1998) успешно испытали твердофазный точечный ИФА на нитроцеллюлезе (dot-ИФА) для индикации вируса чумы собак в окулоназальных выделениях. Однако при исследовании паренхиматозных органов павших пушных зверей в некоторых зверохозяйствах Приморья встречались случаи ложных положительных результатов. Изредка такие же результаты можно получить и после вакцинации, но в большинстве случаев вакцинный вирус не выявлялся.

Метод флуоресцирующих антител (МФА) при чуме собак применяют уже более 20 лет как рутинный при экспресс-диагностике. Широкое признание получил прямой метод, когда меченные ФИТЦ антитела наносят непосредственно на мазки-отпечатки. По чувствительности он незначительно уступает иммуноферментному анализу (ИФА). Однако в редких случаях у вакцинированных собак против чумы отмечена неспецифическая положительная реакция. Сущность метода заключается в соединении меченых антител со специфическим антигеном и в обнаружении светящихся комплексов антиген - антитело под люминесцентным микроскопом.

Вирусоскопия, электронная и иммуноэлектронная микроскопия широко не используются.

2.11. Выделение вируса.

Выделение вируса осуществляется методом биопробы на чувствительных системах. В качестве материала берут кровь от больных собак в начальной стадии в период повышения температуры тела, а от павших - патматериал: селезенку, печень, почки, головной мозг. Готовят 10%-ю суспензию на физиологическом растворе или питательной среде, центрифугируют и внутримышечно вводят щенкам собак или тхорзофреткам. За подопытными животными ведут наблюдение в течение 1-1.5 месяцев. Наиболее чувствительными являются тхорзофретки, которые погибают через 7-10 суток с характерными клиническими признаками чумы. Щенки собак могут погибнуть значительно позже (1.5-2 месяца), иногда нельзя получить четких результатов, так как многие животные являются носителями антител к вирусу чумы плотоядных. Несмотря на то что этот метод дорогостоящий, он позволяет в короткий срок получить положительные результаты.

В первых пассажах вирс чумы плотоядных вызывает лишь слабое помутнение ХАО и гибель КЭ в 5-10% случаев. При дальнейшем пассировании поражение ХАО становится более выраженным. О наличии вируса судят по специфической гибели эмбрионов, поражению ХАО и РГА. При инокуляции в желточный мешок гибель эмбрионов наблюдается на 7-11-е сутки, титр вируса достигает 105-106 ЕЛД50/мл.

2.12. Идентификация выделенного вируса

Идентификация вируса проводится с помощью всех тех реакций, которые я рассматривала в главе 2.10, с добавлением реакции нейтрализации (РН), которая, к тому же, редко используется.

Её применяют для идентификации вируса в культуре клеток. Сущность реакции состоит в том, что к зараженной культуре добавляют питательную среду с 5%-ной специфической сыворотки сразу же после контакта вируса с культурой клеток. По подавлению ЦПД вируса судят о специфичности поражений клеточного монослоя.

2.13. Доказательство этиологической роли выделенного вируса

Доказательство этиологической роли выделенного вируса чумы собак ничем особо не отличается от остальных. Для этого используют парные сыворотки крови в серологических реакциях. В качестве АГ используют выделенный вирус, а в качестве АТ – парные сыворотки. Повышение титра антител во второй сыворотке в 4 и более раз свидетельствует о этиологической роли выделенного вируса.

2.14. Ретроспективная серодиагностика

Серологическая диагностика применяется лишь в экспериментальных целях. Серологические тесты, основанные на исследовании сывороток крови собак в РН и РНГА, показывают, что титры специфических антител к ВЧП широко варьируют у разных пород собак в зависимости от давности и тяжести течения инфекции.

Для ретроспективной диагностики ЧП используются РН, РСК, РДП. Объектом исследования в данном случае являются пробы сыворотки крови переболевших животных. Реакции выполняются общепринятыми методами. Наличие AT, выявляемых в любой из указанных реакций, в сыворотке крови животных свидетельствует о переболевании их чумой. Для выявления AT к ВЧП предложены РНГА, которая не уступает ELISA (29).

А.В. Васильев в 1996 г. разработали набор на основе сенсибилизированных эритроцитов, содержащий все необходимые компоненты в готовом виде: специфический ВЧП, эритроцитарный диагностикум, специфическую и отрицательную к ВЧП сыворотки, разбавитель и микропанель для постановки реакции. Набор можно использовать в ветеринарных лабораториях и других специализированных учреждениях. РНГА по сравнению с РН более чувствительна, совпадаемость результатов превышает 90%. В РНГА улавливают AT не только к поверхностным АГ вируса, но и ко всем вирионным белкам, а также выявляют AT в более низких титрах, ещё не улавливаемых в РН. При исследовании сывороток крови, полученных в динамике развития болезни, устанавливается 4-кратное увеличение титра AT (диагностический прирост титра) уже на 5-7-е сут. после первого взятия крови. Таким образом, РНГА, осуществляемая с помощью набора эритроцитарных диагностикумов, - быстрый, чувствительный, специфический и воспроизводимый метод выявления антител к вирусу чумы плотоядных. С помощью набора можно быстро подтвердить или исключить клинический диагноз - чума, при этом в спорных случаях образцы сыворотки необходимо дополнительно обработать меркаптоэтанолом для тестирования специфических IgM. Показано, что латексный AT диагностикум эффективен на ранней стадии болезни. Обнаружение антигенов к вирусу чумы плотоядных также возможно с использованием радиоактивных ДНК-РНК-зондов.

Читайте также: