Набор для выявления антител к вирусу ньюкаслской болезни в ртга

Возбудителем ньюкаслской болезни является РНК-содержащий парамиксовирус птиц типа 1 ( APMV -1), относящийся к семейству Paramyxoviridae . Ра зличные штаммы вируса ньюкаслской болезни могут вызывать у птиц заболевания разной степени тяжести, вплоть до 100% смертности.

В настоящее время для выявления антител к вирусу НБ в крови домашних и диких птиц широко используют реакцию торможения гемагглютинации (РТГА). Наряду с РТГА также используют различные варианты иммуноферментного анализа. Достоинствами этого метода являются экспрессность, возможность стандартизации условий постановки реакции. Коммерческие иммуноферментные наборы для выявления антител к вирусу НБ, в основном, основаны на непрямом варианте ИФА и предназначены для исследования сывороток крови кур и индеек. Конкурентный вариант ИФА позволяет исследовать сыворотки крови на наличие антител к определённому антигену вне зависимости от видовой принадлежности птицы и вследствие этого может применяться для мониторинговых исследований.

Цель и задачи. Целью данных исследований было разработать тест-систему на основе конкурентного варианта ИФА (К-ИФА) для выявления специфических к вирусу ньюкаслской болезни антител в сыворотках крови различных видов домашней, дикой и синантропной птицы.

Постановка К-ИФА. 0,5-1,0 мкг/мл на лунку вирусного антигена в карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,6) вносили в лунки 96-луночного пластикового планшета ( Nunc , Immunoplate , Дания), инкубировали в течение ночи при 4°С, блокировали 1% раствором бычьего сывороточного альбумина в трис- HCl буферном растворе с 0.1% твин-20 (ТБР-Т) рН 7,4 в течение 1 ч при комнатной температуре и затем отмывали трёхкратно ТБР-Т. Исследуемые и контрольные сыворотки разводили в ТБР-Т, вносили в лунки планшета с антигеном, затем вносили конкурентные антитела (коммерческий препарат моноклональных антител к штамму Ла Сота вируса НБ) в рабочем разведении (всё в объёме 50 мкл на лунку) и инкубировали 30 минут при 37°С. Связавшиеся антитела определяли добавлением иммунопе- роксидазных препаратов антимышиных антител (ГУНИИЭМ им. НФ. Гамалеи (Москва)) в рабочем разведении и планшеты инкубировали при 37°С 30 минут. После удаления несвязавшегося конъюгата добавляли субстратно-индикаторную смесь АБТС. Реакцию останавливали добавлением 1% додецилсульфата натрия и измеряли значение оптической плотности при 405 нм на спектрофотометре-ридере. Значения ОП контрольных и исследуемых проб переводили в значение процента ингибиции (ПИ) по формуле:

ОП иссл.пробы с МАт ОП _КОНТр_ОЛЯ ф_она

РТГА. Проводили по общепринятой методике.

Результаты. В результате проведённых исследований были оптимизированы условия постановки реакции К-ИФА. В качестве рабочего разведения испытуемых и контрольных сывороток крови птиц выбрано разведение 1:2; рабочее разведение конкурентных антител и антивидового конъюгата, определённое в прямом варианте ИФА по блок-схеме, составило 1:1000, рабочее разведение антигена вируса НБ, определённое в непрямом варианте ИФА-1:500.

Для объективной оценки иммунного ответа был установлен позитивно — негативный порог. Для этого 570 сывороток крови от невак- цинированной домашней и дикой птицы, показавших отрицательный результат при исследовании в РТГА на наличие антител к вирусу НБ, тестировали в К-ИФА. В качестве положительного и отрицательного контроля были взяты стандартные контрольные сыворотки. ПНП определяли путем расчета среднего значения PI и стандартного отклонения. Результат реакции считали отрицательным - при значении PI равном 40% и ниже; сомнительным — при PI — от 41 до 50% и положительным при значении PI — 51% и выше.

Специфичность антигена ВНЕ проверяли в К-ИФА с набором гетерологичных сывороток, в качестве которых использовали референтные сыворотки крови кур к вирусам инфекционных болезней и микоплазмам птиц. Было показано, что активность антигена вируса НБ с гетерологичными сыворотками не превышала фоновый уровень (реакция с неиммунной сывороткой).

С помощью К-ИФА было исследовано 264 сыворотки крови птиц разных видов. Все исследуемые сыворотки крови птиц параллельно тестировали в РТГА. Результаты исследования представлены в таблице.

Таблица 1. Результаты исследования сывороток крови домашней, дикой и синантропной птицы на наличие антител к вирусу НБ в К-ИФА и РТГА

1.1. Настоящие методические указания предназначены для серологического контроля напряженности иммунитета к ньюкаслской болезни (НБ), оценки эффективности иммунизации, определения оптимальных сроков вакцинации (ревакцинации) птицы, а также для контроля эпизоотической ситуации по НБ в хозяйствах.

1.2. Методика основана на обнаружении в сыворотке крови специфических к вирусу НБ антител (антигемагглютининов) в реакции торможения гемагглютинации.

1.3. Сроки серологического обследования поголовья определены Наставлениями по применению вакцин против НБ и могут быть скорректированы исходя из эпизоотической ситуации в конкретном хозяйстве.

1.4. Исследованию подлежат не менее 26 проб сывороток крови от птиц, взятых из различных мест птичника (зала) в объеме не менее 0,5 см 3 .

1.5. Результаты каждого серологического исследования должны быть зарегистрированы в специальном журнале и проанализированы ветеринарным врачом хозяйства.

2.1. Оборудование и реактивы:

- испытуемые сыворотки птиц;

- 0,7 или 1 %-ная взвесь эритроцитов петуха на физиологическом или фосфатно-буферном растворе (pH 7,2 - 7,4) для исследований в микро- и макроварианте соответственно;

- микротитраторы одно- и восьмиканальные любой модели с варьируемым или стабильным объемом в пределах 0,025 - 0,05 см 3 .

2.2. Подготовка антигена,

2.2.1. Вакцину в ампулах (флаконах) ресуспендируют в физиологическом растворе до исходного объема вируса.

2.3. Приготовление взвеси эритроцитов петуха.

Кровь берут из подкрыльцовой вены во флаконы с 2 - 3 %-ным раствором лимонно-кислого натрия на физиологическом растворе (pH 7,2 - 7,4) в соотношении 1:2, трижды отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования при 1500 об/мин 10 мин. Из осадка эритроцитов на физиологическом растворе (pH 7,2 - 7,4) готовят 0,7 или 1 %-ную суспензию. Хранить суспензию можно в условиях холодильника (4 °С) до появления признаков гемолиза эритроцитов.

Кроме нативных, в работе могут быть использованы стабилизированные (формалинизированные) эритроциты петуха.

2.4. Получение сыворотки крови.

2.4.1. Кровь берут из подкрыльцовой вены или путем скарификации гребня, собирают в стерильные пробирки, предварительно увлажненные стерильным физиологическим раствором. Образовавшийся сгусток отделяют от стенок тонким металлическим стержнем или пастеровской пипеткой и выдерживают при комнатной температуре в течение 12 - 18 ч или при температуре 37 °С (термостат) в течение 60 мин, а затем 8 - 10 ч при 4 °С (холодильник). Отстоявшуюся сыворотку сливают в чистые пробирки и исследуют в РТГА.

2.4.2. Для удаления термолабильных ингибиторов сыворотку крови прогревают на водяной бане при 56 °С в течение 30 мин.

2.5. Реакцию торможения гемагглютинации проводят в два этапа:

- определение гемагглютинирующего титра вируса в реакции гемагглютинации (РГА) для расчета рабочей дозы;

- определение титра антител в пробах сыворотки крови.

Реакцию ставят макро- или микрометодом.

Для постановки РГА готовят двукратные разведения вакцинного вируса от 1:2 до 1:4096. С этой целью во все лунки одного ряда полистероловой микропанели микро-титратором разливают физиологический раствор (0,05 или 0,25 см 3 ), в первую вносят в равном объеме вакцинный вирус, трехкратно пипетируют и переносят 0,05 или 0,025 см 3 во вторую лунку и т.д. Из последней лунки 0,05 или 0,025 см 3 удаляют и обезвреживают в 2 %-ном растворе едкого натра.

После разведения вируса во все лунки вносят 0,7 %-ную суспензию эритроцитов петуха в объеме, равном исходному объему физиологического раствора. Микропанели аккуратно встряхивают и оставляют при комнатной температуре (18 - 20 °С). Учет реакции проводят после оседания эритроцитов в контроле.

Для контроля эритроцитов на спонтанную гемагглютинацию и определения времени учета реакции в две лунки с физиологическим раствором (0,05 или 0,025 см 3 ) добавляют равный объем эритроцитов.

Реакция может быть поставлена макрометодом в полистероловых макропанелях, для чего все компоненты берут в объеме 0,2 см 3 . При этом в работе используют 1 %-ную суспензию эритроцитов петуха.

2.5.2. Для постановки РТГА готовят рабочую дозу исследуемого вируса (4 ГАЕ) исходя из его титра.

Для этого исходный вирус разводят физиологическим раствором во столько раз, сколько получают от деления его титра на 4.

Например: титр вируса 1:256. Для приготовления рабочего разведения необходимо взять 63 см 3 физиологического раствора и 1 см 3 исходного вируса (256:4 - 64).

Объем рабочей дозы вируса определяют, исходя из количества подлежащих исследованию сывороток. Для постановки РТГА микрометодом на исследование 1 сыворотки требуется 0,6 или 0,3 см 3 4 ГАЕ вируса (в зависимости от первоначального объема физиологического раствора), макрометодом - 2,4 см 3 .

2.5.3. Рабочую дозу вируса готовят непосредственно в день постановки реакции с обязательным контролем 4 ГАЕ.

Для этого в 4 лунки разливают физиологический раствор в объемах, выбранных для постановки реакции. В первую добавляют равный объем рабочей дозы вируса и титруют согласно п. 2.5.1.

Учет реакции проводят после оседания эритроцитов в контроле.

Полная агглютинация в третьей лунке означает, что доза вируса завышена, а отсутствие агглютинации в первой или во второй лунках свидетельствует о недостаточном его количестве. Корректирование рабочей дозы (увеличение или уменьшение) проводят добавлением вируса или физиологического раствора с обязательным повторным контролем 4 ГАЕ.

2.6. Постановка РТГА.

2.6.1. Для постановки реакции во все лунки полистероловой микро- или макропанели вносят физиологический раствор в объеме 0,05 (0,025) или 0,2 см 3 . Затем в первую лунку добавляют равный объем испытуемой сыворотки, трижды пипетируют и готовят ряд последовательных двукратных разделений (с 1:2 до 1:4096).

После этого во все лунки вносят рабочее разведение вируса в объеме 0,05 (0,025) или 0,2 см 3 , осторожно встряхивают и после 26 - 30 мин контакта сыворотки с вирусом в каждую лунку добавляют двойной объем (по отношению к объему физиологического раствора) суспензии эритроцитов,

- сыворотки на изоагглютивацию (сыворотка + физиологический раствор в равных объемах + 1 %-ная суспензия эритроцитов в двойном объеме). Агглютинация должна отсутствовать;

- эритроцитов на спонтанную агглютинацию (суспензия эритроциты + физиологический раствор в равных объемах). Агглютинация должна отсутствовать.

2.7. Интерпретация полученных результатов.

2.7.1. По результатам РТГА определяют эффективность иммунизации в партии привитых цыплят путем деления суммарного количества проб с титром антител 1:8 и выше (после применения живых вакцин) или 1:16 и выше (после применения инактивированных вакцин) на общее число исследованных сывороток и выражают в процентах.

2.7.2. Птицу считают невосприимчивой к НБ при эффективности иммунизации 80 и более процентов после применения живых вирусвакцин и 90 и более процентов после использования инактивированных препаратов.

2.7.8. При эффективности иммунизации менее 80 % после применения живых вирусвакцин или менее 90 % после применения инактивированных вирусвакцин птица подлежит повторной вакцинации.

2.7.5. Снижение или стабилизация уровня антител и (или) уменьшение количества птиц с высоким уровнем антител при повторных исследованиях проб сыворотки крови свидетельствует об отсутствии циркуляции в хозяйстве эпизоотического вируса и является следствием поствакцинальных реакций.

2.7.6. Нарастание титров и (или) увеличение количества птиц с высоким уровнем антител при отсутствии клинических и патологоанатомических признаков НБ не является основанием для объявления хозяйства неблагополучным по данному заболеванию, но предусматривает установление за птицей тщательного наблюдения, проведения систематических серологических и вирусологических исследований.

2.7.7. Нарастание титров и (или) увеличение количества птице высоким уровнем антител при наличии клиникопатологоанатомических признаков заболевания служит основанием для проведения детального эпизотологического обследования хозяйства и установление окончательного диагноза по данному заболеванию.

2.7.8. Обнаружение антител к вирусу ньюкаслской болезни у птиц, не привитых против НВ, без клинических и патолоанатомических признаков заболевания свидетельствует о циркуляции полевых лентогенных штаммов вируса ньюкаслской болезни и не является основанием для объявления хозяйства неблагополучным по НВ. За птицей таких хозяйств устанавливают постоянное наблюдение.

Методические указания по определению уровня антител к вирусу ньюкаслской болезни в реакции торможения гемагглютинации разработаны сотрудниками лаборатории препаратов, применяемых в птицеводстве Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов.

Ньюкаслская болезнь (НБ, псевдочума птиц) — высококонтагиозная вирусная инфекция главным образом куриных, характеризующаяся пневмонией, энцефалитом и поражением внутренних органов.

Характеристика возбудителя. Возбудитель ньюкаслской болезни — вирус семейства Paramyxoviridae. Вирион размером от 120 до 300 нм содержит односпиральную минус-РНК. Оболочка вирионов имеет выступы в форме нитей длиной 8 нм и содержит белки (гемагглютинин, нейраминидазу и фермент слияния). Внутренний компонент вириона — РНК с расположенными по спирали на ней капсомерами (белок S). Внутренняя поверхность оболочки представлена мембранным белком.

В составе вируса обнаружены 3 основных и 5 минорных белковых компонентов. К основным относятся гемагглютинин, белок внутренней оболочки и белок S. Нейраминидаза — один из минорных компонентов. Белок F₀ (слияния) играет основную роль в вирулентности вируса.

Устойчивость к физико-химическим воздействиям. Инфекционность, гемагглютинирующая активность и иммуногенность вируса разрушаются при 56 °С в период до 6 ч. Гемагглютинирующие свойства сохраняются при более длительной инактивации, чем инфекционные. Установлено, что вирулентность штаммов прямо не связана с термостабильностью гемагглютининов. В замороженном состоянии вирус сохраняет активность более двух лет.

Инфекционность вируса снижается под воздействием дневного света. Вирус устойчив к изменениям pH в диапазоне от 2 до 10, быстро разрушается при воздействии ультразвука. Дезинфицирующие растворы быстро убивают вирус.

Антигенная структура. Вирус содержит гемагглютинин и нейраминидазу, белки М, F и S (РНП)-антигены, различающиеся по локализации в вирионе, иммуногенности и антигенной активности.

Антигенная вариабельность и родство. Подавляющее большинство полевых и вакцинных штаммов вируса НБ в антигенном и иммунобиологическом отношениях сходно. Некоторые природно-ослабленные штаммы широко используют в качестве живых вакцин. Инфекционность вируса более чувствительна к термальной инактивации, чем его гемагглютинирующая активность.

Полевые и вакцинные штаммы в антигенном и иммунологическом отношениях сходны. Природные штаммы различаются по тропизму к нервной, легочной и энтеральной тканям, что и обусловливает различные формы болезни. Вирулентность у штаммов разная: велогенные штаммы — высоко-, мезогенные — средне- и лентогенные — маловирулентны.

Антигенная активность. Все формы НБ вызываются идентичными в антигенном отношении штаммами и протекают с образованием вируснейтрализующих, антигемагглютинирующих и комплементсвязывающих антител. Наивысший титр антител наблюдают через 3—4 нед, через 8—12 мес их не отмечают.

Геммагглютинирующие и гемадсорбирующие свойства. Вирус ньюкаслской болезни обладает гемагтлютинирующими (с эритроцитами кур, морских свинок, мышей, человека), гемадсорбирующими и гемолитическими свойствами, а также высокой интерфероногенной активностью.

Культивирование. Вирус НБ хорошо культивируется не только на восприимчивой птице, но и на куриных эмбрионах, изолированных ХАО, в культуре фибробластов КЭ, некоторых первичных и перевиваемых клетках. Репродукция вируса в культуре клеток сопровождается уплотнением цитоплазмы клеток, появлением в ней вакуолей; через 40 ч в цитоплазме некоторых клеток обнаруживают большое количество малых аморфных, эозинофильных включений.

Экспериментальная инфекция. Отмечена неодинаковая инфекционность различных штаммов вируса. Заболевание легко воспроизводится на курах, цыплятах и индюшатах вирулентными штаммами при любом методе заражения. К экспериментальному заражению восприимчивыми оказались перепела, воробьи, голуби, тетерева. При парентеральном заражении некоторые штаммы оказались патогенными для морских свинок, кошек, собак и других млекопитающих.

Клинические признаки. Инкубационный период длится от 5 до 15 дней. Симптомы болезни довольно разнообразны. Различают четыре формы клинического проявления болезни.

При первой форме — нервной — наблюдают угнетение, слабость, расстройство функций органов дыхания, диарею с водянистыми фекалиями зеленоватого цвета с примесью крови, паралич лап и крыльев. Основной патологоанатомический признак при этой форме — геморрагическое поражение пищеварительного тракта. Смертность достигает 90 %.

Вторая форма болезни характеризуется поражением органов дыхания (кашель, удушье) и нервной системы. Летальность — от 10 до 50 %.Такая форма НБ вызывается мезофильными штаммами.

Третья форма болезни — наиболее легкая. Проявляется незначительными изменениями респираторного и герминативного трактов, что сопровождается прекращением яйценоскости на 1—3 нед, кашлем.

Четвертая форма болезни протекает без клинических признаков и диагностируется серологически или выделением вируса.

Патологоанатомические изменения. При остром течении болезни они характеризуются воспалением слизистых оболочек носа и ротовой полости, полосчатыми кровоизлияниями на слизистой оболочке пищевода. У 60—70 % взрослых кур отмечают точечные кровоизлияния в виде пояска на границе железистого и мышечного отделов желудка. В тонком кишечнике отмечают появление очагов некроза и эрозии, в толстом — везикулярные папулы. В селезенке, печени, лимфоузлах и тимусе обнаруживают атрофию и некроз. Головной и спинной мозг гиперемированы.

Проникая в организм через слизистые оболочки, вирус попадает в кровеносные сосуды, в эндотелии которых размножается. Порозность стенок сосудов нарушается, и в них развиваются воспалительно-некротические процессы. Вирус, разнесенный с кровью по организму, вызывает расстройство гемодинамики с некрозодистрофическими изменениями.

Локализация вируса. Вирус локализуется в паренхиматозных органах, костном и головном мозге, мышцах, трахеальной слизи, толстом и тонком кишечниках. В период выраженной клинической картины болезни он выделяется во внешнюю среду с фекалиями, трахеальной слизью и выдыхаемым воздухом.

В организме неиммунных птиц вирус можно выделить только в начале болезни (до 10 дней). У иммунных птиц его удается определить более продолжительное время (до 19 дней) и только из железистого желудка, лимфоидных образований слепой кишки, фабрициевой сумки и мозга. Бессимптомное персистирование вируса НБ в организме иммунных птиц возможно в течение 70 дней. Персистирование может обусловить вирусоносительство и вирусовыделение, т. е. поствакцинальный иммунитет не исключает циркуляции полевых вело — и мезогенных штаммов вируса.

Источник инфекции — больная птица. Заражение здоровой птицы происходит при контакте с больной, а также через инфицированные корм и воду. Инфекция быстро распространяется аэрогенно. Больная птица выделяет вирус уже в инкубационном периоде.

Отмечено быстрое распространение заболевания при перевозке тушек вынужденно убитой птицы, использовании необезвреженной одежды, обуви. При инкубации яиц от больной птицы зародыш погибает от вируса.

Имеются данные о передаче вируса некоторыми паразитами. Так, вирус внедрялся в Ascaridae galli, из которой его можно выделить. Такую же роль играют кокцидии.

В естественных условиях вирус удавалось выделять от домашних (индейки, цесарки, утки), синантропных (голуби, вороны, галки) и диких птиц. Высказано предположение о том, что голуби — естественные носители лентогенных штаммов НБ. У норок, погибших в Голландии в 1970—1972 гг., развивался менингоэнцефалит в результате поедания потрохов инфицированной НБ птицы. Описаны случаи заражения НБ людей, у которых развивался конъюнктивит.

Диагностика. Диагноз ставят на основании эпизоотологических исследований, клинических признаков, патологоанатомических данных и результатов лабораторных исследований.

Лабораторная диагностика. В лабораторию направляют трахею, легкие, селезенку, печень, головной мозг (или голову) от свежего трупа курицы. От нескольких кур одного птичника получают парные сыворотки: в начале заболевания и спустя 2—3 нед.

Обнаружение вируса биопробой и выделение его проводят на 9—10-дневных куриных эмбрионах путем заражения их в аллантоисную полость. Через 48—72 ч эмбрионы гибнут. В аллантоисной полости при этом обнаруживают вирус с помощью РГА с эритроцитами кур. При отсутствии признаков размножения вируса на куриных эмбрионах проводят следующий пассаж (до трех раз).

Реже выделяют вирус на культуре клеток (куриных фибробластах). Через двое суток вирус вызывает ЦПД, дает положительную РГАд. В культуральной вируссодержащей жидкости в РГА обнаруживают вирус в существенно меньших титрах, чем в аллантоисной жидкости куриных эмбрионов.

В некоторых случаях ставят биопробу на неиммунных цыплятах 2—4-месячного возраста путем внутримышечного заражения. Болезнь проявляется в течение 10—12 дней.

Идентификацию вируса НБ и дифференциацию его от вируса гриппа кур, сходного по течению болезни, проводят с помощью РТГА. Для этой цели используют специально выпускаемый набор диагностических сывороток.

Перспективны новые методы обнаружения и идентификации вируса ньюкаслской болезни в ИФА, РИГА и ПЦР. Методы высокочувствительны и экспрессны.

Ретроспективная диагностика. Основана на установлении динамики титра антител в парных сыворотках в РТГА. Учитывая тот факт, что на всех птицефабриках кур регулярно вакцинируют живыми вакцинами, НБ может протекать атипично или даже латентно. Не исключена возможность выделения вакцинного вируса. Поэтому задача лаборатории — определить патогенность выделенного вируса. Доказательством патогенности выделенного вируса и персистенции эпизоотического штамма в стаде служат следующие признаки:

гибель зараженных куриных эмбрионов через 60—72 ч после заражения (велогенные штаммы) или через 90 ч (мезогенные штаммы);
полевые изоляты имеют в РГА низкие титры (16—128 ГАЕ), а вакцинные штаммы — высокие (более 256 ГАЕ);
индекс внутримозговой вирулентности (метод Хенсона) на однодневных цыплятах для велогенных штаммов более 1,5, а для лентогенных — 0,2;
у непривитой птицы, подвешенной в клетке, в неблагополучном птичнике, через 3 нед появляются антитела к вирусу НБ;
у вакцинированной птицы через 3—4 мес после вакцинации регистрируют внезапное повышение уровня антител;
поствакцинальные титры антител существенно ниже постинфекционных;
повышение за период между двумя исследованиями числа серопозитивных животных свидетельствуют о распространении инфекции.

Иммунитет и специфическая профилактика. Естественно переболевшая или вакцинированная птица приобретает иммунитет, продолжительность и напряженность которого зависит от возраста птицы, биологических свойств вируса и метода введения его в организм.

Специфическая профилактика ньюкаслской болезни сегодня проводится большей частью живыми вакцинами. В СНГ широко применяют сухие вирусвакцины из штаммов Н, В1, LaSota, Бо/74/ВГНКИ. В профилактике НБ важна разработка оптимальной схемы иммунизации птицы. Наиболее подходящий возраст для первой вакцинации 10—14-й день, а для ревакцинации 5—6-я неделя.

Преимущество гранулированных форм вакцин из штаммов V4 (Австрия) и Roakin — более высокая термостабильность; их можно транспортировать без рефрижератора и смешивать с любым кормом. Пероральная вакцинация штаммом V4 стимулирует лимфоидные ткани кишечного тракта, что индуцирует секреторные иммуноглобулины и обеспечивает защиту даже при низком уровне циркуляторных гуморальных антител.

В механизме формирования ранней невосприимчивости к вирусу НБ ведущая роль принадлежит факторам клеточного иммунитета. Защитное действие гуморальных антител проявляется значительно позже.

Инактивированные вакцины против НБ готовят из вируса, размноженного в КЭ и убитого формальдегидом, β-пропиолактоном или этиленамином. Инактивированные вакцины обычно применяют в сочетании с живыми. Хороший защитный эффект получали прививая однодневных цыплят живой вакциной, а через 3 и 8 нед — инактивированной.

Обнадеживающий результат дает конструирование вируса оспы птиц, экспрессирующий гемагглютинин-нейраминидазный протеин вируса НБ. Считается, что данная векторная система может быть использована не только для получения генноинженерной вакцины против НБ, но и мультивалентной вакцины, экспрессирующей гены таких патогенных для птиц вирусов, как болезнь Марека, инфекционный ларинготрахеит, инфекционная брусальная болезнь и инфекционный бронхит кур.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Методические указания
по определению уровня антител к вирусу ньюкаслской болезни в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)
(утв. Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 23 июня 1997 г. N 988)

1. Общие положения

1.2. Методика основана на обнаружении в сыворотке крови специфических к вирусу НБ антигел (антигемагглютининов) в реакции торможения гемагглютинации.

1.3. Сроки серологического обследования поголовья определены Наставлениями по применению вакцин против НБ и могут быть скорректированы, исходя из эпизоотической ситуации в конкретном хозяйстве.

1.4. Исследованию подлежат не менее 25 проб сывороток крови от птиц, взятых из различных мест птичника (зала) в объеме не менее 0,5 см(3).

2. Методика постановки реакции торможения гемагглютинации

2.1. Оборудование и реактивы:

- антиген сухой вирусвакцины против НБ из штаммов "Ла-Сота", "В1" или "ГАМ-61" или экстраэмбриональная жидкость куриных эмбрионов, инфицированных этими штаммами, с гемагглютинирующим титром не ниже 1:8;

- испытуемые сыворотки птиц;

- 0,7 - или 1%-ная взвесь эритроцитов петуха на физиологическом или фосфатно-буферном растворе (рН 7,2-7,4) для исследований в микро- и макроварианте соответственно;

- микротитраторы одно- и восьмиканальные любой модели с варьируемым или стабильным объемом в пределах 0,025-0,05 см(3);

2.2. Подготовка антигена.

2.2.1. Вакцину в ампулах (флаконах) ресупендируют в физиологическом растворе до исходного объема вируса.

2.3. Приготовление взвеси эритроцитов петуха.

Кровь берут из подкрыльцовой вены во флаконы с 2-З%-ным раствором лимонно-кислого натрия на физиологическом растворе (pH 7,2-7,4) в соотношении 1:2, трижды отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования при 1500 об/мин 10 мин. Из осадка эритроцитов на физиологическом растворе (рН 7,2-7,4) готовят 0,7 - или 1%-ную суспензию. Хранить суспензию можно в условиях холодильника (+4°С) до появления признаков гемолиза эритроцитов.

Кроме нативных в работе могут быть использованы стабилизированные (формалинизированные) эритроциты петуха.

2.4. Получение сыворотки крови.

2.4.1. Кровь берут из подкрыльцовой вены или путем скарификации гребня, собирают в стерильные пробирки, предварительно увлажненные стерильным физиологическим раствором. Образовавшийся сгусток отделяют от стенок тонким металлическим стержнем или пастеровской пипеткой и выдерживают при комнатной температуре (18-20°С) в течение 12-18 ч или при температуре 37°С (термостат) в течение 60 мин, а затем 8-10 ч при +4°С (холодильник). Отстоявшуюся сыворотку сливают в чистые пробирки и исследуют в РТГА.

Для удаления термолабильных ингибиторов сыворотку крови прогревают в водяной бане при 56°С в течение 30 мин.

2.5. Реакцию торможения гемагглютинации проводят в два этапа:

- определение гемагглютинирующего титра вируса в реакции гемагглютинации (РГА) для расчета рабочей дозы;

- определение титра антител в пробах сыворотки крови.

Реакцию ставят макро- или микрометодом.

2.5.1. Постановка реакции гемагглютинации.

Для постановки РГА готовят двукратные разведения вакцинного вируса от 1:2 до 1:4096. С этой целью во все лунки одного ряда полистероловой микропанели микротитратором разливают физиологический раствор (0,05 или 0,25 см3), в первую вносят в равном объеме вакцинный вирус трехкратно пипетируют и переносят 0,05 или 0,025 см3 во вторую лунку и т.д. Из последней лунки 0,05 или 0,025 см3 удаляют обезвреживают в 2%-ном растворе едкого натрия.

После разведения вируса во все лунки вносят 0,7%-ную суспензию эритроцитов петуха в объеме, равном исходному объему физиологического раствора. Микропанели аккуратно встряхивают и оставляют при комнатной температуре (18-20°С). Учет реакции проводят после оседания эритроцитов в контроле.

Для контроля эритроцитов на спонтанную гемагглютинацию определения времени учета реакции в две лунки с физиологическим растворам (0,05 или 0,025 см3) добавляют равный объем эритроцитов.

РГА оценивают положительно при оседании эритроцитов в виде хорошо выраженного "зонтика", отрицательно - в виде "пуговки". За титр вируса принимают его наибольшее разведение, дающее четко выраженную агглютинацию в виде "зонтика". Получение нечетких результатов может быть связано с изменившимся рН физиологического раствора.

Реакция может быть поставлена макрометодом в полистероловых макропанелях, для чего все компоненты берут в объеме 0,2 см3. При этом в работе используют 1%-ную суспензию эритроцитов петуха.

2.5.2. Для постановки РТГА готовят рабочую дозу исследуемого вируса (4ГАЕ), исходя из его титра.

Например: титр вируса 1:256. Для приготовления рабочего разведения необходимо взять 63 см3 физиологического раствора и 1 см3 исходного вируса (256:4=64).

Объем рабочей дозы вируса определяют, исходя из количества подлежащих исследованию сывороток. Для постановки РТГА микрометодом на исследование 1 сыворотки требуется 0,6 или 0,3 см3 4 ГАЕ вируса (в зависимости от первоначального объема физиологического раствора), макрометодом - 2,4 см3.

2.5.3. Рабочую дозу вируса готовят непосредственно в день постановки реакции с обязательным контролем 4 ГАЕ.

Учет реакции проводят после оседания эритроцитов в контроле.

При правильном определении рабочей дозы в первой, второй лунках должна быть полная агглютинация ("зонтик"), в третьей - частичная, в четвертой - отсутствие агглютинации ("пуговка").

Полная агглютинация в третьей лунке означает, что доза вируса завышена, а отсутствие агглютинации в первой или во второй лунках - свидетельствует о недостаточном его количестве. Корректирование рабочей дозы (увеличение или уменьшение) проводят добавлением вируса или физиологического раствора с обязательным повторным контролем 4 ГАЕ.

2.6. Постановка РТГА.

2.6.1. Для постановки реакции во все лунки полистероловой микро- или макропанели вносят физиологический раствор в объеме 0,05 (0,025) или 0,2 см3. Затем в первую лунку добавляют равный объем испытуемой сыворотки, трижды пипетируют и готовят ряд последовательных двукратных разделений (с 1:2 до 1:4096).

После этого, во все лунки вносят рабочее разведение вируса в объеме 0,05 (0,025) маи 0,2 см3, осторожно встряхивают и после 25-30 мин контакта сыворотки с вирусом в каждую лунку добавляют двойной объем (по отношению к объему физиологического раствора) суспензии эритроцитов.

- сыворотки на изоаггютинацию (сыворотка + физиологический раствор в равных объемах + 1%-ная суспензия эритроцитов в двойном объеме). Агглютинация должна отсутствовать;

2.6.3. Реакцию учитывают через 25-40 мин. При наличии в сыворотке антител наблюдают торможение гемагглютинации - эритроциты выпадают в осадок в виде "пуговки".

Титром сыворотки считают наибольшее ее разведение, дающее полное торможение гемагглютинации 4 ГАЕ вируса НБ.

2.7. Интерпретация полученных результатов.

2.7.3. При эффективности иммунизации менее 80% после применения живых вирусвакцин или менее 90% после применения инактивированных вирусвакцин птица подлежит повторной вакцинации.

2.7.4. Обнаружение в РТГА высокого уровня антител (1:2048 и выше у птиц, привитых живыми вакцинами, и 1:4096 и выше у птиц, привитых инактивированными вакцинами) свидетельствует о возможной циркуляции в стаде полевого вируса ньюкаслской болезни. В таких случаях через 21-З0 дней проводят повторное исследование проб сывороток крови, полученных от этих же птиц.

2.7.7. Нарастание титров и (или) увеличение количества птиц с высоким уровнем антител при наличии клиникопатологоанатомических признаков заболевания служит основанием для проведения детального эпизотологического обследования хозяйства и установление окончательного диагноза по данному заболеванию.

2.7.8. Обнаружение антител к вирусу ньюкаслской болезни у птиц, не привитых против НБ без клинических и патолоанатомических признаков заболевания свидетельствует о циркуляции полевых лентогенных штамов вируса ньюкаслской болезни и не является основанием для объявления хозяйства неблагополучным по НБ. За птицей таких хозяйств устанавливают постоянное наблюдение.

С утверждением настоящих Методических указаний на территории Российской Федерации отменяются Методические указания по серологическому контролю напряженности иммунитета при ньюкаслской болезни птиц с помощью реакции задержки гемагглютинации N 115-6а от 18.05.79 г.

Методические указания по определению уровня антител к вирусу ньюкаслской болезни в реакции торможения гемагглютинации разработаны сотрудниками лаборатории препаратов. применяемых в птицеводстве Всероссийского Государственного научно-исследовательского института контроля. стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов.

Заместитель начальника
Департамента ветеринарии

Откройте актуальную версию документа прямо сейчас или получите полный доступ к системе ГАРАНТ на 3 дня бесплатно!

Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.

Методические указания по определению уровня антител к вирусу ньюкаслской болезни в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) (утв. Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 23 июня 1997 г. N 988)

Текст методических указаний официально опубликован не был

Читайте также: