Определение ротавирусов методом ифа
Внешний вид вирусных частиц напоминает колесо с широкой ступицей, короткими спицами и четко очерченным ободком, поэтому их стали называть ротавирусами (лат. rotа — колесо). Рисунок 1. Слизистая оболочка толстой кишки при ротавирусном гаст
 |
| Рисунок 1. Слизистая оболочка толстой кишки при ротавирусном гастроэнтерите. Минимально выраженный катаральный колит. х 100. |
Ротавирусы представляют собой род семейства Reoviridae, который объединяет большое количество сходных по морфологии и антигенной структуре вирусов, вызывающих гастроэнтерит у человека, млекопитающих и птиц. Систематическое изучение ротавирусов человека началось с 1973 года, когда они были обнаружены при электронной микроскопии ультратонких срезов биоптатов слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки, полученных от больных острым гастроэнтеритом детей Австралии (Р. Бишоп и соавторы). В том же году Т. Флеветт обнаружил сходный вирус в копрофильтратах больных гастроэнтеритом методом электронной микроскопии при негативном контрастировании препаратов.
Вирусные частицы имеют диаметр от 65 до 75 нм. При проникновении контрастирующего вещества в вирион выявляется электронно-плотный центр диаметром 38 — 40 нм, который представляет собой так называемую сердцевину, окруженную электронно-прозрачным слоем. Внешний вид вирусных частиц напоминает колесо с широкой ступицей, короткими спицами и четко очерченным ободом, поэтому их стали называть ротавирусами (лат. rota — колесо).
Ротавирусы имеют две белковые оболочки — наружный и внутренний капсиды. Сердцевина содержит внутренние белки и генетический материал, представленный двунитчатой фрагментированной РНК. Геном ротавирусов человека и животных состоит из 11 фрагментов, которые могут быть разделены при электрофорезе в полиакриламидном геле (ПААГ) или агарозе. В составе ротавирусов обнаружено четыре антигена; основной из них — это групповой антиген, обусловленный белком внутреннего капсида. С учетом группоспецифических антигенов все ротавирусы делятся на пять групп: A, B, C, D, E. Ротавирусы одной группы имеют общий групповой антиген, который выявляется иммунологическими реакциями: иммуноферментный анализ, иммунофлюоресценция, иммунная электронная микроскопия и др. Большинство ротавирусов человека и животных относятся к группе A.
| Источником инфекции при ротавирусном гастроэнтерите является инфицированный человек — больной манифестной формой заболевания или бессимптомно выделяющий ротавирусы с фекалиями |
Источником инфекции при ротавирусном гастроэнтерите является инфицированный человек — больной манифестной формой заболевания или бессимптомно выделяющий ротавирусы с фекалиями. Вирусы в фекалиях заболевших появляются одновременно с развитием клинических симптомов, наибольшая концентрация их в кале (до 109 — 1011 вирусных частиц в 1 г) регистрируется в первые 3 — 5 дней болезни. В эти дни больные представляют наибольшую эпидемиологическую опасность для лиц, контактирующих с ними. Наиболее частым источником заболевания для детей первого года жизни являются инфицированные ротавирусом матери; для взрослых и детей более старшего возраста — дети, в основном из детских коллективов. Возможность заражения человека от животных не доказана.
Патогенез ротавирусной инфекции характеризуется проникновением вируса в эпителиоциты слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, преимущественно тонкой кишки, что приводит к их повреждению и отторжению от ворсинок. Вследствие этого на ворсинках тонкой кишки появляются функционально и структурно незрелые энтроциты с низкой способностью синтезировать пищеварительные ферменты. При ротавирусном гастроэнтерите это проявляется снижением уровня дисахаридаз, развивается вторичная дисахаридазная недостаточность, при которой в просвете тонкой кишки накапливаются нерасщепленные дисахариды, что создает повышенное осмотическое давление и приводит к выводу в просвет кишечника воды и электролитов из тканей организма. Это является основной причиной диареи и дегидратации и определяет основные клинические проявления болезни.
Ротавирусный гастроэнтерит как инфекционное заболевание имеет циклическое течение. Инкубационный период продолжается чаще всего от 12 — 24 часов до двух суток. Клиническая картина ротавирусного гастроэнтерита характеризуется в основном острым началом, однако в ряде случаев может иметь место продромальный период длительности от 12 до 48 — 72 часов. В этот период больные отмечают недомогание, общую слабость, повышенную утомляемость, снижение аппетита, головную боль, познабливание, урчание и неприятные ощущения в животе, умеренно выраженные катаральные явления: заложенность носа, першение в горле, легкий кашель.
В клинической картине ротавирусного гастроэнтерита в период развернутых клинических проявлений ведущими являются синдромы гастроэнтерита и интоксикации. Выраженность диареи и обусловленной ею той или иной степени дегидратации организма, а также токсикоза, продолжительность этих симптомов в значительной мере определяет тяжесть течения заболевания.
Синдром гастроэнтерита характеризуется развитием диареи, снижением аппетита, появлением урчания и болей в животе, тошноты и рвоты. Наиболее типичен для ротавирусного гастроэнтерита обильный водянистый пенистый стул желтого или желто-зеленого цвета. У больных с легким течением заболевания стул может быть кашицеобразным. Как правило, патологические примеси в стуле отсутствуют. Боль локализуется преимущественно в верхней половине живота или является диффузной, она может быть разной интенсивности. Почти всегда она сопровождается громким урчанием в животе.
Синдром интоксикации появляется в самом начале заболевания. Слабость, зачастую резкая, является наиболее частым проявлением этого синдрома; реже отмечается головная боль. При более тяжелом течении имеют место головокружение, обморочное состояние, коллапс. Обращает на себя внимание следующая особенность ротавирусного гастроэнтерита: два ведущих в клинической картине болезни синдрома развиваются в процессе заболевания не всегда однонаправленно; у некоторых больных на фоне сравнительно слабо выраженных диспепсических явлений могут наблюдаться резко выраженные симптомы общей интоксикации, особенно слабость.
Повышение температуры тела не всегда может отмечаться при ротавирусном гастроэнтерите, особенно у взрослых. У некоторых больных может быть озноб без повышения температуры. В то же время нередко в разгар заболевания выраженность лихорадочной реакции варьируется от субфебрильных цифр и выше и может достигать 38 — 39°С как у детей, так и у взрослых.
Важным в диагностическом плане для ротавирусного гастроэнтерита считается сочетание двух ведущих клинических синдромов с симптомами поражения верхних дыхательных путей. Катаральный синдром встречается приблизительно у 50% больных и проявляется в виде гиперемии и зернистости слизистых оболочек мягкого неба, небных дужек, язычка, задней стенки глотки, а также насморка, заложенности носа, кашля, болей в горле. В ряде случаев катаральные симптомы наблюдаются уже в продромальном периоде, до проявления симптомов гастроэнтерита.
В разгар болезни отмечается изменение функционального состояния сердечно-сосудистой системы, чаще у пациентов с более тяжелым течением и при наличии сопутствующих заболеваний органов кровообращения. У большинства пациентов отмечается тенденция к артериальной гипертензии, тахикардия, определяется глухость сердечных тонов при аускультации. У больных с тяжелым течением заболевания, как правило, возникают обмороки и коллапсы из-за выраженных расстройств гемоциркуляции, в генезе которых наряду с токсическими воздействиями существенное значение имеет гиповолемия. Потери жидкости и электролитов вследствие рвоты и диареи могут быть значительными и приводят к развитию дегидратации. Клинические проявления дегидратации зависят от ее степени. При легком и среднетяжелом течении ротавирусного гастроэнтерита отмечается жажда, сухость во рту, слабость, бледность (дегидратация I — II степени), при тяжелом течении наряду с этими симптомами наблюдаются также осиплость голоса, судороги мышц конечностей, акроцианоз, снижение тургора кожи, уменьшение диуреза (дегидратация III степени).
В связи с развитием при ротавирусном гастроэнтерите возможных осложнений, главным образом циркуляторных расстройств, острой сердечно-сосудистой недостаточности, нарушений гомеостаза, выделяют группы больных повышенного риска, в которые включают новорожденных, детей младшего возраста, лиц пожилого возраста, а также больных с тяжелыми сопутствующими заболеваниями. Описанные в литературе и наблюдавшиеся нами случаи ротавирусного заболевания с летальным исходом относятся именно к этим группам.
Выделяются две основные клинические формы ротавирусного заболевания — гастроэнтерическая и энтерическая. Симптомы только острого гастрита (гастритический вариант) встречаются в 3 — 10% случаев. Функциональные и морфологические нарушения со стороны желудочно-кишечного тракта, возникающие при ротавирусном гастроэнтерите в случае наличия у пациентов фоновой гастроэнтерологической патологии, нередко способствуют развитию таких осложнений основного заболевания, как обострение сопутствующих болезней: хронического гастрита, энтероколита, панкреатита, часто в сочетании с выраженными явлениями дисбактериоза кишечника, требующими коррекции при лечении.
При ротавирусном гастроэнтерите гемограмма изменяется следующим образом: в остром периоде заболевания с высокой частотой выявляются лейкоцитоз с нейтрофилезом и повышенная СОЭ. В периоде реконвалесценции картина крови обычно нормализуется полностью. Изменения урограммы у большинства больных имеют кратковременный характер и проявляются чаще всего небольшой протеин-, лейкоцит- и эритроцитурией; в редких случаях в моче появляются гиалиновые цилиндры в незначительном количестве. При тяжелом течении заболевания нарушения функции почек могут быть более выраженными, с повышением уровня мочевины крови, олигоурией или анурией, снижением клубочковой фильтрации. На фоне проводимой терапии указанные изменения быстро исчезают и при повторных обследованиях не отмечаются.
В качестве примера, иллюстрирующего особенности клинического течения ротавирусного гастроэнтерита, приводим выписку из истории болезни.
Лечение: обильное питье солевых растворов, парентеральная регидратационная и дезинтоксикационная терапия — трисоль 1000 мл внутривенное капельное введение, внутрь ферментные препараты: абомин, панкреатин, тансол, карболен. Течение заболевания без осложнений. На третий день болезни — субфебрильная температура, оставалась слабость; боли в животе прекратились. Стул кашицеобразный до пятого дня от начала заболевания. Полное выздоровление наступило на седьмой день болезни.
Дифференциальный диагноз у больных ротавирусным гастроэнтеритом проводят с другими острыми кишечными инфекциями как вирусной так и бактериальной этиологии, прежде всего в тех случаях, когда в клинической картине на первый план выступает синдром гастроэнтерита: с вирусными диареями различной этиологии (аденовирусы, коронавирусы, астровирусы, калицивирусы, вирус Норфолк, энтеровирусы Коксаки и ЕСНО); с гастроинтестинальной формой сальмонеллеза, с гастроэнтеритическим и гастроэнтероколитическим вариантами острой дизентерии, с пищевыми токсикоинфекциями, вызванными условно-патогенными бактериями; с холерой.
Обнаружение специфических антител и нарастание их титра в сыворотке крови больных и переболевших ротавирусным гастроэнтеритом при помощи серологических реакций с целью текущей диагностики на практике в настоящее время широкого распространения не получило и используется в основном для ретроспективного анализа различных эпидемиологических ситуаций.
Методы обнаружения вирусспецифической РНК, которые можно назвать высокочувствительными и специфичными, имеют, однако, ряд недостатков, ограничивающих их практическое применение (необходимость наличия специальной аппаратуры, реактивов, квалифицированного персонала и др.) Наиболее простой метод в этой группе — электрофорез ротавирусной РНК в полиакриламидном геле. Этот метод, позволяющий идентифицировать штаммы вирусов, вызвавшие заболевание, и дать характеристику штаммов, циркулирующих на данной территории, в основном применяется при эпидемиологических исследованиях.
 |
| Рисунок 2. Слизистая оболочка толстой кишки при ротавирусном гастроэнтерите. Минимальное содержание плазматических клеток в собственной пластинке, увеличение в ней числа макрофагов. х 400 |
В клинической практике врач нередко сталкивается с обстоятельствами (сомнительные результаты вирусологических и серологических исследований, случаи микст-инфекций), когда возникает необходимость в применении дополнительных методов для верификации диагноза. С этой целью может быть использован доступный для практического здравоохранения интрументальный метод исследования — ректороманоскопия с аспирационной биопсией слизистой оболочки толстой кишки. При гистологическом, морфометрическом и гистохимическом исследованиях биоптатов при ротавирусном гастроэнтерите выявляются характерные изменения в виде поверхностного минимально выраженного катарального колита с незначительной дистрофией эпителия (рис. 1), снижения числа серотонинсодержащих желудочно-кишечных эндокриноцитов (ЕС-клетки) в эпителиальном пласте кишечных желез, умеренной инфильтрацией собственной пластинки плазматическими клетками и увеличением в ней числа макрофагов (рис. 2). Эти особенности имеют дифференциально-диагностическое значение, поскольку отличаются указанным показателем от других острых кишечных инфекций, что может быть использовано в диагностически сложных случаях.
Здравоохранение в настоящее время не располагает препаратами, обладающими специфическим антиротавирусным действием, поэтому терапия ротавирусного гастроэнтерита является патогенетической. Основные ее цели — борьба с дегидратацией, токсикозом и связанными с ними наиболее часто встречающимися при ротавирусном гастроэнтерите нарушениями функции жизненно важных органов — сердечно-сосудистой системы и органов мочевыделения, степень выраженности которых во многом определяет тяжесть течения заболевания и его прогноз.
Для правильного выбора характера и объема проводимой регидратационной терапии в первую очередь необходимо установить степень дегидратации у того или иного пациента. При эксикозе I — II степени следует ограничиваться пероральной регидратационной терапией (препараты регидрон, глюксолан и др.). При дегидратации III степени целесообразно прибегать к комбинированной парентеральной и пероральной регидратации. Для парентеральной регидратации применяют растворы трисоль, квартасоль, ацесоль и др. С целью дезинтоксикации и улучшения гемодинамики при среднетяжелом и тяжелом течении заболевания показаны коллоидные растворы (гемодез, полиглюкин и др.).
| Для ротавирусной инфекции характерно сочетание гастроэнтерита, интоксикации и симптомов поражения верхних дыхательных путей |
Современными представлениями о патогенезе диарейного синдрома при ротавирусном гастроэнтерите обусловлено и назначение соответствующих средств, способствующих нормализации состояния пищеварительного тракта, а также диеты. Учитывая нарушения активности ряда пищеварительных ферментов, в частности лактазы, рекомендуется исключить в острый период заболевания из пищевого рациона больных молоко и молочные продукты. Кроме того, по этой же причине целесообразно ограничивать и пищу, богатую углеводами. В связи с вышеизложенным, в острый период необходимы энзимные препараты (панзинорм-форте, фестал и др). Кроме того, в остром периоде заболевания могут быть использованы адсорбирующие и вяжущие средства, способствующие ускоренному формированию стула (смекта, карболен и др.) также возможно применение хилака-форте. Высокой частотой дисбактериозов кишечника различной степени выраженности у больных ротавирусным гастроэнтеритом обусловлена необходимость применения в комплексной терапии бактерийных биологических препаратов. Лучшая терапевтическая эффективность при ротавирусном гастроэнтерите отмечена при применении лактосодержащих бактерийных биологических препаратов (ацилакт, лактобактерин и др.), что, по-видимому, связано с заместительным действием бактериальной лактазы, содержащейся в лактобактериях. В последние годы в комплексной терапии ротавирусного гастроэнтерита начал применяться комплексный иммуноглобулиновый препарат (КИП), который разработан и выпускается в МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского. Это первый отечественный иммуноглобулиновый препарат для энтерального применения. КИП характеризуется повышенной концентрацией антител к микроорганизмам, возбудителям острых кишечных инфекций, в том числе ротавирусам, сальмонеллам, шигеллам, эшерихиям и др. Применение КИП в комплексной терапии больных ротавирусным гастроэнтеритом оказывает отчетливый положительный терапевтический эффект, существенно сокращая продолжительность интоксикации и диареи, что открывает новые возможности в лечении этого заболевания.
Литература
1. Букринская А. Г., Грачева Н. М., Васильева В. И. Ротавирусная инфекция. М., 1989.
2. Дроздов С. Г., Покровский В. И., Шекоян Л. А., Машилов В. П. и др. Ротавирусный гастроэнтерит. М., 1982.
3. Новикова А. В. и др. Архив патологии, 1989, №6.
4. Щербаков И. Т. и др. Архив патологии, 2995, №3.
5. Юшук Н. Д., Царегородцев А. Д.. Лекции по инфекционным болезням. М., 1996.
Иммуноферментный анализ, предложенный более двадцати лет назад на пересечении иммунохимии и инженерной энзимологии, стал в настоящее время одним из распространенных методов исследований. Явным преимуществом данного метода, к которому относятся простота выполнения, доступность и стабильность реагентов, экспрессивность и возможность автоматизации для проведения массовых анализов, является обеспечение его прочного положения в клинической биохимии при диагностике заболеваний растений и животных, в научных исследованиях.
Иммуноферментный анализ был предложен в начале 70-х гг. тремя независимыми группами исследователей — Engval, Pormann в Швеции, van Neamen, Schumes в Нидерландах, Rubenslen et al. в США. При этом методе антиген (или антитело), вступающие в иммунологическую реакцию, метится ферментом. По превращению ферментом добавляемого субстрата можно судить о количестве вступившего во взаимодействие компонента реакции антиген-антитело. Чувствительность иммуноферментного анализа позволяет определить минимальные количества (нанограммы) белка антигена или антител.
Обнаружение специфических антител в физиологических жидкостях играет важную роль в клинической диагностике широкого круга заболеваний как инфекционного, так и аутоиммунного характера. Для этих целей были разработаны ряд разнообразных методов, в том числе РСК, РНГА, РИФ, РЗГА, латекс-агглютинация. Применяя эти методы для количественного определения реагента, требуется титрование в серийных разведениях. Кроме того, одним из недостатков вышеуказанных тестов является трудоемкость, невысокая точность и значительный элемент субъективности. Это связанно с тем, что, как правило, сложно отличить с достаточной надежностью слабую положительную реакцию от отрицательной.
Благодаря иммуноферментному анализу появилась возможность проводить количественные измерения в широком диапазоне концентраций с использованием лишь единичного разведения сыворотки или плазмы. Этот метод позволяет легко различать по активности антитела, принадлежащие к различным классам иммуноглобулинов.
Правильный подбор соответствующих антигенов, связанных с носителями, подходящий антииммуноглобулиновый конъюгат, содержащий ферментную метку, позволяют создать системы тестирования множества различных антигенов, основанных на одном и том же наборе манипуляций.
Постановка твердофазного иммуноферментного анализа на полистироловых панелях с целью выявления противовирусных антител имеет следующие стадии:
-иммобилизация растворимых антигенов на твердой фазе;
-отмывание несвязавшегося антигена буферным раствором с детергентом;
-связывание активных центров твердой фазы инертным белком;
-взаимодействие иммобилизированных антигенов с исследуемыми антителами и образование комплекса антиген-антитело;
-выявление комплекса антиген-антитело с помощью антииммуноглобулиновой сыворотки или белка А золотистого стафилококка, меченных ферментом;
-выявление с помощью субстратной смеси количества связанного фермента.
После прохождения реакции ее учитывают визуально или спектрофотометрически.
Для выявления антигенов вирусов в биологических жидкостях также используют твердофазный иммуноферментный анализ. Для выявления вирусных антигенов наиболее часто используют метод двойных антител или “сэндвич”-вариант. При этом в лунки полистироловых панелей иммобилизируют специфический гамма-глобулин, выделенный из специфической к данному антигену сыворотки.
Стадии выявления антигена следующие:
-иммобилизация на твердой фазе антител; отмывание их избытка буферным раствором с детергентом; обработка лунок панели инертным белком; внесение исследуемого антигена; отмывание; внесение конъюгата антител с ферментом; внесение субстратной смеси; учет результатов реакции.
Кроме твердофазного иммуноферментного анализа, имеется еще и гистологический вариант, или иммунопероксидазная реакция. Данная реакция аналогична реакции иммунофлуоресценции, но отличается тем, что для постановки иммуноферментного анализа используются антитела, меченные не флуорохромом, а ферментом, а учет реакции проводится под обычным световым микроскопом.
В этом варианте иммуноферментного анализа используются антитела, меченные пероксидазой, так как молекулярная масса (40000) меньше, чем других ферментов и способствует лучшему проникновению пероксидазных конъюгатов через клеточные мембраны. Материалом для выявления вирусспецифических антигенов или вирусов с помощью иммунопероксидазного метода могут служить мазки-отпечатки из различных органов, парафиновые срезы, культура клеток, мазки крови.
При выявлении антигенов используют как прямой, так и непрямой иммунопероксидазные тесты. Для выявления вирусспецифических антигенов прямым иммунопероксидазным методом проводят следующие этапы: фиксация мазков-отпечатков или инфицированного монослоя, внесение конъюгата антител с ферментом, отмывание, внесение субстратной смеси и учет под микроскопом.
Различные варианты ИФА с целью выявления антигенов и антител нашли широкое применение для диагностики вирусных пневмоэнтеритов телят
Техника выявления ротавирусного антигена. Выпускаемый коммерческий набор для ИФА содержит все необходимы реагенты с указанием способа их приготовления и использования.
Из вспомогательных реактивов применяют:
калий фосфатно-буферный раствор, содержащий 0,1М хлористого натрия с конечной рН 7,2-7,4 (ФБР);
твин-калий фосфатный буфер (ТФБР), содержащий 0,05% твина-20 или твина-80 (на 1 литр ФБР добавляют 0,5 мл твин-20 или твин-80). Раствор тщательно перемешивают на магнитной мешалке до полного растворения твина;
субстратная проявляющая смесь: 10 мг 5-аминосалициловой кислоты растворяют в 10 мл подогретой до 30—40°С дистиллированной воды, охлаждают и добавляют 0,1 мл 0,5 М натрия гидроокиси. Затем 10 мг перекиси водорода растворяют в 3-х мл дистиллированной воды и 1 мл вносят в 10 мл раствора 5-аминосалициловой кислоты.
На первом этапе в каждую лунку полистироловых плашек с плоским дном вносят по 0,2 мл иммуноглобулинов в рабочем разведении.
Плашку закрывают крышкой, выдерживают в течение двух часов при 37°С или 16—18 часов при 4°С и по истечению экспозиции удаляют раствор иммуноглобулинов, промывая каждую лунку 3—4 раза ТФБР.
На втором этапе, где в качестве исследуемого материала используют 25—50%-ную суспензию фекалий в разведении 1:50, готовят двойные разведения при визуальной оценке результатов реакции. При спектрофотометрическом учете результатов ИФА в раститровке нет необходимости. Плашки, в которых имеется по 0,2 мл исследуемого антигена, тщательно встряхивают и инкубируют, как описано выше.
В дальнейшем в отмытые лунки вносят по 0,2 мл антиротавирусного конъюгата в рабочем разведении при прежнем режиме взаимодействия реагентов.
На заключительном этапе в каждую лунку вносят по 0,2 мл субстратной смеси и через 40—60 минут производят учет результатов реакции.
Следует отметить, что оптическая плотность образовавшегося продукта реакции прямо пропорциональна содержанию антигена в исследуемой пробе.
При визуальной оценке результатов ИФА, интенсивность окраски лунок с экспериментальными образцами сравнивают с окраской лунок с положительным и отрицательным контролем:
-интенсивное коричневое окрашивание - положительный результат;
-коричневое окрашивание - положительный результат;
-светло-коричневое окрашивание - сомнительный результат;
отсутствие окрашивания - отрицательный результат.
Пробы, при исследовании которых получен сомнительный результат, подлежат повторному исследованию. В случае получения двух сомнительных результатов реакции пробу считают отрицательной.
При инструментальной регистрации результатов иммуноферментного анализа, используются плашки с плоским дном и спектрофотометры или фотоэлектроколориметры при длине волны 450 нм. Позитивным результатом считается показатель реакции с оптической плотностью, превышающей на 0,15 оптических единиц значение с отрицательным контролем.
Диагноз считают установленным в одном из следующих случаев:
—при выявлении вируса, выделенного из исходного вируссодержащего материала от телят с признаками патологии желудочно-кишечного тракта в культуре клеток, при наличии характерного ЦПД с последующей идентификацией в РН, РИФ, РИД, ИФА;
—при индикации характерных вирионов в исследуемом клиническом вируссодержащем материале методом иммуноэлектронной микроскопии;
—при обнаружении ротавирусных антигенов в пробах фекалий или соскобах со слизистой оболочки кишечника в РИФ, РИД, ИФА при наличии клинических и патологоанатомических показателей.
В случае выявления специфических антител при постановке диагноза учитывают наличие характерных симптомов болезни, отсутствие антител у коров-матерей как в крови, так и в молоке. С учетом указанного принимают окончательное решение по этиологии болезни.
У новорожденных телят ротавирусную инфекцию следует дифференцировать от коронавирусного энтерита, аденовирусной инфекции, вирусной диареи, эшерихиоза, парвовирусной инфекции, аназробной энтеротоксемии, а также патологии желудочно-кишечного тракта алиментарного происхождения.
Ротавирус предается через грязные руки фекально-оральным путем. Его без затруднений можно обнаружить в кале у детей. Паразитирует исключительно в эпителии тонкого кишечника. Источник инфекции – человек.
Клинико-диагностический метод
Диагноз ротавирусной инфекции поставить по симптомам невозможно. Можно только предположить о развитии этого заболевания. В определении развития любой инфекционной болезни важен сбор анамнеза (опрос). Врач обязан подробно выяснить, как развивалась болезнь у ребенка:
- когда родители впервые заметили ухудшение состояния малыша;
- какими были первые признаки, этиология – острое начало или постепенное развитие;
- выяснение вероятного источника инфекции, механизм заражения и пути передачи инфекции.
Правильный сбор эпидемиологических данных позволит предположить зарождение и развитие инфекции.
Признаки, характерные для ротавируса:
- в 95% случаев болеют дети от 6 месяцев до 2 лет;
- инкубационный период до 4 дней;
- начало болезни – однократная рвота и незначительное повышение температуры
- затем развивается очень жидкий, водянистый стул;
- в каловых массах никогда не содержатся примеси крови.
Правила забора кала на ротавирусную инфекцию
Для того чтобы результаты исследования были максимально достоверными, необходимо собрать каловые массы следуя определенным правилам. У грудничков кал на ротавирус собирают из подгузника после опорожнения кишечника.
Если ребенок уже пользуется горшком, то перед тем как усадить малыша, нужно провести дезинфекцию. Для этого горшок обдают кипятком несколько раз. На его стенках не должно остаться следов синтетических моющих и обеззараживающих средств.
Кал необходимо собрать сразу после дефекации чистым шпателем, если стул жидкий, можно просто вылить содержимое горшка в емкость для отправки в лабораторию. Общий объем каловых масс не должен превышать 20-30 мл. Тара для биологического материала должна плотно закрываться крышкой.
Для исследования необходимо забирать ту часть кала, где больше всего содержится патологических примесей – слизь, фибриновые пленки, гной, подозрительные частицы. Чем быстрее собрать анализ кала на ротавирус и отправить его в лабораторию, тем достовернее будет результат.
Методы исследования каловых масс на ротавирус
Ротавирусную инфекцию диагностируют несколькими способами. Их цель – определение самого вируса, антигенов к нему, обнаружение вирусной РНК. Серологические методы позволяют поставить точный диагноз за один день.
Это вид серологической диагностики, который широко применяют при инфекционных болезнях. Основан на реакции антиген-антитело. Для этого применяют специальный антиген, который представлен взвесью микроорганизмов, чувствительных эритроцитов и частиц латекса. При взаимодействии взвеси с антителами образуется комплекс, который выпадает в осадок, что свидетельствует о наличии ротавирусной инфекции.
Анализ на реакцию антиген-антитело состоит из двух этапов. Сначала происходит ферментативная реакция, затем – иммунный ответ. Принцип метода – связывание антитела с антигеном.
На специальном устройстве сорбируются антитела. Затем с ними связываются целевые антигены. Это все промывается специальным раствором. Затем наносятся антитела, помеченные специфическим ферментом. Делают еще одну промывку. Формируется комплекс из антигена и двух антител. Затем содержимое окрашивают. Чем интенсивнее цвет в образце, тем большее количество ротавируса находится в каловых массах.
Это реакция нейтрализации вирусов, которая проводится для их идентификации, а также для серологической диагностики вирусных инфекций. Принцип такого тестирования основан на развитии в организме иммунных реакций при заражении.
Для оценки клеточных реакций проводят тесты клеточной токсичности лимфоцитов относительно инфекционных агентов. Определяют способности лимфоцитов на ответную реакцию. Так идентифицируются противовирусные антитела. Реакция делается путем смешивания неизвестного вируса с антисывороткой.
Выбор методов диагностики зависит от каждого конкретного случая. Для лабораторных исследований забирают кал и кровь. Основные диагностические способы определения инфекции:
- РДП – реакция диффузной преципитации.
- Твердообразная реакция коагглютинации.
- РПГ – реакция пассивной агглютинации.
- Иммунофлюоресцентный анализ.
- Радиоиммуный анализ.
- Выделение вируса в культуре клеток.
- ПЦР – полимеразная цепная реакция.
- Электрофорез ротавирусной РНК.
- Метод точечной гибридизации.
- РТГА – реакция торможения гемагглютинации.
- РНГА – реакция непрямой гемагглютинации.
Дифференциальный тест на ротавирусную инфекцию проводят тем пациентам, у которых есть другие острые кишечные инфекции (бактериальные и вирусные). Такая диагностика показана тогда, когда в симптоматике на первый план выходят признаки гастроэнтерита:
- пищевые токсикоинфекции;
- холера;
- острая дизентерия;
- вирусная диарея – аденовирус, астровирус, энтеровирусы ЕСНО и коксаки, вирус норфолк;
- сальмонеллез;
- эшерихиоз.
Определение ротавирусной инфекции в домашних условиях
Если нужно сделать срочный анализ или провести диагностику самостоятельно (в случае если состояние ребенка удовлетворительное и не требует госпитализации), делают тест на ротавирус в домашних условиях. Он не трудоемкий и требует минимальных временных затрат. С его помощью можно 100% определить наличие патогенного микроорганизма в каловых массах.
Иммунохроматографический экспресс-тест на ротавирус основан на применении моноклональных и поликлональных мышиных антител к вирусному антигену. Антитела соединены с красителем и расположены на мембране тестовой кассеты. Тест имеет высокую степень специфичности и чувствительности.
Что входит в состав тест-системы:
- кассеты для теста – 20 шт.;
- одноразовые пипетки – 20 шт.;
- пластиковые пробирки, содержащие по 2 мл экстрагента, – 20 шт.;
- аппликаторы для забора материала – 20 шт.;
- инструкция по использованию тест-системы.
Нельзя использовать систему, если нарушена целостность ее упаковки или истек срок годности. Во время проведения теста пользоваться одноразовыми перчатками.
Кал для исследования берется только после проявления симптомов болезни. Наиболее точные результаты исследования бывают на 3-5 день заболевания.
Приготовление экстрагированной пробы: открыть пластмассовую пробирку и с помощью аппликатора внести в нее кал размером с горошину, затем плотно закрыть и встряхивать до полного растворения кала в экстрагенте. Затем пробирка должна отстояться до того времени, пока крупные частицы не осядут на дно. Для проведения теста реагент должен быть комнатной температуры.
Как проводится тест: достать из упаковки кассету, открыть пробирку с биоматериалом. С помощью пипетки в лунку для проб капнуть 6 полных капель, постепенно давая впитываться каждой предыдущей капле. Максимальное время, сколько готовится результат, составляет 10 минут.
- одна полоска в районе контрольной зоны (С) – результат отрицательный, кал не содержит ротавирус;
- одна цветная полоска в контрольной зоне и одна полоска (четко различимая) в тестовой зоне – результат положительный, в пробе содержится ротавирус;
- если в контрольной зоне отсутствует полоса – тест неопределенный, выполнен некачественно, с нарушением инструкции, необходимо провести повторный анализ с использованием другой тест-кассеты.
Тест подходит только для определения ротавирусной инфекции в каловых массах. Если в испражнениях содержится кровь, это может дать ложноположительный результат.
Ротавирусной инфекцией болеет 100% населения в детском возрасте. Опасность эта патология представляет только для младенцев и детей до 3 лет. Для ребенка она опасна такими осложнениями, как сильное обезвоживание и поражение нервной системы – судороги, вплоть до остановки дыхания. Поэтому важна своевременная и точная диагностика ротавируса, ее дифференциация с другими инфекционными болезнями.
Читайте также: