Основные критерии классификации вирусов

РНК-геномы

1.Одноцепочечная единая РНК, обладающая матричной активностью (позитивная РНК) - вирус полиомиелита и др.

2.Одноцепочечная единая РНК, не обладащая матричной активностью (негативная РНК). Вирион имеет транскриптазу - парамиксовирусы, рабдовирусы и др.

3.Одноцепочечная фрагментированная РНК, не обладающая матричной активностью (негативная РНК). Вирион имеет транскриптазу - ортомиксовирусы.

4.Двухцепочечная фрагментированная РНК. Вирион имеет транскриитазу - реовирусы.

5.Вирусы, геном которых представлен двумя идентичными нитями позитивной РНК (диплоидный геном). Вирионы имеют обратную транскриптазу- ретровирусы.

ДНК-геномы

6.Одноцепочечная линейная ДНК - парвовирусы.

7.Одноцепочечная кольцевая ДНК - фаги М13, ØX174.

8.Двухцепочечная линейная ДНК - вирус герпеса и др.

9.Двухцепочечная кольцевая ДНК - паповавирусы, вирус гепатита В и др.

10.Двухцепочечная ДНК с ковалентносвязанным терминальным гидрофобным белком - аденовирусы.

11.Двухцепочечная ДНК, замкнутая на каждом конце ковалентной связью - вирус оспы.

5. Методы культивирования вирусов.

Вирусы размножаются только в живых клетках. Культивирование вируса происходит на уровне орг-ма подопытного животного и на уровне культуры клеток (то есть вне орг-ма). Вирусы имеют тканевую и типовую специфичность. Поэтому при выделении неизвестного вируса одномоментно заражают 3-4 культуры клеток. Чаще используют эмбриональные ткани (куриный эмбрион). Вирусы оспы хорошо размножаются в хорион-аллантоисной оболочке, вирус паротита – в амнионе, вирус гриппа – в амнионе и аллантоисе, вирус бешенства – в желточном мешке. Берут 12-дневные эмбрионы.

При невозможности выделить и идентифицировать вирус стандартными методами (на культуре клеток и куриных эмбрионах) инфекционный материал вводят лабораторным животным (мыши, кролики, обезьяны), после развития инфекционного процесса проводят повторное заражение чувствительных клеточных культур.

Заражение лабораторных животных.

Методы заражения животных разнообразны: внутрибрюшинный, внутривенный, внутримышечный, интраназальный, заражение в мозг и другие.

Заражение в мозг. (Метод применяют при работе с нейротропными вирусами). Для заражения чаще используют белых мышей. Левой рукой плотно прижимают мышь к столу, большим и указательным пальцами оттягивают кожу головы назад. Туберкулиновым шприцем с предохранительной муфтой на игле прокалывают лобную кость несколько латеральнее средней линии и вводят 0,02-0,03 мл материала. Игла вводится на глубину 1,5-2 мм, при этом отчетливо ощущается "провал" в полость черепа.

При заражении новорожденных мышей (2-3-дневного возраста) их лучше брать руками в перчатках, чтобы после заражения мышата не имели постороннего запаха (пота, дезинфицирующих веществ, антибиотиков и т.д.), так как самка съедает мышат, имеющих посторонний запах. Материал вводят в количестве 0,01 мл. Вытекающую жидкость удаляют сухим стерильным ватным тампоном без дезинфицирующих ве­ществ. После заражения мышат помещают в отдельную банку (в свое гнездо), а через 20-30 минут подсаживают к ним самку.

Больных мышат самка также съедает. Поэтому надо уловить момент извлечения зараженных животных для завершения опыта. Первые два дня просматривают мышат 1-2 раза в день, а затем чаще. Через 3-4 дня здоровый мышонок в два раза больше зараженного.

Заражение куриных эмбрионов.

Существует несколько методов заражения куриных эмбрионов; на хорионаллантоиснух) оболочку, в аллантоисную полость, амниотическую полость, в желточный мешок. Для заражения используют эмбрионы 5-11 дневного возраста. Перед заражением эмбрионы просматривают в темной комнате при помощи овоскопа для проверки их жизнеспособности (живые эмбрионы подвижны с хорошо развитыми сосудами) и опревоздушной камеры и места расположения эмбриона. Место на столе, где производят манипуляции покрывают салфеткой, смоченной в растворе хлорамина.

Заражение на хорионаллантоисную оболочку. Яйцо устанавливают в штативе в вертикальном положении тупым концом вверх. Скорлупу над воздушной камерой обрабаты­вают спиртом, йодом, повторно спиртом, обжигают, прокалывают ножни­цами небольшое отверстие, через которое в полость воздушного мешка вводят одну браншу и срезают скорлупу над ним. Затем анатомическим пинцетом захватывают в склада- и осторожко снимают внутренний листок подскорлуповой оболочки. Под ней находится хорионаллантоисная оболочка, на которую пастеровской пипеткой наносят исследуемый материал в количестве 0,2-0,5 мл. Отверстие скорлупы закрывают стерильным стеклянным колпачком, который закрепляют на яйце расплавленным парафином. Зараженное яйцо помещают в термостат при 37 0 на 48 часов.

3аражение в аллантоисную полость. После подготовительной работы скорлупу прокалывают над воздушной камерой и через небольшое отверстие вводят иглой шприца на глубину 1-1,5 см материал в объеме 0,1-0,2 мл. Отверстие заливают парафи­ном.

Заражение в амниотическую полость. После удаления скорлупы над воздушной камерой бранши пинцета вводят в аллантоисную полость в направлении эмбриона на глубину 2-2,5 см, захватывают амниотическую оболочку, выводят ее на глубину прокалывают иглой шприца и в амниотическую полость вводят материал в количестве 0,1 мл. Отверстие в скорлупе закрывают колпачком и парафинируют.

Заражение в желточный мешок. (Этим методом пользуются для выделения риккетсий). Исследуемый материал вводат 5-8-дневным эмбрионам длинной иглой (4-5 см) через небольшое отверстие в скорлупе над воздушной камерой на глубину 2-3 см. При этом надо не повредить зародыш. Во время манипуляции он должен находиться ниже желточного мешка. Просмотреть с помощью овоскопа, отметить границу воздушной камеры и место расположения эмбриона. Ввести эмбриону на хорионаллантоисную оболочку вирус осповакцины или в аллантоисную полость вирус гриппа.

Культуры клеток (тканей).

Культуры ткани - это клетки ткани выращенные вне организма на специальной питательной. среде. Клетки ткани в искусственных условиях сохраняю? присущи им обмен и восприимчивость к определенным вирусам. Для культивирования вирусов особенно пригодны клетки с быстрым ростом. По этой причине широко применяют эмбриональные ткани (фибробласты куриных эмбриовов, клетки человека к др., а также культуры тканей опухолей (клетки-Неla, Нер-2 и др.).

Кулътивирование клеток может призойти в специальных флаконах (колбы-матрацы, флаконы Карреля) и в пробирках. Культура клеток для роста должна иметь какую-либо опору, например, стенку пробирки.

В выросшую культуру ткани, которая покрывает стенку сосуда в виде однослойного клеточного пласта, засевают материал, содержащий вирус. Работу производят в стерильных условиях. Для подавления роста микрофлоры вируссодержащий материал предварительно обрабатывают антибиотиками, чаще пенициллином и стрептомицином. Питательной средой для культуры ткани могут быть различные растворы, сослав которых приближается к составу жидкости организма (синтетическая среда 199, солевой раствор Хенкса с сывороткой, гидролизат лактальбумина с сывороткой и другие).

9. Признаки размножения вирусов в курином эбрионе."эффект карликовости" (замедление роста), мумификация, шарообразная форма зародыша и гибель на 3—6-й день после заражения.

1. Тип нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК), ее структура (кол-во нитей)

2. Наличие липопротеидной оболочки

3. Стратегия вирусного генома (способ репродукции)

4. Размер и морфология вириона тип симметрии, число капсомеров

5. Феномены генетических взаимодействий

6. Круг восприимчивых хозяев

7. Патогенность, в т.ч. Патологические изменения в клетках и образование внутриклеточных включений.

8. Географическое распространение

9. Способ передачи

10. Антигенные свойства

Классификационный рисунок как (сл 20)

Согласно существующей классификации вирусы объединены в самостоятельное царство Vira. По типу нуклеиновой кислоты, содержащейся в вирионе, вирусы подразделяют на ДНК- и РНК-содержащие. Дальнейшая классификация на семейства и роды исходит из совокупности перечисленных выше свойств вириона. Например, вирусы человека и животных по указанным критериям распределены в 19 семейств, включающих 43 рода. В соответствии с кругом хозяев различают вирусы животных и человека, вирусы растений и вирусы бактерий.

Химический состав вирусов

Белки вирусов

Выделяют 4 группы вирусспецифических белков:

1гр. – белки капсидов и суперкапсидов – это структурные белки

2 гр. – связывающие белки или прикрепительные – выполняющие структурную и функциональную роль. Некоторые являются ферментами-прикрепляются к чувствительным клеткам

3 гр. – ферменты, связанные с вирионом и участвующие в процессах транскрипции-внутренние белки

4 гр. – ферменты, репрессоры и другие белки, которые не входят в состав вириона, но кодируются геномом вируса, могут экспрессировать на поверженные заражением клетки и выделяться в кровь

Функции белков вирусов

1) Защитная функция

2) Антигенная функция

Антигеном является капсид, суперкапсид и др. Их относят к тимусзависимым антигенам.

3) Ферментативная функция

Вирусы не обладают обменом веществ, но содержат ферменты, необходимые для проникновения в чувствительные клетки и для репродукции.

4) Репрессорная функция

Белки оболочки могут действовать как репрессоры на уровне трансляции или транскрипции: прекращается синтез белка клетки или вируса

5) Рецепторная функция

Ее выполняют прикрепительные белки вирусов

повышают проницаемость сосудов, пирогенное действие.

Нуклеиновые кислоты

Составляют 1-50% веса вируса

У вирусов различают 4 макромолекулярных типа нуклеиновых кислот:

4-однонитчатая РНК: 1) плюс-нитевая РНК

2) минус-нитевая РНК

Физиология вирусов

Вирусы – облигатные внутриклеточные паразиты, способные к размножению только в живых клетках.

Различают 3 типа взаимодействия вируса с клеткой:

1) Продуктивный тип характеризуется образованием нового дочернего поколения вирионов и заканчивается:

- гибелью зараженных клеток – цитолитическая форма

- выходом потомства без гибели клетки – нецитолитическая форма

2) Абортивный тип – не завершается образованием новых вирионов, т.к. инфекционный процесс в клетке прерывается на каком-то этапе

3) Интегративный типили вирогения – характеризуется встраиванием – интеграцией вирусной ДНК в виде провируса в хромосому пораженной летки и их совместным сосуществованием и совместной репликацией. В результате:

а) не образуются новые вирионы

б) вирусный геном может передаваться дочерним клеткам

в) может развиться опухолевая или неопластическая трансформация клетки в результате нарушения в деятельности регуляторных механизмов, контролирующих деление.

Продуктивная форма взаимодействия проявляется в образовании вирусного потомства. При этом клетка может либо погибнуть, образовав большое количество вирусных частиц (литический цикл развития), либо продолжать расти, размножаться, продуцировать вир ионы.

Интегратнвная форма взаимодействия выражается во включении генома вируса в геном клетки-хозяина. При этом вирусная нуклеиновая кислота может реплицироваться в составе клеточной ДНК без образования вирусного потомства. Это характерно для умеренных фагов, вызывающих лизогенизацию бактерий. Некоторые вирусы животных также способны к интеграции с геномом клеток-хозяев.

Стадии репродукции

1. адсорбция вируса на клетке,

2. проникновение вируса в клетку,

4. транскрипция вирусного генома,

5. трансляция вирусных информационных РНК,

6. репликация вирусной ДНК или РНК,

7. сборка вирусной частицы,

8. выход из клетки.

После внедрения вирусного генетического материала внутрь клетки вирионы перестают существовать как организованные структуры. Во взаимодействие с клеткой вступает вирусная нуклеиновая кислота. Инфекционность свободной нуклеиновой кислоты при этом снижается или исчезает полностью. Это явление (утрата иифекционности и, как результат, - скрытое состояние вируса) получило название эклипса, а период времени между адсорбцией вириона и появлением в клетке новых вирусов называется фазой эклипса. Процессы, происходящие в клетке, после внедрения в нее вирусной нуклеиновой кислоты, зависят от природы вируса и, в первую очередь, - от типа нуклеиновой кислоты. Если геном вируса представлен ДНК, то при продуктивной инфекции вирусная ДНК служит матрицей для собственной репликации и для синтеза вирусной РНК, которая необходима для образования вирус-специфических белков. Если же геном вируса состоит из РНК, то молекулы РНК выполняют двоякую матричную функцию: обеспечивают синтез новых копий вирусных РНК, кодируют синтез новых вирусных белков. В репликации вирусного генома могут совместно участвовать и клеточные, и вирусные ферменты. Набор клеточных ферментов может пополняться за счет ферментов, привносимых вир ионом (ретровирусы, вирус осповакцины) в клетку, или вновь синтезируемых под влиянием генов вириона.

В случае продуктивной инфекции, ведущей к образованию и освобождению новых вирусных частиц, вслед за репликацией нуклеиновой кислоты начинается синтез вирионных белков. В результате синтеза накапливается фонд предшественников, которые служат исходным материалом для образования капсидов. Далее следуют процесс самосборки вирусных частиц и освобождение их из клетки.

Основными механизмами освобождения вирионов из клетки является лизис клеток-хозяев, либо отпочковыванне вирионов вместе с участками мембраны инфицированных клеток. Последний способ присущ вирусам, имеющим липопротеидную мембрану. Клетка при этом сохраняет жизнеспособность и может длительное время продуцировать вирусное потомство.

При систематизировании вирусов выделяют следующие основные критерии:

• сходство нукле­иновых кислот,

• наличие илиотсутствие суперкапсида,

• тип симметрии нуклеокапсида,

• характеристика нуклеиновых кислот (молекулярная масса, тип кислоты (ДНК или РНК), полярность (плюс или минус), количество нитей в молекуле либо наличие сегментов,

• чувствительность к химическим агентам (особенно к эфиру),

• антигенная структура ииммуногенность,

• тропизм к тканям и клеткам,

• способность образовывать тельца включений.

Дополнительный критерий – симптоматология поражении: способность вызывать генерализованные поражения либо инфекции с первичным поражением определённых органов (нейроинфекции, респираторные инфекции и др.).

Особенности систематики бактерий.

Для идентификации и систематизации бактерий применены критерии, отражающие особен­ности их физиологии, морфологии, антигенных и других свойств.

Морфологические и тинкториальные свойства.

Наиболее общие критерии для важных с медицинской точки зрения бактерий: величина, форма, агрегация (образование нитей, тетрад, пакетов), наличие капсулы, эндоспор, жгутиков, пигментов и способность окрашиваться красителями (то есть тинкториальные свойства). Наи­более распространена окраска по Граму – простое по технике выполнения окрашивание, основанное на способности воспринимать и удерживать внутри клетки красящий комплекс генцианового фиолетового с йодом либо терять его после обработки этанолом. Грамположительные бактерии хорошо удерживают комплекс генцианового фиолетового с йодом и устойчивы к обесцвечиванию спиртом. После обработки фуксином они окрашивают­ся в фиолетово-пурпурный цвет. Грамотрицательные бактерии обесцвечиваются спиртом, то есть теряют комплекс генциа­нового фиолетового с йодом, и хорошо поглощают фуксин. В мазках они окрашиваются в малиново-красный цвет.

Кислотоустойчивые бактерии.

Клеточная стенка некоторых бактерий содержит большое количество липидов и восков, делающих их устойчивыми к последующему после окрашивания обесцвечиванию кислотами, щелочами или этанолом (например, виды Mycobacterium или Nocardia). Подобные бактерии называют кислотоустойчивыми, их трудно окрашивать по Граму (хотя кислотоустойчивые бактерии рассматривают как грамположительные). Для их окраски применяют метод Циля-Нильсена.

Окрашивание по Граму или Цилю-Нильсену имеет диагностическую ценность в отношении бактерий, обладающих прочной клеточной стенкой. Они неприемлемы для окраски микоплазм (нет клеточной стенки) или спирохет (клеточная стенка тонкая и легко разрушается при окра­шивании). Для изучения последних применяют различные методы нанесения на их поверхность контрастных субстратов (например, серебрение).

Подвижность.

Важным дифференцирующим признаком является подвижность. В соответствии со способом передвижения выделяют скользящие бактерии, перемещающиеся за счёт волнообразных сокра­щений тела, и плавающие бактерии, движение которых обеспечивают жгутики или реснички.

Способность к спорообразованию.

Для классификации некоторых бактерий учитывают их способность к спорообразованию, размеры спор и их расположение в клетке.

Физиологическая активность.

Физиологическая активность является не менее важным отличительным признаком. Бакте­рии разделяют по способу питания, по типу получения энергии (дыхание, брожение, фотосин­тез), по отношению к рН с указанием пределов устойчивости и оптимума роста и т.д. Наиболее важным критерием считают отношение к кислороду.