Отбор патологического материала при бешенстве

Бешенство (Б) – остро протекающая болезнь теплокровных животных, характеризующаяся поражением ЦНС. Восприимчивы домашние и дикие животные всех видов, а также человек.

Болезнь регистрируется в различных регионах земного шара. Не отмечено случаев распространения болезни в Австралии, Великобритании, Японии. Заболевание почти всегда заканчивается смертью. Имеются фактически документированные случаи выздоровления от бешенства человека и собак после экспериментальной инфекции.

Вирус бешенства (ВБ) относится к семейству Rhabdoviridae, роду Lyssavirus. В настоящее время установлено, что ВБ имеет 4 серотипа, что обусловлено, видимо, различием в составе мембранных белков. Все варианты ВБ в иммунобиологическом отношении родственны, но различаются по вирулентности. ВБ обладает ГА и ГАД свойствами. Между инфекционной и ГА активностью существует линейная зависимость. Животные, иммунизированные против бешенства, продуцируют ВНА, КСА, антиГА и литические (разрушающие клетки, зараженные вирусом в присутствии комплемента) АТ.

Диагноз ставят на основании эпизоотологических данных, симптомов болезни, патологоанатомических изменений (они имеют меньшее значение) и, главным образом, результа­тов лабораторных исследований.

Лабораторная диагностика заключается в исследовании головного мозга животных с целью выявления вирусного АГ в ИФ, РДП, обнаружении те­лец Бабеша - Негри и биопробе на белых мышах.

В Российской Федерации в настоящее время организовано производство наборов для диагностики Б в ИФ и РДП в ВНИТИБП и КазНИВИ.

Выделение вируса. В лабораторию для исследования направляют свежие трупы мел­ких животных, от крупных животных - голову или головной мозг. В некоторых случаях до­пускается консервирование головного мозга в 50%-ном глицерине. Труп или голова должны быть тщательно упакованы в полиэтиленовый мешок, мозг - в банку с притертой стеклянной или резиновой пробкой, залитой парафином. Материал упаковывается во влагонепроницае­мую тару. Для вирусологических исследований пригоден только не консервированный мозг. Необходимо помнить, что вскрытие трупа, извлечение мозга и другие операции с патологи­ческим материалом следует проводить в условиях стерильности и строгого соблюдения мер личной профилактики: прочно фиксируют голову животного, защищают руки 2-мя парами перчаток (хирургические и анатомические), для защиты глаз надевают очки, а на нос и рот-6-слойную марлевую повязку.

Лабораторные исследования материала на бешенство проводят вне всякой очереди; результаты немедленно сообщают врачу хозяйства и главному врачу района (города).

Индикация и идентификация вируса. Порядок проведения исследований: из каждого отдела головного мозга левой и правой сторон (аммонова рога, мозжечка, коры полушарий и продолговатого) готовят по 4 мазка-отпечатки для ИФ и обнаружения телец Бабеша - Негри; с мозговой тканью ставят РДП; при отрицательных результатах ставят биопробу.

Обнаружение специфических телец-включений. Мазки-отпечатки окрашивают по Селлерсу, Муромцеву или другими методами. После окрашивания препараты просматрива­ют в световом микроскопе с иммерсионной системой. Положительным результатом считают наличие специфических телец Бабеша - Негри (при окраске по Селлерсу - четко очерченные овальные или продолговатые гранулярные образования розово-красного цвета в протоплаз­ме, при окраске по Муромцеву - светло-фиолетовые с темно-синими включениями тельца Бабеша - Негри, чаще они расположены вне нервных клеток.

Наиболее характерная особенность телец Бабеша - Негри - их внутренняя структура, по­зволяющая абсолютно точно дифференцировать их. Внутри видны маленькие зернышки - базофильные зернистости темно-голубого, даже черного цвета величиной 0,2-0,5 мкм.

Диагностическая ценность обнаружения телец-включений для доказательства заражения ВБ общепризнана. Однако и у здоровых животных, в особенности у кошек и белых мышей, имеются образования, присутствие которых может вызвать диагностические затруднения. В отдельных случаях в мозге кошки можно с уверенностью дифференцировать подобные включения от телец Бабеша - Негри, и здесь рекомендуется воспользоваться методами иден­тификации, в особенности ИФ. Равным образом и у собак, погибших в результате отравле­ния змеиным ядом или поражения электрическим током, можно найти тельца-включения, напоминающие тельца Бабеша – Негри. Тельца Бабеша - Негри выявляют лишь в 65-85% случаев бешенства, поэтому отсутствие их не является отрицательным ответом, и материал исследу­ется в других тестах (ИФ, РДП, биопроба).

ИФ. Один из основных тестов при диагностике Б. При высококвалифицированном вы­полнении получают в 99-100% совпадения с методом биопробы. Обычно в диагностической практике используют прямой метод ИФ, который проводят с применением антирабического флюоресцирующего Ig. Фиксацию препаратов в охлажденном (8-10°С) ацетоне проводят не менее 4-х ч. В качестве отрицательного контроля используют мазки-отпечатки головного мозга здоровых белых мышей. Учитывают результаты визуально в люминесцентном микро­скопе на основе оценки интенсивности свечения комплекса АГ-АТ. АГ ВБ выявляется в ви­де ярких желто-зеленых или зеленых гранул различной формы и величины в клетках (чаще вне клеток). Диагноз считают установленным, если в нескольких полях зрения обнаружи­вают достаточное количество (не менее 10) типичных гранул с ярким зеленым свечением или множество мельчайших точек, В контроле подобного свечения не должно быть.

Для доказательства специфичности свечения комплекса АГ-АТ используют метод по­давления ИФ, который заключается в способности рабического АГ, связанного с нефлюоресцирующими AT, вторично не вступать в соединение с флюоресцирующими специфиче­скими AT. Для этого на фиксированные препараты, приготовленные из исследуемого голов­ного мозга, наносят 5%-ный антирабический нефлюоресцирующий Ig, выдерживают 30 мин при 37°С во влажной камере, промывают физраствором, а затем окрашивают флюоресци­рующим антирабическим Ig общепринятым прямым методом. В обработанных таким обра­зом препаратах флюоресценции не должно быть.

Метод ИФ дает возможность обнаруживать ВБ в клетках роговицы глаз и предвари­тельно поставить диагноз прижизненно: во время болезни животных, а также за 1-2 дня и более до клинического её проявления. Метод может быть использован для исследования по­дозреваемых в заболевании Б животных, а также клинически здоровых собак и кошек, по­кусавших людей и животных. Для этого готовят отпечатки с роговицы, соблюдая все прави­ла личной безопасности, раскрывают глазную щель животного большим и указательным пальцами и на слегка выпяченное глазное яблоко надавливают поверхностью предметного стекла, отступив 0,5 см от конца. Нужно следить, чтобы животное не моргало третьим ве­ком, так как со стекла удаляются эпителиальные клетки и получается некачественный мазок. С каждого глаза делают не менее 2 препаратов, содержащих по 2 отпечатка. Для кон­троля аналогичным образом готовят отпечатки роговицы от здоровых животных. Их можно приготовить в хозяйстве. Отпечатки высушивают на воздухе, фиксируют в ацетоне в тече­ние 4 ч при 4°С, упаковывают и отправляют в лабораторию. Окрашивают препараты, как при ИФ, по общепринятой методике.

В препаратах, полученных от больных животных или находящихся в конце инкубаци­онного периода болезни, в цитоплазме многих эпителиальных клеток наблюдаются разной формы ярко светящиеся гранулы разного размера - от пылевидных точек до 2 мкм и более. С целью получения достоверных результатов в каждом препарате просматривают по 50-100 клеток, а всего от животного - не менее 200-400 клеток. Результаты микроскопии считают положительными, если в отпечатках роговицы животного обнаруживают 11% и более кле­ток с характерными очажками свечения. Необходимо иметь в виду, что в препаратах от здо­ровых животных (контроль), вследствие аутофлюоресценции, могут встречаться единичные клетки с подобными по форме и свечению очажками.

Важно отметить, что ИФ дает возможность ускорить ответ при окончательной постанов­ке диагноза путем биопробы, поскольку диагноз при Б может быть установлен только на 4-8-й день после заражения мышей исследуемым материалом, а инкубационный период забо­левания мышей может достигать и 20 дн. ИФ может выявлять ВБ в тканях подчелюстной слюнной железы. Из подчелюстных слюнных желез готовят препараты-мазки, беря матери­ал не менее чем из 6 разных участков железы, так как распределение в ней вируса нерав­номерно. Часто, чтобы получить отпечаток, приходится делать сильный нажим, поскольку из-за обилия муцина на стекле остается мало материала.

Показана возможность идентификации ВБ в коже методом ИФ, С этой целью берут пробы кожи головы, а также фолликулы сенсорных и тактильных волос морды или лате­ральных сенсорных сосочков (на щеке собаки). Пробы хранят при -20 или -70°С. Из них де­лают криосрезы, которые обрабатывают флюоресцирующим глобулином. Результаты ИФ анализа, полученные при идентификации ВБ в коже, в высокой степени коррелируют с дан­ными, полученными при исследовании мозга того же животного. Показана близкая корре­ляция между обнаружением АГ вируса в пробах мозга и тканях губы методом ИФ.

РДП. Применяют для обнаружения АГ ВБ в неконсервированном головном мозге жи­вотных, павших от уличного бешенства, или мышат, используемых в биопробе. РДП ставят микро­методом на предметных стеклах, используя 1-1,5%-ныЙ агаровый гель по общепринятой ме­тодике. Наибольший процент положительных результатов выявляют при использовании следующего трафарета: А - аммонов рог (правая сторона); В - кора головного мозга (правая сторона); С - мозжечок (правая сторона);
Д - продолговатый мозг (правая сторона); + (плюс) - положительный контроль; - (минус) - отрицательный контроль; 1, 2, 3, 4 - лунки с разведе­нием специфического иммуноглобулина 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 соответственно

Из каждого отдела головного мозга с помощью пинцета готовят гомогенную пастооб­разную массу, которую и помещают в соответствующие лунки. От мышей исследуют весь головной мозг. Из отделов головного мозга левой стороны готовят АГ аналогичным образом ( на каждую экспертизу в общей сложности требуется 4 предметных стекла с агаровьм ге­лем). Реакцию учитывают через 6, 24, 48 ч. При наличии 1 или 2-3 линий преципитации между лунками, содержащими АГ и иммуноглобулин, реакцию считают положительной.

РДП проста по выполнению и специфична, но процент выявления вирусного АГ в ис­следуемом материале составляет 45-70. При исследовании головного мозга мышей, полу­ченного при положительной биопробе, РДП выявляет до 100% случаев. Отсутствие в иссле­дуемом материале телец Бабеша - Негри, специфической флюоресценции и отрицательная РДП не дают основания исключить наличие вируса. В этом случае окончательный диагноз ставят по результатам биопробы на белых мышах с последующей идентификацией вируса.

Биопроба. Принято считать, что биопроба является более эффективным методом, чем обнаружение телец Бабеша - Негри, ИФ и др. Однако и она в отдельных случаях оказыва­лась отрицательной, несмотря на подтверждение диагноза Б путем обнаружения телец-включении и ИФ. Процент отрицательных результатов по биопробе колебался от 1,3 до 12.

Сведения о различной эффективности биопробы могут быть объяснены рядом факторов: выбора экспериментального животного, количества их в опыте, способа заражения, способа и срока хранения материала до поступления в лабораторию. Может играть роль и явление интерференции инфекционных частиц неактивными частицами, если для инокуляции ис­пользуют недостаточно разведенный материал.

В мозге и слюнных железах лисиц и скунсов, павших от бешенства, обнаружено вещество, ингибирующее инфекционность вируса, что не позволяет провести диагностику болезни у этих животных методом внутримозгового заражения мышей. Наличие ингибирующего вещества в исследуемом материале не препятствует выявлению вирусного АГ методом ИФ; для скун­сов и лисиц это самый чувствительный метод диагностики.

Из животных всех видов (кролики, морские свинки, взрослые белые мыши и хомячки), использованных для биопробы, многие отдают предпочтение мышам-сосунам, поскольку они более чувствительны к разным штаммам ВБ и менее опасны в работе. Сирийские хо­мячки по чувствительности не уступают мышам, но они менее доступны.

РСК. Выявление специфического АГ в РСК при диагностике бешенства применяется реже, чем другие методы. Из присланного для исследования мозга готовят АГ. Для этого мозговую ткань (особенно богаты АГ, связывающим комплемент, кусочки таламуса и стволового от­дела мозга) растирают в вероналовом буфере в соотношении 1:10 и оставляют при комнат­ной температуре на 1 ч, после чего суспензию инактивируют при 56°С в течение 5 ч. Такая обработка убивает вирус и снимает антикомплементарность мозговой ткани, не повреждая специфический АГ. Суспензию центрифугируют 15 мин при 3500 мин- 1 из надосадочной жидкости, которая представляет собой материал для исследования на наличие АГ, готовят 2-кратно возрастающие разведения от 1:2 до 1:64 и используют для исследования в РСК.

ИФА. В ИФА специфическое окрашивание АГ в клетках мозга павших от бешенства животных выявляют как в свежевзятых, хранившихся в глицерине, а также в пробах, хранившихся без глицерина при 20°С 8-18 ч. Данный тест пригоден для рутинной диагностики бешенства у животных, для выявления АГ ВБ в тканевых парафиновых срезах при фиксации препаратов 10%-ным р-ром формалина с рН 5,3 и последующей обработки препаратов, заключенных в парафин, пепсином.

В отличие от РН на мышах и в культуре клеток ИФА позволяет выявить AT у животных в течение нескольких часов, ИФА - наиболее перспективный лабораторный метод обнару­жения AT и индикации самого вируса. Экспресс-методом диагностики бешенства является тех­ника захвата и метод ИФ для выявления АГ ВВ. Доказано, что метод выявления АГ ВБ в парафинизированных срезах пероксидазо-антиперокисдазным методом значительно пре­восходит метод ИФА. В 1987 г. создан набор для быстрой энзимиммунодиагностики бешенства (RREID), приемлемый для эпидемиологических и лабораторных исследований.

РН. Используется редко. Рекомендуется модификация с разведением ВБ и постоянной дозы γ-глобулина. ИН 2 указывает на АГ специфичность выделенного вируса.

Вариантная идентификация с помощью монАТ. С помощью монАТ к гликопротеинам ВБ селектированы АГ варианты, среди которых выделены фенотипически термола­бильные (авирулентные) варианты. При использовании 2-х групп монАТ показано, что штаммы дикования отличаются от шт. Fixe (Пастера), CVS, Flury HEP, ERA и "утиных" штаммов по АГ детерминантам. Изучение с помощью монАТ 7-ми штаммов, выделенных от больных Б людей, позволило выявить определенные отличия их от вакцинного штамма в отношении АГ детерминант.

Общепризнано, что AT отличия между дикими штаммами удается обнаружить, исполь­зуя монАТ против нуклеокапсидного AT N, которые реагируют с цитоплазматическими включениями зараженных вирусом клеток; против гликопротеина (G АГ), которые реаги­руют с мембранами инфицированных клеток, лизируют эти клетки в присутствии компле­мента и нейтрализуют вирус. В связи с возможной АГ вариабельностью поверхностного гликопротеина ВБ из различных географических зон в качестве протективного АГ исполь­зовали рибонуклеопротеин, характеризующийся консервативностью АГ структуры. Таким образом, не только G белок, но и РНП ВБ обладают протективной активностью.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. Эти методы для бешенства нетипичны, поскольку используются только с целью проверки поствакцинального иммунитета. Для обнаружения и титрования поствакцинальных AT ис­пользуют РН, которую ставят общепринятым методом. В качестве АГ используют фиксиро­ванный ВБ. РН на клетках ВНК-21 была более чувствительной, чем непрямая ИФ при выяв­лении AT в сыворотках вакцинированных лис. Кроме того, предложены РТГА и ELISA.

РТГА. Пока еще не нашла широкого применения в диагностической практике из-за на­личия в сыворотках крови неспецифических ингибиторов, к которым ВБ высокочувствите­лен, а главное, ГА АГ, не подвергавшиеся достаточной очистке, обладали низкой чувстви­тельностью. Для приготовления ГА АГ ВБ предложено использовать шт. Москва, выращен­ный в культуре клеток ВНК-21, после его обработки сапонином с последующей очисткой и концентрированием. ГА отделяют от других компонентов вириона ультрацентрифугирова­нием. Полученный препарат имел степень очистки 99,92%, обладал высокой ГА активно­стью (1:128), хорошо сохраняющейся в течение 1 мес при рН 5-9.

Перед постановкой РТГА следует проводить умеренную 2-кратную трипсинизацию гу­синых эритроцитов для их сенсибилизации. При использовании 0,25%-ной взвеси трипси-низированных эритроцитов (лучше 10 7 клеток в 1 мл) чувствительность РТГА повышается в 4 раза. Для разбавления АГ и сывороток применяют боратно-солевой р-р (рН 9) с добавле­нием 0,4% бычьего сывороточного альбумина. Взвесь эритроцитов готовят в солевом р-ре с кислым рН, чтобы после соединения со смесью вируса и сывороток, рН которой 9, оконча­тельный рН установился бы в пределах 6,2. После внесения в лунки суспензии эритроцитов панель встряхивают, заклеивают прозрачной пленкой и ставят на лед. Результаты РТГА учитывают через 40-50 мин, а с эритроцитами 2-дн цыплят или макаки-резус - через 1-1,5 ч.

Разработан радиоиммунологический анализ, основанный на способности AT связы­ваться с меченым 125 1-АГ ВБ. Меченый IgG, выделенный из антирабической гипериммун­ной сыворотки, можно применять для обнаружения АГ ВБ твердофазным РИА. Лучшие ре­зультаты получены при использовании фосфатно-солевого р-ра (рН 6,0) с ионной силой 0,01 М и меченого IgG с активностью 200-250 тыс. имп./мин.

Твердофазный конкурентный РИА применим для выявления антирабических AT в сы­воротке и гибридомных супернатантах.

Дифференциальная диагностика. Необходимо исключить болезнь Ауески, при кото­рой больные животные неагрессивны, не бывает извращения аппетита. У собак исключают нервную форму чумы. Подозрение на бешенство может возникнуть при инфекционном энцефаломие­лите лошадей. Комплекс лабораторных исследований позволяет поставить точный диагноз на бешенство. Предложен новый метод дифференциации различных штаммов ВБ, основанный на рестриктазном расщеплении продуктов амплификации в ПЦР сегмента гена N.

1.1. Настоящие методические указания предназначены для патологоанатомов и судебно-медицинских экспертов, а также для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих лабораторную диагностику погибших от гидрофобии (бешенства) лиц, а также общее руководство по отбору, упаковке, хранению и транспортированию секционных материалов.

1.2. В настоящих методических указаниях определены порядок отбора, упаковки, хранения и транспортирования биологического материала от умерших людей для проведения лабораторной диагностики заболевания, вызванного вирусом уличного бешенства.

- нештатная ситуация, при которой создается реальная или потенциальная возможность заражения персонала

- система медико-биологических, организационных и инженерно-технических мероприятий и средств, направленных на защиту работающего персонала, населения и окружающей среды от воздействия патогенных биологических агентов

- метод обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции

- метод полимеразной цепной реакции в реальном времени

В настоящих методических указаниях использованы ссылки на следующие нормативные документы:

Положение о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании, утвержденное постановлением Правительства Российской Федерации от 24 июля 2000 г. № 554.

WHO Expert consultation on rabies: First Report (2004: Geneva, Switzerland). WHO Technical Report Series 931. - 123 c.

Laboratory techniques in rabies. Fourth edition WHO, Geneva, 1996 г.

4.1. Забор материала от умерших с подозрением на инфекцию, вызванную вирусом уличного бешенства, и его упаковку проводит специально обученный персонал лечебно-профилактических организаций (ЛПО) в соответствии с требованиями действующих нормативных документов.

4.2. Доставка материала на исследование производится лечебно-профилактической организацией по согласованию с управлением Роспотребнадзора субъекта Российской Федерации с учетом требований биологической безопасности и оптимальной транспортной схемы в Центр специальной лабораторной диагностики и лечения особо опасных и экзотических инфекционных заболеваний Минобороны Российской Федерации.

4.3. Управление Роспотребнадзора субъекта Российской Федерации согласовывает с Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека порядок доставки материала на исследование в Центр специальной лабораторной диагностики и лечения особо опасных и экзотических инфекционных заболеваний Минобороны Российской Федерации.

5.1. Отбор, упаковку и транспортирование секционного материала от лиц, предположительно погибших от гидрофобии (бешенства) осуществляет квалифицированный персонал, обученный правилам биологической безопасности и имеющий опыт патологоанатомического или судебно-медицинского исследования лиц, погибших от опасных и особо опасных инфекционных заболеваний, с соблюдением правил противоэпидемического режима в соответствии с СП 1.3.1285-03.

5.2. Во избежание заражения в процессе вскрытия необходимо соблюдать все меры предосторожности, включая тщательность препарирования и использование толстых резиновых перчаток.

5.3. Для исследования забирают следующие участки головного мозга:

• кора больших полушарий.

Исследованию подвергаются также слюнные железы.

Размер секционного материала 15 мм×15 мм.

5.4. Забор производят стерильными инструментами в стерильные одноразовые пластиковые флаконы с закручивающимися крышками (колбы, контейнеры), содержащие физиологический раствор, покрывающий взятый секционный материал.

5.5. От одного умершего от гидрофобии (бешенства) человека отбирают две пробы: одну пробу для исследования материала молекулярно-биологическими методами (ОТ-ПЦР или RT-ПЦР), вторую - для проведения вирусологического исследования. Вся работа по отбору проб должна проводиться в соответствии с требованиями биологической безопасности с соблюдением противоэпидемического режима.

5.6. Каждый образец материала помещают в отдельную транспортную емкость.

5.7. Отобранный секционный материал помещают в стерильные пластиковые флаконы (колбы, контейнеры), содержащие физиологический раствор и подвергают глубокой заморозке до минус (65 ± 5) °С (или в жидком азоте) либо до минус (20 ± 4) °С. В исключительном случае допускается помещение секционного материала вместе с глицерином в стерильные пластиковые флаконы (колбы, контейнеры) при температуре (6 ± 2) °С.

5.8. Запрещается помещать и хранить секционный биологический материал в формалине, а также в парафиновых блоках.

6.1. Отобранный секционный материал до упаковки образца для транспортирования может храниться при следующих условиях:

• при температуре минус (65 ± 5) °С (или в жидком азоте) - длительно;

• при температуре минус (20 ± 4) °С - в течение 30 суток с момента отбора материала;

• при температуре (6 ± 2) °С - не более 3 суток с момента отбора материала.

Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.

6.2. Все образцы, доставляемые в диагностическую лабораторию, должны быть герметично упакованы в соответствии с действующими нормативно-методическими документами:

• в транспортную емкость (плотно закрывающиеся стерильные пластмассовые колбы либо флаконы (контейнеры) с завинчивающимися крышками, проверенные на герметичность); плотно закрытый верхний конец транспортной емкости вместе с крышкой герметизируют различными пластификаторами (парафин, парафильм и др.); емкость маркируют;

• в плотный полиэтиленовый пакет подходящего размера с ватой (или другим гигроскопичным материалом) в количестве достаточном для адсорбции всего образца в случае его утечки; полиэтиленовый пакет следует герметично заклеить или запаять.

6.2.1. В отдельный полиэтиленовый пакет вкладывают бланк направления с указанием: наименование направляющего учреждения, ФИО больного, возраст, место жительства, предварительный диагноз, эпидемиологический анамнез, вид материала, дата и время взятия материала.

6.2.2. Пакеты с образцами от одного пациента вместе с направлением упаковывают во второй плотный полиэтиленовый пакет. Не допускается упаковывание образцов материалов от разных людей в один и тот же пакет.

7.1. Перед непосредственным транспортированием герметично закрытые полиэтиленовые пакеты достают из низкотемпературного холодильника и помещают в термоизолирующий плотно закрывающийся контейнер (термос либо сумка-холодильник), приспособленный для транспортирования биологических материалов.

7.1.1. Охлаждающие элементы перед транспортированием секционного материала необходимо замораживать при температуре минус (65 ± 5) °С в течение (6 ± 2) часов, а при температуре минус (20 ± 4) °С - в течение (20 ± 2) часов.

7.1.2. В термоконтейнеры и термосы помещают охлаждающие элементы или пакеты со льдом. К наружной стенке термоконтейнера или термоса прикрепляют этикетку с указанием вида материала, условий транспортирования, названия пункта назначения. Сроки и условия транспортирования упакованных проб клинического материала указаны в приложении.

7.2. Транспортирование секционного материала в диагностическую лабораторию осуществляется нарочным(и), информированным о правилах доставки материала в соответствии с п. 3.4 СП 1.2.036-95.

8.1. Вскрытие проводят в дополнительном комплекте специальной одежды, включающим: противочумный комплект, фартук, защитные очки или защитный щиток, средства индивидуальной защиты органов дыхания (респиратор типа ШБ-1 или РБ, Лепесток-200), двойные резиновые перчатки. После процедуры отбора материала перчатки обрабатываются растворами дезинфицирующих средств, руки после снятия перчаток обрабатываются антисептиками.

8.2. Лечебно-профилактические организации, осуществляющие патологоанатомическое исследование лиц, предположительно погибших от гидрофобии (бешенства), должны быть оборудованы аптечкой, укомплектованной в соответствии с СП 1.3.1285-03, и дополненной антирабической вакциной и антирабическим иммуноглобулином.

8.3. Режимы обеззараживания различных объектов (медицинских инструментов и др.) соблюдаются в соответствии с СП 1.3.1285-03.

8.4. Обеззараживание поверхностей помещения (пол, стены, двери), оборудования, рабочих столов и др. проводится двукратным протиранием с интервалом в 15 мин 6 %-м раствором перекиси водорода либо любым дезинфицирующим средством, обладающим вирулицидной активностью, с последующей обработкой ультрафиолетом в течение 60 мин.

8.5. Каждая нештатная ситуация (авария) регистрируется в журнале аварийных ситуаций, где отмечается: дата, время, место, характер аварии, локализация травмы или контакт, фамилия, имя и отчество лиц, имевших контакт с вирусом уличного бешенства.

В качестве секционного материала используются ткани мозга: аммонов рог, мозжечок, кора больших полушарий; слюнные железы. Секционный материал собирают в одноразовые полипропиленовые флаконы (колбы, контейнеры) с завинчивающимися крышками объемом 50 - 100 мл

Условия хранения материала

При температуре минус (65 ± 5) °С (или в жидком азоте) - длительно.

При температуре минус (20 ± 4) °С - 30 суток.

При температуре (6 ± 2) °С - не более 3 суток с момента отбора материала.

Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.

Не допускается хранение материала в формалине и парафиновых блоках

Условия транспортирования материала

В термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом при температуре:

- (6 ± 2) °С - не более 1 суток;

- минус (20 ± 4) °С - не более 7 суток;

- минус (65 ± 5) °С (или в жидком азоте) - длительно

Глава 13. ПРАВИЛА ВЗЯТИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И ПЕРЕСЫЛКИ ЕГО ДЛЯ ЛАБОРАТОРНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

(Извлечение из Правил Главного управления ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР, утвержденных 24 июня 1971г.)

При необходимости определить или подтвердить причину заболевания или гибели животных (включая птиц, зверей, пчел, рыб), при подозрении на инфекционную или инвазионную болезнь или на отравление ветеринарный врач (фельдшер) обязан взять соответствующий патологический материал и направить его в ветеринарную лабораторию для исследования.

Во всех случаях взятия и пересылки материала специалист обязан руководствоваться изложенными ниже правилами, а также соответствующими инструкциями по борьбе с болезнями животных.

Взятие и пересылка патологического материала для бактериологического и вирусологического исследования. Патологический материал берут стерильными инструментами в стерильную посуду. Поверхность органа (ткани), от которого будут брать патологический материал, на месте разреза обжигают над пламенем или прижигают нагретой металлической пластинкой.

Патологический материал берут как можно раньше после смерти животного, особенно в теплое время года. При начавшемся разложении материал для исследования негоден.

В лабораторию материал отправляют в неконсервированном виде. Если доставить в лабораторию в течение ближайших 24—30 ч материал невозможно, то его консервируют.

Для бактериологического исследования патологический материал (органы или их части) консервируют в 30%-ном водном растворе химически чистого глицерина. Воду предварительно стерилизуют кипячением или автоклавированием в течение 30 мин. В качестве консерванта можно применять также стерильное вазелиновое масло. Материал заливают консервирующей жидкостью в количестве, в 4—5 раз превышающем его объем.

Материал, предназначенный для вирусологического исследования, консервируют в 30—50%-ном растворе химически чистого глицерина на физиологическом растворе поваренной соли. Физиологический раствор предварительно стерилизуют в автоклаве при 120 °С в течение 30 мин.

Небольшие трупы животных (поросята, ягнята, телята), а также трупы мелких животных посылают целыми в непроницаемой таре.

Трубчатые кости направляют целыми с неповрежденными концами. Предварительно их тщательно очищают от мышц и сухожилий и завертывают в марлю или полотно, смоченные дезинфицирующей жидкостью (5%-ный раствор карболовой кислоты). Кости можно также посыпать натрия хлоридом (поваренной солью) и завернуть в полотно или марлю.

Кишечник перед посылкой для бактериологического и вирусологического исследований освобождают от содержимого, а концы его перевязывают. На исследование посылают части кишечника с наиболее характерными патологическими изменениями. Помещают в банки с 30—40%-ным водным раствором глицерина или насыщенным водным раствором натрия хлорида. Объем консервирующей жидкости должен в 5—7 раз повышать объем взятого материала.

Кал для исследования отправляют в стерильных стаканах, пробирках или банках, которые закрывают пергаментной бумагой. От трупов животных кал можно послать в отрезке невскрытого кишечника, завязанного с обоих концов. В лабораторию кал должен быть доставлен не позднее 24 ч после взятия.

При посылке для исследования участков кожи берут наиболее пораженные части ее размером 10 х 10 см и кладут в стерильную, герметически закрывающуюся посуду.

Кровь, гной, слизь, мочу, желчь и другой жидкий патологический материал для бактериологического и вирусологического исследований посылают в запаянных пастеровских пипетках, стерильных пробирках или во флаконах, плотно закрытых стерильными резиновыми пробками.

Кроме того, выделения из различных полостей, естественных отверстий и др., предназначенные для микроскопического исследования (для обнаружения в них микробов, кровепаразитов и для определения лейкоцитарной формулы), посылают в виде мазков.

Предметные стекла кипятят в течение 10—15 мин в 1—2%-ном водном растворе соды, затем тщательно промывают чистой водой, насухо вытирают и помещают в раствор спирта и эфира, взятых в равных частях, где и хранят до употребления.

Кровь берут из вены ушной раковины или края верхушки уха, у птиц — с поверхности гребня или из подкрыльцовой вены. Шерсть на месте взятия крови выстригают, кожу протирают ватными тампонами, смоченными сначала спиртом и затем эфиром. Инструменты (иглы, скальпель) должны быть стерильными.

Первую каплю крови удаляют стерильной ватой (исключение делается при исследовании крови на пироплазмидозы, когда для мазка берут первую каплю крови), а следующую свободно выступившую каплю берут на предварительно подготовленное предметное стекло быстрым и легким прикосновением к капле поверхностью стекла. Затем стекло быстро поворачивают вверх каплей и удерживают между пальцами левой руки в горизонтальном положении. К левому краю капли прикасаются под углом 45° шлифованным краем другого предметного (или покровного) стекла. Как только капля равномерно распределится по ребру этого стекла, его быстро проводят по поверхности предметного стекла слева направо, не доводя до края на 0,5—1 см. Ширина мазков должна быть уже предметного стекла. Для каждого нового мазка берут свежую каплю крови.

Готовые мазки крови высушивают только на воздухе. В холодное время года мазки делают в теплом помещении или на стеклах, подогретых на крышке теплого стерилизатора.

Метод фиксации мазков зависит от цели исследования.

Правильно приготовленные мазки крови должны быть тонкими, равномерными и достаточной длины. На высушенных мазках и отпечатках острым предметом делают надпись с указанием номера или клички животного и даты приготовления мазка.

Мазки из тканей, гноя, органов и различных выделений готовят путем размазывания материала на предметном стекле стерильной палочкой или ребром другого предметного стекла до тонкого слоя. Частицы органов плотной консистенции, твердые узелки, а также вязкий материал заключают между двумя предметными стеклами и растирают. Затем стекла разъединяют, растаскивая их в противоположные стороны в горизонтальном направлении. Получаются два довольно тонких мазка. Иногда делают препараты-отпечатки. Для этого вырезанный острым скальпелем кусочек органа захватывают пинцетом и свободной поверхностью кусочка делают на стекле несколько тонких отпечатков.

Взятие материала для патологогистологического исследования. Материал берут от свежих трупов или убитых животных не позднее 12, а летом — 2—3 ч после смерти от тех органов или тканей, где обнаружены патологические изменения, а также из главнейших паренхиматозных органов. Из разных участков патологически измененных органов (тканей) вырезают небольшие тонкие (не более 1— 2 см толщиной) кусочки. Вместе с пораженными участками ткани захватывают и граничащую с ней нормальную ткань. При иссечении кусочка учитывают микроскопическое строение (структуру) того или иного органа (ткани). Так, кусочки из почки, надпочечника, лимфатического узла берут с таким расчетом, чтобы попадали оба слоя — корковый и мозговой; из головного мозга — серое и белое вещество; из селезенки — белую и красную пульпу; из легкого — части органа с бронхами и плеврой. Из сердца берут несколько кусочков: из мышцы правого и левого желудочков, правого и левого предсердий, папиллярных мышц и области клапанов. Из всех органов при иссечении захватывают и их капсулу. Из разных отделов желудочно-кишечного тракта вырезают небольшие кусочки размером 2 х 3 см и перед погружением в фиксирующую жидкость их растягивают на картон и прошивают белыми нитками.

Взятый материал помещают в фиксирующую жидкость (10%-ный водный раствор нейтрального формалина), объем которой в 4—5 раз превышает объем взятого материала. В холодное время года во избежание промерзания при пересылке материал, профилированный в формалине, перекладывают в 30—50%-ный раствор глицерина (приготовленный на 10%-ном растворе формалина), в 70%-ный спирт или в насыщенный раствор натрия хлорида.

Если формалина нет, то в качестве фиксирующей жидкости используют 96%-ный этиловый спирт или ацетон. При применении спирта толщина кусочков не должна превышать 0,5 см. Для гистохимических исследований патологический материал можно фиксировать также в жидкости Карнуа (спирт абсолютный — 60 мл, хлороформ — 30 мл и ледяная уксусная кислота — 10 мл) или в жидкости Буэна (концентрированная пикриновая кислота — 15 мл, формалин — 5 мл, ледяная уксусная кислота — 1 мл). Фиксирующую жидкость меняют каждые сутки до тех пор, пока она не станет прозрачной. Оптимальная температура фиксации 37 °С.

Патологический материал фиксируют в стеклянной или в крайнем случае в глиняной посуде.

На банку с кусочками органов и тканей наклеивают этикетку, на которой указывают номер или кличку животного и кому принадлежит, а внутрь ее опускают кусочек плотной бумаги или картона с написанным на нем простым (не химическим) карандашом номером животного.

Помещать в посуду несколько объектов исследования от разных животных можно только при том условии, если каждый из них завязывают в марлю вместе с отдельной этикеткой.

Упаковка и пересылка патологического материала. Трупы мелких животных, части трупов крупных животных и отдельные органы в свежем (нефиксированном) виде отправляют для исследования в лабораторию только с нарочным. Посылаемый материал, особенно от животных, подозрительных по заболеванию инфекционной болезнью, тщательно упаковывают в плотный деревянный или металлический ящик, чтобы предупредить возможность рассеивания возбудителя инфекции в пути. Перед упаковкой материал завертывают в холст или мешковину, смоченную дезинфицирующим раствором (фенольным креолином, лизолом, известковым молоком), обертывают целлофаном или полиэтиленовой пленкой и кладут в ящик со стружками, мякиной или опилками.

Части органов, жидкости, отправляемые в лабораторию почтой в фиксированном или консервированном виде, помещают в герметически закупоренную стеклянную посуду с притертой стеклянной, пластмассовой, резиновой или корковой пробкой. Пробку закрепляют проволокой или бечевкой и заливают менделеевской замазкой (сургучом, смолкой, парафином или воском), чтобы укупорка была непроницаемой для жидкости. Укупоренную посуду вкладывают в прочно сбитый ящик, плотно обкладывают ватой, паклей, стружками, опилками или другим упаковочным материалом.

Стеклянную посуду, в которой заключен посылаемый материал с подозрением на наличие особо опасных болезней (сап, сибирская язва, эмфизематозный карбункул, бруцеллез, туляремия, перипневмония крупного рогатого скота, чума крупного рогатого скота, чума свиней, псевдочума птиц, ящур, бешенство), обязательно упаковывают в металлическую коробку, которую запаивают, пломбируют или опечатывают, а затем упаковывают еще в деревянный ящик.

Если такой материал отправляют с нарочным, его кладут в стеклянную посуду, герметически закупоривают и помещают в деревянный ящик.

Взятие и отправка патологического материала при подозрении на отравление. Подозрение на отравление могут вызвать следующие признаки:

а) характерный запах содержимого желудка (горькоминдальный, чесночно-хлороформенный и т. п. при исключении запаха примененных лекарств);

б) окраска содержимого желудка: желтая (от азотной и пикриновой кислот, солей хрома), зеленая, синяя (от солей меди) или иного цвета;

в) кровянистое содержимое желудка;

г) подозрительные включения в содержимом желудка — белые кристаллы сулемы и стрихнина, нерастворившиеся белые кристаллы мышьяка;

д) набухшие, увеличенные, дряблые, легко разрывающиеся серо-желтой окраски и т. п. слизистая оболочка желудка, почки, сердце;

е) поражения начальных отделов пищеварительного тракта (ротовой полости, пищевода, желудка);

ж) изменение цвета и консистенции крови.

При подозрении на отравление в лабораторию направляют материал от трупов павших животных для химического и гистологического исследований. Одновременно с целью определения источника отравления посылают все корма (по 1 кг корма каждого вида), которые скармливали животным. Обязательно посылают остатки кормов из кормушки.

Для химического исследования в лабораторию посылают в отдельных банках следующий материал:

а) часть пищевода и пораженную часть желудка с содержимым (в количестве 0,5 кг), а от крупного и мелкого рогатого скота и верблюдов — часть пищевода, сычуга и небольшое количество содержимого из разных мест сычуга, рубца.

Желудок и его содержимое берут в следующем порядке.

При вскрытии трупа после осмотра внутренних органов перевязывают лигатурами пищевод и двенадцатиперстную кишку вблизи стенки желудка (по две лигатуры) и перерезают между ними. Желудок извлекают и кладут в кюветы, а затем вскрывают. Содержимое желудка предварительно (не выбирая из желудка) перемешивают (нельзя использовать металлические предметы), после чего осторожно, чтобы не загрязнить, берут часть его;

б) отрезок тонкого кишечника (длиной до 40 см) в наиболее пораженной части вместе с содержимым (до 0,5 кг);

в) отрезок толстого кишечника ^длиной до 40 см) в наиболее пораженной части вместе с содержимым (до 0,5 кг);

г) часть печени (0,5—1 кг) с желчным пузырем (от крупных животных), печень целиком (от мелких животных);

е) мочу в количестве 0,5 л;

ж) скелетную мускулатуру в количестве 0,5 кг.

Кроме того, в зависимости от особенностей предполагаемого отравления дополнительно посылают:

а) при подозрении на отравление через кожу (путем инъекции) — часть кожи, клетчатки и мышцы из места предполагаемого введения яда;