Пцр диагностика вирусных заболеваний у животных

1. Хламидиоз животных (семейство Chlamydiaceae)

Биологический материал для анализа: для исследования используют: соскобы слизистых оболочек (конъюнктивы, урогенитального тракта, а у птиц - клоаки), помет птиц, паренхиматозные органы павших или вынужденно убитых животных и птиц, кусочки плодовых оболочек, паренхиматозные органы и перевязанный с двух сторон сычуг аборт-плодов, сперму замороженную (или пробы эякулята), мочу от производителей, подозрительных по заболеванию.

2. Чума плотоядных (Canine Distemper virus)

Чума плотоядных – высококонтагиозная болезнь, проявляющаяся лихорадкой, воспалением слизистых оболочек глаз, дыхательных путей, кожной экзантемой и тяжелым поражением нервной системы. Заболевание регистрируется в любое время года, но весной и осенью протекает преимущественно в виде эпизоотий. Летальность колеблется от 50 до 80%. Чуму плотоядных вызывает РНК-содержащий вирус из семейства Paramyxoviridae, имеющий близкое родство с вирусом кори человека и вирусом чумы крупного и мелкого рогатого скота. Возбудитель относительно устойчив к действию внешних факторов. В выделениях больных животных, во внешней среде при температуре 4°С вирус сохраняется 7-11 дней, а при 100°С погибает мгновенно.

Чума плотоядных до сих пор признается трудноизлечимым заболеванием. Это связано с тем, что болезнь сопровождается поражением центральной нервной системы, при котором до настоящего времени не разработана эффективная терапия, и вызывается вирусом, на который сложно воздействовать из-за особенностей его цикла репродукции. К тому же следует дифференцировать другие заболевания, характеризующиеся сходными клиническими признаками, – парвовирусный энтерит и др. В связи с этим роль ранней диагностики чумы собак, до проникновения вируса через гематоэнцефалический барьер, является наиболее важной для владельцев животных и ветеринарных специалистов, оказывающих помощь больным.

Метод ПЦР позволяет достаточно быстро и точно выявлять РНК вирус чумы плотоядных (Canine Distemper virus). При соблюдении всех мер профилактики контаминации проб требуется всего 3-8 часов от взятия клинических проб до получения надежного диагноза.

Показания к назначению: диагностика чумы плотоядных.

Биологический материал для анализа: мазки или смывы (в малом объеме – не более 300 мкл жидкости) конъюнктивы глаз, мазки со слизистой носа, мазки со слизистой прямой кишки, цельная кровь, плазма крови, сыворотка крови, фекалии животных.

3. Ринотрахеит кошек (Feline herpes virus)

Инфекционный ринотрахеит кошек — остропротекающая вирусная инфекционная болезнь, сопровождающаяся поражением глаз и органов дыхания.

Возбудитель - ДНК содержащий вирус семейства Herpesviridae. Заболеваемость составляет 50%, смертность 5-20%. Вирус ИРТ кошек является видоспецифическим заболеванием, которое не опасно для других видов домашних животных и человека. Зараженные и переболевшие кошки являются источником возбудителя инфекции. Даже после полного выздоровления, кошки становятся переносчиками ринотрахеита еще на 8-9 месяцев. Заражение осуществляется через выделения из носа, глаз и половых органов. Передача вируса так же происходит через воздух, предметы ухода, насекомых, корма. Аэрогенный способ заражение самый распространенный в естественной среде.

Показания к назначению: ринотрахеит кошек

Биологический материал для анализа: смывы с конъюнктивы глаз и поврежденной слизистой носоглотки, а также с изъязвлений слизистой ротовой полости.

4. Вирус кальцивироза кошек (Feline calicivirus)

Возбудитель калицивироза — инфекционного заболевания кошек, проявляющегося повышением температуры, конъюнктивитом, изъязвлением слизистых ротовой и носовой полости, хромотой. Симптомы — возникновение язв в ротовой полости, слюнотечение, общее недомогание, гипертермия, иногда конъюнктивит, чихание, отказ от еды, одышка. Большинство кошек после выздоровления выделяют вирус в течение 75 дней, а некоторые — в течение всей жизни.

Показания к назначению: 1) Диагностика калицивироза кошек; 2) Установление калицивирусной этиологии: артриты; заболевания дыхательной системы; заболевания глаз; язв ротовой полости 3) Оценка эффективности лечения.

Биологический материал для анализа: соскобы из язв ротовой полости; смывы со слизистой конъюнктивы глаз; смывы со слизистой носа и ротоглотки.

5. Коронавирус кошек и собак (Canine Coronavirus, Feline Coronavirus)

Возбудителем коронавирусной инфекции у собак является Canine coronavirus, вызывающий острый коронавирусный энтерит. Заболевание передается при непосредственном контакте с носителем вируса (через слюну и фекалии). Данной инфекции подвержены собаки любого возраста, однако чаще всего поражаются щенки и ослабленные животные, которые уже перенесли другую болезнь, например, парвовирусную инфекцию. Основные симптомы заболевания — рвота и диарея, иногда с примесью крови, обезвоживание организма, потеря в весе, апатия. Через 3-4 недели после выздоровления может развиться повторное заболевание. При проведении диагностики коронавирусный энтерит собак необходимо дифференцировать от парвовирусного энтерита, аденовирусной инфекции кишечного типа и чумы плотоядных.
Коронавирусы, поражающие кошек, представлены двумя биотипами: FECV, или коронавирус энтерита кошек, и FIPV — вирус инфекционного перитонита кошек (2, 3). Носителями FECV является 16-50% домашних кошек, у которых вирус локализуется в тонком кишечнике, не вызывая заболевания или становясь причиной легкой диареи. В то же время у 5-12% носителей может наблюдаться мутация условно-патогенной кишечной формы FECV в патогенную (FIPV), что приводит к развитию болезни.

Показания к назначению: 1) Диагностика коронавирусного энтерита собак и кошек; 2) Неясная клиническая картина; 3) Контроль эффективности терапии; 4) Профилактические скрининговые исследования (для исключения вероятности бессимптомного течения инфекции).

Биологический материал для анализа: плазма крови, асцитическая жидкость и фекалии

6. Аденовирус плотоядных (Canine adenovirus I, II)

Canine adenovirus II вызывает аденовироз собак (инфекционный ларинготрахеит) Основные симптомы – это кашель и выделения из носа. Кашель часто усиливается от питья, еды и выхода на свежий воздух. Характерным кашлем при аденовирозе является кашель до рвоты или отрыжки. При этом увеличиваются лимфатические узлы, и часто повышается температура. Возможны конъюнктивиты. Кроме того, имеют место различные диспептические явления: понос (часто с кровью), иногда рвота. Собака угнетена, аппетит снижен. В каловых массах остатки непереваренного корма. Температура субфебрильная или нормальная.

Показания к назначению: 1) Диагностика гепатита плотоядных, аденовироза собак. 2) Подозрения на аденовирусную этиологию гепатита, поражения глаз, ларинготрахеита, увеличения лимфатических узлов, диспептических явлений. 3) Скрининговые исследования.

Биологический материал для анализа: смывы с конъюнктивы (в первую неделю после появления конъюнктивита), выделения из носа (в первую неделю после их появления), фекалии (при наличии расстройства ЖКТ) и сыворотка крови (при подозрении на гепатит собак)

7. Микоплазмоз плотоядных (Mycoplasma)

Возбудители микоплазмоза относятся к классу Mollicutes и являются грамотрицательными очень мелкими (0,2 – 0,3 мкм) организмами, характеризующимися отсутствием жесткой клеточной стенки. Заражение микоплазмами происходит воздушно-капельным путем, контактным путем через предметы обихода, половым и натальным путем во время прохождения плода через родовые пути. Микоплазмоз встречается как у животных при групповом содержании (питомники), так и при одиночном содержании. Наиболее часто болеют молодые животные или животные с ослабленной иммунной системой. Микоплазмоз у животных часто сопровождается вторичной бактериальной инфекцией. Заболевание часто переходит в хроническую форму. Микоплазмоз проявляется одно- или двухсторонними конъюнктивитами с серозными, а затем и слизисто-гнойными выделениями, ринитами, пневмониями, артритами, кожными абсцессами. Могут наблюдаться циститы, вагиниты, уретриты, нарушения желудочно-кишечного тракта. Микоплазмы могут быть причиной бесплодия и абортов у самок, рождения нежизнеспособного молодняка.

Показания к назначению: 1) Диагностика микоплазмоза плотоядных.

Биологический материал для анализа: назальные, конъюнктивальные смывы, истечения, синовиальная жидкость суставов, желток, аллантоисную жидкость эмбрионов, паренхиматозные органы, трахею, воздухоносные мешки павшей птицы, цельную кровь, сыворотки (лечебные), культуры клеток (оптимальная концентрация 10 6 клеток в мл), сперма в объеме не менее 2 мл.

8. Вирус иммунодефицита кошек (Provirus)

Вирус иммунодефицита кошек - ретровирус, для которого свойственна тропность к клеткам лимфоидной ткани. При заражении кошки вызывает синдром иммунодефицита.

Распространяется в кошачьей популяции парентеральным путем, обычно через рану, редко - трансплацентарно или в процессе родов. Могут поражаться нервные клетки, мегакариоциты и мононуклеарные клетки костного мозга. Если к поражению, вызванного вирусом иммунодефицита присоединяется вирус лейкоза кошек, то это приводит к поражению почек, головного мозга, печени и других тканей. Заболеваемость повышается с возрастом, наиболее часто выявляется в 5 лет. Коты более подвержены риску заражения. Активному распространению инфекции способствует вольный образ жизни кошки и контакты с другими бродячими животными. Первыми признаками инфекции могут быть рецидивирующие болезни верхних дыхательных путей и желудочно-кишечного тракта. Затем развиваются умеренная или выраженная лимфаденопатия, лимфосаркома или другие новообразования. На фоне иммунодефицита у 25-50% животных возникают гингивит, стоматит, периодонтоз; в 30% случаев - ринит, конъюнктивит, кератит; в 10-20% случаев - персистирующая диарея, вызванная инфекцией (бактериальной, вирусной, грибковой или паразитарной) или обусловленная прямым воздействием вируса на эпителий кишечника. Активизируется хроническая бактериальная или микотическая инфекция, наблюдаются поражения глаз по типу переднего увеита, хориоретинита, глаукомы; неврологические расстройства (периферическая нейропатия). Лихорадка и слабость наиболее выражены на поздних стадиях болезни и возможно обусловлены высоким уровнем фактора некроза опухоли.

Показания к назначению: 1) Диагностика вируса иммунодефицита кошек

Биологический материал для анализа: цельная кровь.

9. Парвовирусный энтерит собак и панлейкопения кошек (Canineparvovirus, Felinepanleukopeniavirus, Minkenteritisvirus)

Высококонтагиозная вирусная болезнь собак, характеризующаяся в основном острым геморрагическим энтеритом, обезвоживанием организма, лейкопенией и миокардитом. ДНК-содержащий вирус, относится к семейству Parvoviridae роду Parvovirus. Существует две разновидности парвовируса собак (ПВС): ПВС-1 и ПВС-2. Наиболее опасен патогенный ПВС-2, который обусловливает острые парвовирусные энтериты у собак. Заражение происходит в основном фекально-оральным способом через инфицированные ПВС корма и воду, а также контактным - при обнюхивании и облизывании непосредственно больных животных или инфицированных ими объектов внешней среды. Инкубационный период при парвовирусном энтерите составляет обычно от 4 до 10 дней, а у 1-2 месячных щенков - 1-3 дня. Заболеванию подвержены собаки любого возраста, но наиболее восприимчивы к болезни щенки в возрасте от 2 до 16 недель. Это объясняется тем, что возбудитель ПВС-2 особенно быстро размножается в клетках с высоким уровнем митоза (основная форма клеточного деления), а у щенят в возрасте до 4 недель активно делятся клетки миокарда, позднее - клетки лимфоидной ткани, костного мозга и эпителия кишечных крипт. Наиболее часто болезнь наблюдают у щенков, полученных от невакцинированных сук. В зависимости от степени выраженности клинических признаков условно разделяют три основные формы болезни: сердечную, кишечную и смешанную.

Показания к назначению: диагностика и выявление ДНК парвовирусов (Canineparvovirus, Felinepanleukopeniavirus, Minkenteritisvirus), вызывающих парвовирусный энтерит собак и норок и панлейкопению кошек

Биологический материал для анализа: в мазках со слизистой прямой кишки и фекалии.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ

Студент должен знать:

-морфологию, экологию, физиологию вирусов, методы их изучения;

-основы эпидемиологии вирусных инфекций (типы инфекций);

-основы химиотерапии и химиопрофилактики вирусной инфекции;

-факторы иммунитета при вирусных инфекциях.

Студент должен уметь:

-проводить профилактику вирусных инфекций;

-составлять алгоритмы действия в условиях эпидемии.

Вопросы для фронтального обсуждения:

1.Дайте понятие вирусам. Охарактеризуйте особенности строения и жизни вирусной частицы.

2.Какими факторами осуществляется защита организма человека от вируса.

3.Назовите группу и механизм действия препаратов на вирусы. Приведите примеры препаратов.

4.Назовите типы инфекции, вызываемые вирусами.

5. Назовите представителей кишечных, кровяных, респираторных вирусных инфекций, инфекций кожных покровов и слизистых.

7.Назовите, как называются мероприятия, ликвидирующие эпидемический процесс.

Самостоятельная работа студентов:

Запишите определения методов исследования вирусных инфекций.

Зарисйте в атлас внутриклеточные включения при натуральной оспе (тельца Гварниери), при бешенстве (тельца Бабеша-Негри).

3.Составьте план противоэпидемических мероприятий на вирусную инфекцию (инфекцию определяет преподаватель).

Краткие теоретические положения

Введение

Расширение возможностей в лечении и профилактике вирусных болезней с использованием противовирусных препаратов, иммуномодуляторов и вакцин с различным механизмом действия нуждается в быстрой и точной лабораторной диагностике. Узкая специфичность некоторых противовирусных препаратов также требует быстрой и высокоспецифичной диагностики инфицирующего агента. Появилась необходимость в количественных методах определения вирусов для мониторинга противовирусной терапии. Помимо установления этиологии заболевания лабораторная диагностика имеет важное значение в организации противоэпидемических мероприятий.

Ранняя диагностика первых случаев эпидемических инфекций позволяет своевременно провести противоэпидемические мероприятия – карантин, госпитализацию, вакцинацию и пр. Реализация программ по ликвидации инфекционных заболеваний, например натуральной оспы, показала, что по мере их выполнения возрастает роль лабораторной диагностики. Существенную роль играет лабораторная диагностика в службе крови и акушерской практике, например, выявление доноров, инфицированных вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), вирусом гепатита В (HBV), диагностика краснухи и цитомегаловирусной инфекции у беременных.

Методы диагностики вирусных инфекций

Для успешного выделения вирусов клинический материал должен быть взят в соответствии с патогенезом предполагаемого заболевания и в наиболее ранние сроки.

Как правило, берутся:

– при респираторных инфекциях – носоглоточный смыв;

– при энтеровирусных инфекциях – смыв и фекалии (рео-, энтеровирусы);

– при поражениях кожи и слизистых оболочек – соскобы, содержимое пузырьков (герпес, ветряная оспа);

– при экзантемных инфекциях – смывы (корь, краснуха);

– при арбовирусных инфекциях – кровь, спинномозговая жидкость.

1.Быстрые (экспресс-методы) — прямое обнаружение вируса или его компонентов (антигенов, НК), включений непосредственно в клиническом материале.

А. Вирусоскопический метод заключается в об­наружении вируса в исследуемом материале под микроскопом. Чаще всего используют электронный микроскоп. Световая микроскопия из-за нич­тожно малых размеров вирусов практически не применяется. При данном методе можно определить тип НК, размеры вириона, форму вириона, а также выявить внутрик­леточные включения, которые образуются в пораженных клетках при некоторых инфек­циях.

II. Вирусологический метод основан на:

культивировании вирусов в чувствительных биологических системах (клеточных культурах, курином эмбрионе, организмах лабораторных животных),их индикации по цитопатогенному действию на биологическую систему (рис.1), идентификации по ингибиции действия вирусов соответствующими противовирусными антителами (рис.2).

Рис. 1. Цитопатическое действие вирусов на клетку: А-нормальный рост, Б-ЦПД вирусов на клетку

Рис.2 Ингибиция вируса антителами

Вирусологическое исследование - это "золотой стандарт" вирусологии и должно проводится в специализированной вирусологической лаборатории. В настоящее время оно используется практически только в условиях возникновения эпидемической вспышки того или иного вирусного инфекционного заболевания.

III. Серологический метод — определение противовирусных антител (оптимально — IgM) и/или определение динамики нарастания их титров за определенный период заболевания в парных сыворотках. Диагностически значимым считают нарастание титра антител в 4 и более раз.

Метод парных сывороток:осуществляем сбор венозной крови в количестве 10 мл в начале болезни и в конце, приготавливаем сыворотку, определяем количество антител в первой и второй сыворотке.

При этом четырехкратное нарастание титра антител во второй сыворотке в большинстве случаев служит показателем протекающей или свежеперенесенной инфекции. При исследовании одной сыворотки, взятой в острой стадии болезни, диагностическое значение имеет обнаружение антител класса Ig М, свидетельствующее об острой инфекции.

Современные методы диагностики:

1.ПЦР-выявляют персистирующие вирусы по НК, находящиеся в клиническом материале, с трудом обнаруживаемые или не обнаруживаемые другими методами.

2.Радиоизотопный иммунный анализ (РИА)-метод основан на метке антител радиоизотопами, что обеспечивало высокую чувствительность в определении вирусного антигена. Широкое распространение метод получил в 80-е годы, особенно для определения маркеров HBV и других некультивируемых вирусов. К недостаткам метода относится необходимость работать с радиоактивными веществами и использования дорогостоящего оборудования (гамма-счетчиков).

3.Иммуноферментный анализ (ИФА) – Иммуноферментные методы определения вирусных антигенов в принципе сходны с РИФ, но основываются на мечении антител ферментами, а не красителями. Наиболее широко используется пероксидаза хрена и щелочная фосфатаза, применяют также b-галактозидазу и b-лактамазы. Меченые антитела связываются с антигеном, и такой комплекс обнаруживается при добавлении субстрата для фермента, с которым конъюгированы антитела. Конечный продукт реакции может быть в виде нерастворимого осадка, и тогда учет проводится с помощью обычного светового микроскопа, или в виде растворимого продукта, который обычно окрашен (или может флюоресцировать или люминесцировать) и регистрируется инструментально.

Поскольку с помощью ИФА можно измерять растворимые антигены, то не требуется наличия интактных клеток в образце и таким образом могут использоваться различные виды клинического материала.

Другое важное преимущество метода ИФА – возможность количественного определения антигенов, что позволяет применять его для оценки клинического течения болезни и эффективности химиотерапии. ИФА, как и РИФ, может применяться как в прямом, так и в непрямом варианте.

Твердофазный ИФА, дающий растворимый окрашеный продукт реакции, нашел наибольшее распространение. ИФА может быть использован как для определения антигена (тогда на твердую фазу – дно лунки полистиролового планшета – наносятся антитела), так и для определения антител (тогда на твердую фазу наносятся антигены).

4.Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) – Метод основан на использовании антител, связанных с красителем, например флюоресцеинизотиоцианатом. РИФ широко применяется для выявления вирусных антигенов в материале больных и для быстрой диагностики.

В практике применяются два варианта РИФ: прямой и непрямой. В первом случае применяются меченные красителем антитела к вирусам, которые наносятся на инфицированные клетки (мазок, культура клеток). Таким образом, реакция протекает одноэтапно. Неудобством метода является необходимость иметь большой набор конъюгированных специфических сывороток ко многим вирусам.

При непрямом варианте РИФ на исследуемый материал наносится специфическая сыворотка, антитела которой связываются с вирусным антигеном, находящимся в материале, а затем наслаивается антивидовая сыворотка к гамма-глобулинам животного, в котором готовилась специфическая иммунная сыворотка, например антикроличья, антилошадиная и т. п. Преимущество непрямого варианта РИФ состоит в потребности лишь одного вида меченых антител.

Метод РИФ широко применяется для быстрой расшифровки этиологии острых респираторных вирусных инфекций при анализе мазков-отпечатков со слизистой оболочки верхних дыхательных путей. Успешное применение РИФ для прямой детекции вируса в клиническом материале возможно лишь в случае содержания в нем достаточно большого числа инфицированных клеток и незначительной контаминации микроорганизмами, которые могут давать неспецифическое свечение.

5.Другие методы диагностики –

РТГА используется для диагностики заболеваний, вызванных гемагглютинирующими вирусами. Она основана на связывании антителами сыворотки больного добавленного стандартного вируса. Индикатором реакции являются эритроциты, агглютинирующиеся вирусом (формирование характерного "зонтика") при отсутствии специфических антител и оседающие на дно неагглютинированными при их наличии.

РСК является одной из традиционных серологических реакций и используется для диагностики многих вирусных инфекций. В реакции принимают участие две системы: антитела сыворотки больного + стандартный вирус и эритроциты барана + антитела к ним, а также оттитрованный комплемент. При соответствии антител и вируса этот комплекс связывает комплемент и лизиса бараньих эритроцитов не происходит (положительная реакция). При отрицательной РСК комплемент способствует лизису эритроцитов. Недостатком метода является его недостаточно высокая чувствительность и трудность стандартизации реагентов.

Для учета значимости РСК также, как и РТГА, необходимо титрование парных сывороток, то есть взятых в начале заболевания и в период реконвалесценции.

РПГА – агглютинация сенсибилизированных вирусными антигенами эритроцитов (или полистироловых шариков) в присутствии антител. На эритроцитах могут быть сорбированы любые вирусы, независимо от наличия или отсутствия у них гемагглютинирующей активности. В связи с наличием неспецифических реакций сыворотки исследуются в разведении 1:10 и более.

РНГА – агглютинация эритроцитов, сенсибилизированных специфическими антителами в присутствии вирусных антигенов. Наибольшее распространение РОПГА получила при выявлении HBs-антигена как у больных, так и у доноров крови.

Бактериальные и вирусные заболевания — одни из наиболее часто встречающихся заболеваний домашних животных. Это, например, пироплазмоз, лептоспироз, гепатит, чумка, герпесвирус, калицивироз, хламидиоз и др.

До настоящего времени диагностика таких заболеваний вызывала затруднения, поскольку существующие виды анализов из-за их малой доступности не нашли широкого применения в ветеринарии. Зачастую работа по диагностике и лечению вирусных и бактериальных инфекций строится на основании одних лишь симптомов заболевания и личного опыта врача. При этом нужно учитывать, что часто различные вирусы и бактерии могу вызывать одинаковые симптомы заболевания. Разумеется, рассчитывать на высокую эффективность лечения при таких условиях невозможно. Но с появлением нового диагностического инструмента — анализа ПЦР — ситуация существенно изменилась! Теперь на основании данного анализа ветврач может точно определить заболевание и назначить эффективное лечение или скорректировать уже проводимое.

ПЦР (полимеразная цепная реакция) — высокоточный метод диагностики многих инфекций, который основывается на исследовании генетического материала животных (ДНК и РНК). Это один из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний.

ДОСТОИНСТВА МЕТОДА

Универсальность. ПЦР позволяет обнаруживать любые ДНК и РНК, даже когда бессильны другие методы.

Специфичность. При поиске определяется вид конкретного возбудителя. Кроме того в одном биологическом материале, возможен поиск нескольких возбудителей без ущерба для качества полученных данных.

Чувствительность. Результат будет получен даже при минимальном содержании возбудителя в материале, например, на начальной стадии заболевания или если заболевание не вылечено окончательно. А лечение болезни на раннем этапе значительно повышает эффективность и скорость выздоровления пациента, предотвращает риски осложнений.

Оперативность. Результат анализа готов уже через сутки.

Так как все инфекции собак и кошек можно разделить на несколько групп: системные, кровопаразитарные, офтальмологические, респираторные, дерматофитозные, половые, желудочно-кишечные, то и забор материала должен проводиться с соответствующих мест. Материалом для исследования может служить: кровь, слюна, мокрота, фекалии, соскобы и суспензии клещей.

Несмотря на вышеуказанные трудности ПЦР остается наиболее доступным и совершенным на сегодняшний день приемом диагностики.

КАКИЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ ОПРЕДЕЛЯЮТСЯ МЕТОДОМ ПЦР?

1. Герпесвирусная инфекция — приводит к абортам, высокой смертности новорожденных (инфицирование почти в 60% случаев).
2. Калицивирус — тяжело протекает у котят, в то же время 25-80% переболевших взрослых животных становятся носителями и являются источником заражения, передавая вирус через слюну.
3. Панлейкопения — вирусное заболевание кошек, характеризующееся резким падением уровня лейкоцитов, гастроэнтеритом, ринитами с конъюнктивитами, высокой смертностью (30-90 %) заболевших котят.
4. 4. Короновирусная инфекция — тяжелое заболевание, возбудителем которого является РНК-содержащий высокопатогенный вирус.
5. Иммунодефицит кошек и лейкемия кошек — вирус поражает иммунную и нервную системы.
6. Аденовирус и чума плотоядных у собак проявляется комплексом симптомов: лихорадка, конъюнктивиты и ринотрахеиты, расстройство желудочно-кишечного тракта, поражение нервной системы.
7. Токсоплазмоз — промежуточными хозяевами могут быть кошка, собака, человек. Клинические симптомы зависят от пораженных органов: могут наблюдаться неврологические нарушения (тремор, паралич) или нарушения походки, атрофия мышц, а также миокардит и гепатит.
8. Хламидиоз — у кошек заболевание проявляется в основном в форме гнойных и негнойных конъюнктивитов и кератитов, также могут наблюдаться ринит, пневмония, вагинит, аборты и бесплодие. У котят встречается конъюнктивит. У собак симптомы разнообразны и проявляются воспалительными заболеваниями конъюнктивы, половых органов, гастритами, артритами, абортами и бесплодием. Есть данные о роли хламидий в развитии атеросклероза у собак.
9. Микоплазмоз — протекает с признаками бронхопневмонии, кератоконъюктевитов и кератитов.
10. Пироплазмоз, анаплазмоз, боррелиоз — заболевания, переносимые клещами.

Все перечисленные заболевания очень коварны, так как легко и быстро передаются от больных животных здоровым (а также людям) и имеют высокий показатель смертности при отсутствии должного лечения.

ПЦР-метод позволяет гарантированно обнаруживать даже единичных возбудителей в биологическом материале за короткий промежуток времени, благодаря чему врач может поставить точный диагноз, назначить адекватное лечение и разработать профилактические мероприятия.

Радюк Екатерина Васильевна – врач-лаборант ИВЦ МВА

Инфекционные заболевания весьма часто встречаются в ветеринарной практике. Для владельца животного важно вовремя обратить внимание на симптомы недомогания питомца. Для большинства инфекционных заболеваний эти симптомы неспецифичны: угнетение, отказ от корма, повышенная температура тела, рвота, понос; при некоторых заболеваниях встречается хромота и опухание суставов; возможно изменение цвета мочи.

Для ветеринарного врача, к которому приводят заболевшее животное, важно составить список дифференциальных диагнозов и исключить (или подтвердить) их специальными методами диагностики. Однако стоит помнить, что выбор диагностического метода будет зависеть от вида возбудителя, его локализации и стадии заболевания. Методика, применимая для диагностики одной инфекции, совершенно неприемлема для диагностики другой.

В данной статье представлен обзор основных методов диагностики инфекционных заболеваний, которыми располагает современная ветеринарная медицина.

Возбудители многих заболеваний, как правило, достаточно требовательны к питательным средам и достаточно сложны для культивирования invitro. Не для всех возбудителей определены условия культивирования. В некоторых случаях используют синтетические или полусинтетические среды – однако при этом рост возбудителей очень медленный (до нескольких месяцев) и всегда присутствует значительный риск грибковой или бактериальной контаминации, несмотря строгое соблюдение асептики. Кроме того, проведение работ по культивированию возможно только в специализированных микробиологических лабораториях. Поэтому в ветеринарии данный метод не нашел широкого применения при диагностике инфекционных заболеваний; работы, связанные с культивированием возбудителей, проводятся, как правило, только в специальных исследовательских институтах с целью их более детального изучения и разработки диагностических тест-систем.

2. Световая микроскопия

1) Микроскопия фиксированных окрашенных препаратов

Является наиболее доступным и потому распространенным методом диагностики инфекционных (особенно трансмиссивных) заболеваний в ветеринарной медицине. Основан на выявлении возбудителя в клиническом материале по характерной морфологии. Однако, несмотря на свою простоту и доступность, у этого метода есть свои недостатки.

Во-первых, у метода световой микроскопии достаточно ограниченная чувствительность. При незначительном количестве возбудителей в материале результат микроскопии может быть отрицательным.

Во-вторых, необходимо тщательное приготовление и окраска мазков для минимизации возможных артефактов.

В-третьих, лаборанту или врачу, интерпретирующему мазок, требуется достаточный опыт и хорошее знание морфологии как клеток тканей, так и возбудителей и умение отличать последних от возможных рефракционных артефактов или преципитатов красителя. И, в-четвертых, точное определение вида возбудителя при использовании только световой микроскопии возможно далеко не всегда. Поэтому световую микроскопию стараются дополнять другими методами диагностики, основанными на обнаружении специфических антител либо генетического материала возбудителя.

2)Темнопольная микроскопия

Вид оптической микроскопии, в которой контраст изображения увеличивают за счет регистрации только света, рассеянного изучаемым образцом. Как правило, используется для обнаружения спирохет - боррелий и лептоспир. Из-за необходимости наличия специального оборудования в рутинной ветеринарной практике применяется редко. Кроме того, с помощью темнопольной микроскопии невозможно определить видовую принадлежность возбудителя и его патогенность.

3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод ферментативного получения ампликонов (большого количества копий) исследуемых фрагментов ДНК путем повторных циклов репликации и денатурации (разделения цепи ДНК на отдельные нити); при этом происходит копирование только исследуемого участка ДНК (при условии его присутствия в данном образце), поскольку только этот участок соответствует заданным условиям.

Метод ПЦР идеально подходит для обнаружения микроорганизмов, трудно визуализирующихся, медленно растущих или сложных в культивировании. ПЦР является наиболее предпочтительным методом для диагностики заболевания в острый период. Основным лимитирующим фактором при использовании ПЦР является содержание в исследуемой пробе достаточного количества материала (нуклеиновой кислоты возбудителя). Для многих возбудителей известно, что их количество в крови меняется с течением времени; таким образом, в какой-то момент времени ПЦР может показать ложноотрицательный результат у инфицированного пациента. Таким образом, для врача крайне важно знать тропность возбудителя к тканям организма и отправлять на исследование тот материал, в котором вероятность обнаружения возбудителя наиболее высока (например, мочу – при диагностике лептоспироза, плаценту или пунктат семенников при подозрении на бруцеллез, синовиальную жидкость - при исследовании на боррелиоз).

4. Серологические методы диагностики

Данные методы основаны на выявлении у животных специфических антител. Заражение инфекционным агентом, если оно происходит впервые, в течение недели вызывает у животного умеренный рост иммуноглобулинов класса М (IgM) и постепенное увеличение иммуноглобулинов класса G (IgG), которое достигает пика через 14 дней. Определение уровня антител у животных с остро начинающимся заболеванием (таким как бабезиоз) дает мало полезной диагностической информации. Для диагностики хронических заболеваний (например, моноцитарного эрлихиоза) измерение уровня антител будет более полезным.

Продукция антител у каждого животного может сильно варьироваться; этот процесс зависит от возраста, иммунного статуса и генетической принадлежности. Лучший способ оценки степени сероконверсии заключается в исследовании парных сывороток, взятых с интервалом в 2-3 недели. Растущий титр антител указывают на недавнюю и, следовательно, клинически значимую инфекцию, особенно если это подтверждается соответствующими клиническими признаками. Альтернативным методом определения недавней инфекции является измерение уровня IgM, однако в ветеринарной практике данный метод практически не используется.

1) Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA)

Принцип метода заключается в том, один их специфических реагентов (антиген) иммобилизуют на твердой фазе. Затем последовательно добавляют другие специфические реагенты, проводя после инкубации каждого из них промывку с целью удаления несвязавшихся компонентов. Один из специфических реагентов, так называемый конъюгат, содержит ферментную метку. Для визуализации результата в конце реакции добавляют хромогеновый субстрат. Через определенный промежуток времени реакцию останавливают и проводят считывание на спектрофотометре.

Для определения титра антител в сыворотке готовят несколько последовательных разведений; титр антител определяется как обратный последнему видимому разведению (к примеру, если последнее разведение было 1:2000, то титр антител составит 2000). Метод твердофазного ИФА является наиболее предпочтительным для определения наличия антител к возбудителям, антигены которых легкодоступны (т.е. это либо легко культивируемые микроорганизмы, либо те, для которых получены рекомбинантные антигены). Кроме того, он может использоваться и для выявления антигенов возбудителя – например при диагностике инвазии Dirofilariaimmitisили вируса лейкемии кошек.

Для использования полноценного твердофазного иммуноферментного анализа необходимо наличие специального лабораторного оборудования. Однако существует экспресс-модификация ИФА (SNAP, IDEXX Laboratories), где антиген/антитела иммобилизированы не на плашке, а на мембранном фильтре. Эти тесты широко используются в клиниках для диагностики трансмиссивных заболеваний (лейшманиоза, дирофиляриоза, анаплазмоза, эрлихиоза и боррелиоза). Однако они не дают возможность зафиксировать рост или снижение титра антител, а также определить их принадлежность к M или G классу.

2) Метод флюоресцирующих антител (МФА, IFA)

В случае, когда культивирование микроорганизма сопряжено с техническими сложностями либо небезопасно, применяют метод иммунофлюоресценции. При этом может быть обнаружен как сам организм в зараженных клетках и тканях пациента (прямой МФА) либо наличие в сыворотке специфичных антител (непрямой МФА). В непрямом МФА зараженные клетки (как правило, культурального происхождения) зафиксированы на предметных стеклах либо планшетках. Сама процедура исследования схожа с таковой в ИФА. Однако в конъюгате вместо фермента здесь используется специальный краситель, дающий при определенной длине волны флюоресцентное свечение, которое можно видеть в специальный микроскоп. Количество антител также определяется по последнему разведению, давшему положительный результат.

Прямой МФА считается менее чувствительным; используется в тех случаях, когда число зараженных клеток невелико (например, для выявления в мазках крови морул Anaplasmaphagocytophilum).

3) Иммуноблот (вестерн-блот)

Таким образом, в статье были рассмотрены основные методы, применяемые сегодня для диагностики инфекционных заболеваний животных. Особое внимание хотелось бы уделить тому, что не существует какого-либо универсального метода для диагностики того или иного заболевания. Поэтому от врача при постановке диагноза требуется комплексный подход; необходимо учитывать анамнез, длительность заболевания, клинические признаки и данные общих лабораторных исследований.

Кроме того, необходимо умение правильно интерпретировать результаты – ведь даже обнаружение антител (особенно класса G) к тому или иному возбудителю не говорит о том, что именно этот этиологический агент является причиной нынешнего состояния животного. Только грамотное применение и интерпретация специальных методов исследования (не только при диагностике трансмиссивных заболеваний) в сочетании с клинической картиной дает возможность правильно поставить диагноз и назначить адекватное лечение.