Поддержание вирусных штаммов в лабораториях
Читайте также:
|
(1).jpg)
| Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации | Г.Г. Онищенко |
Рекомендуется использование следующей стабилизирующей среды для хранения и транспортировки материала от людей для дальнейших вирусологических исследований.
Среда готовится в стерильных условиях, автоклавирование не допускается, можно стерилизовать фильтрованием через нитроцеллюлозный стерильный фильтр в стерильную же посуду.
- среда для культур клеток N199, содержащая 0,5% BSA;
- пенициллин 2 х 10(6) ед./л, стрептомицин 200 мг/л, полимиксин В 2 х 10(6) ед./л, гентамицин 250 мг/л, нистатин 0,5 х 10(6) ед./л.
Методические указания МУК 4.2.2136-06 “Организация и проведение лабораторной диагностики заболеваний, вызванных высоковирулентными штаммами вируса гриппа птиц типа А (ВГПА), у людей” (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ 9 ноября 2006 г.)
Текст методические указания официально опубликован не был
2. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 9 ноября 2006 г.
Шпаргалка Шпаргалка по "Вирусологии"
31. Принцип и практическое использование РН в вирусологии.
Основными составляющими компонентами этой реакции являются: иммунная вируснейтрализующая (опытная) и нормальная (контрольная) сыворотки одного и того же вида животного или человека; содержащий живые вирусы материал, являющийся антигеном; биологические объекты (мыши, куриные эмбрионы), на которых обнаруживают вируснейтрализующее действие иммунной сыворотки. Применяют два варианта постановки реакции нейтрализации. При одном из них берут постоянную дозу сыворотки и различные разведения вируса, при втором – постоянное разведение вируса и различные разведения сыворотки. Во всех случаях последовательность проведения реакции следующая:
-
предварительный контакт вируссодержащего материала с соответствующей иммунной сывороткой (один из этих компонентов заведомо известен, наличие другого определяется);
введение этой смеси в чувствительную биологическую систему (белым мышам или куриным эмбрионам);
учёт наличия или отсутствия нейтрализации.
Антигены (вируссодержащие взвеси) получают из материала от больных вирусными инфекциями, готовят из органов и тканей заражённых вирусом животных, куриных эмбрионов, а также из инфицированных клеточных культур и подвергают очистке. Перед употреблением антиген титруют для определения его активности.
Биологические объекты выбирают с учётом свойств вируса, чувствительности самого объекта к действию вируса, а также задач и условий исследования.
Постановка реакции нейтрализации (I вариант)
Ставят для идентификации выделенного вируса. Для постановки реакции берут два ряда пробирок, из которых первый ряд является опытным, а второй – контрольным. В первый ряд пробирок наливают определённое количество неразведённой диагностической иммунной сыворотки, во второй – контрольный – такое же количество неразведённой нормальной сыворотки того же вида животного. Отдельно в пробирках готовят несколько разведений вируса, чтобы при добавлении их в пробирки опытного, контрольного ряда получились последовательные 10-кратные разведения вируса (например, 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 и т.д.). Сыворотки и добавляемые разведения вируса должны быть в одинаковых объёмах, например по 0,2 мл. Пробирки с приготовленной смесью ставят в термостат при температуре 37 0 С обычно на 1-2 часа. После этого опытные и контрольные смеси вводят мышам или в куриные эмбрионы. Каждым разведением для достоверности опыта заражают не менее 4 мышей или куриных эмбрионов.
За заражёнными животными ( опытными и контрольными) устанавливают наблюдение в течение 2-х недель, регистрируют заболевших и погибших мышей. Учёт реакции проводят путём сопоставления количества погибших опытных и контрольных мышей от соответствующего разведения вируса. Определяют 50%-ную смертельную дозу – LD50, проводя подсчёт по Риду и Менчу. Высчитывают индеек нейтрализации (ИН) по формуле, определяющей количество доз, нейтрализуемых сывороткой:
Титр вируса в опыте с нормальной сывороткой
ИН = ------------------------------ ------------------------------ --------
Титр вируса в опыте с иммунной сывороткой
ИН менее 10 – отрицательный;
ИН – 11-49 – сомнительный;
ИН равный 50 и выше – положительный.
Заражённые эмбрионы инкубируют при температуре 35-37 0 С от 48 до 72 ч. Затем яйца вскрывают, аллантоисную или амниотическую жидкость отсасывают и в ней определяют наличие вируса при помощи реакции гемагглютинации. Если гемагглютинация наступила в контроле (смесь нормальной сыворотки с разведениями вируса) и отсутствует в опыте (смесь иммунной сыворотки с разведениями вируса), то сыворотка обладает нейтрализующим действием, Конечный титр вируса в контроле и в опыте определяют путём статистической обработки.
Постановка реакции нейтрализации (II вариант)
Реакцию ставят с различными разведениями исследуемой сыворотки и постоянной дозой известного живого вируса. Для этого к двукратным возрастающим разведениям сыворотки добавляют равные объёмы определённого разведения вируса (рекомендуется брать 100 или 1000 LD50 вируса). Далее поступают как и в I варианте, то есть выдерживают опытные и контрольные смеси 1-2 часа в термостате, после чего вводят их мышам или куриным эмбрионам.
При постановке реакции нейтрализации на мышах за титр изучаемой сыворотки принимают разведение, дающее защитный эффект у 50% мышей. В реакции на куриных эмбрионах титром сыворотки считается то наибольшее её разведение, которое ещё способно задержать гемагглютинирующее действие вирусов у 50% заражённых куриных эмбрионов.
44. Как осуществляется поддержание вирусных штаммов в лабораторных условиях (пассажи, консервация)?
Пассаж вируса, проведение микроба (resp. вируса) через организм восприимчивого животного с целью усиления вирулентности; метод впервые предложен Пастером. Животное заражается микробом; затем его убивают или оно гибнет, и из его органов выделяют чистую культуру, вновь заражая ею новое животное и повторяя эту процедуру любое число раз. Можно пассировать также органы, заражая животное культурой микроба и вводя новым животным эмульсию органов зараженного. Чистая культура выделяется только после известного числа пассажей.
Метод размножения вирусов в культурах клеток: Культура клеток - это клетки многоклеточного организма, живущие и размножающиеся в искусственных условиях вне организма (in vitro). Методика культивирования клеток особенно успешно стала развиваться после 40-х годов текущего столетия. Этому способствовали следующие обстоятельства: открытие антибиотиков, предотвращающих бактериальное заражение культур клеток, открытие Хуангом (1943) и Эндерсом (1949) способности вирусов вызывать специфическую деструкцию клеток (цитопатический эффект) - удобный метод индикации вирусов в культурах клеток, и, наконец, Дульбекко и Фогт (1952) предложили методику трипсинизации тканей и?получения однослойных культур клеток. В вирусологической практике применяют следующие культуры клеток: первично-трипсинизированные культуры клеток - клетки, полученные непосредственно из органов или тканей организма, растущие in vitro в один слой. Культуру клеток можно получить практически из любого органа или ткани человека или животного (взрослого или эмбриона). Однако лучше это удается сделать из эмбриональных органов, так как клетки эмбрионов обладают более высокой потенцией роста. Чаще всего для этих целей используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы эмбрионов или молодых животных. Для получения первичных клеток от здорового животного не позднее 2-3 ч после убоя берут соответствующие органы или ткани, измельчают их на кусочки (1-4 мм) и обрабатывают ферментами: трипсином, панкреатином, коллагеназой и другими (чаще трипсином). Ферменты разрушают межклеточные вещества, полученные при этом отдельные клетки суспендируют в питательной среде и культивируют на внутренней поверхности пробирок или матрасов в термостате при 37°С. Клетки прикрепляются к стеклу и начинают делиться. В развитии культур клеток различают несколько фаз: адаптации, логарифмического роста, стационарную и старения (гибель клеток). Размножаясь, клетки размещаются на поверхности стекла и при полном покрытии его в один слой контактируют друг с другом и прекращают делиться (контактная ингибиция). На стекле формируется слой толщиной в одну клетку (поэтому эти культуры клеток называют однослойными или монослойными). Монослой сохраняет жизнеспособность в течение 7-21 дней.
Для культивирования вирусов используют молодые культуры клеток (как только сформировался монослой). Субкультуры. В вирусологической практике часто используют субкультуры, которые получают из первичных клеток, выращенных в матрасах, путем снятия их со стекла раствором версена или трипсина, ресуспендирования в новой питательной среде и пересева на новые матрасы или пробирки. Через 2-3 суток формируется монослой. Практически субкультуру можно получить из всех первичных культур клеток. (Хуже субкультивируются куриные фибробласты.) Субкультуры по чувствительности к вирусам не уступают первичным культурам клеток, кроме того, они более экономичны, и есть возможность выявления контаминации клеток вирусами. Субкультуры получают от 2-5 пассажей (перевивок) и очень редко до 8-10. Последующие пассажи приводят к изменению морфологии клеток и их гибели. Если клеточные культуры прошли более 10 пассажей, они уже на стадии перехода к перевиваемым культурам клеток. Перевиваемые культуры клеток - это клетки, способные к размножению вне организма неопределенно длительное время. В лабораториях их поддерживают путем пересевов из одного сосуда в другой (при условии замены питательной среды). Получают перевиваемые клетки из первичных культур клеток с повышенной активностью роста путем длительных пересевов в определенном режиме культивирования. Обычно работа по получению новых клеточных линий продолжается несколько месяцев. Полагают, что механизм происхождения перевиваемых культур клеток - результат генетической изменчивости клеток или селекции единичных клеток, присутствующих в первичной исходной культуре.
Клетки перевиваемых культур имеют одинаковую форму, гетероплоидный набор хромосом (у первичных клеток он диплоидпый), стабильны в условиях роста in vitro, некоторые из них обладают онкогенной активностью. Последнее свойство ограничивает использование перевиваемых культур клеток для культивирования вирусов при производстве вакцин. Перевиваемые культуры клеток можно получать как из здоровых тканей животных, так и из опухолевых. Перевиваемые клетки имеют преимущества перед первичными: их приготовление значительно проще, экономятся труд и материальные средства; эти культуры заранее можно проверить на наличие латентных вирусов и микрофлоры; клональные линии обеспечивают более стандартные условия для размножения вирусов, чем первичные, представляющие смешанную популяцию клеток. Большинство перевиваемых клеток обладает более широким спектром чувствительности к вирусам, чем соответствующие первичные культуры. Поддерживают перевиваемые клетки путем периодических пересевов. Чаще используют бесцентрифужный метод. Для очередного пересева отбирают 2-3-дневную культуру с хорошим монослоем.
Диплоидные культуры клеток. Это морфологически однородная популяция клеток, стабилизированная в процессе культивирования in vitro, имеющая ограниченный срок жизни, характеризующаяся в процессе пассирования кариотипом, свойственным исходной ткани, свободная от контаминантов и не обладающая туморагенной активностью при трансплантации хомячкам. Диплоидные культуры клеток, так же как и перевиваемые, получают из первичных культур клеток. Кариотип клеток очень лабилен и при обычных методах культивирования клеток он изменяется в первые дни. Поэтому потребовались специальные методы обработки ткани, питательные среды высокого качества, фетальная сыворотка для длительного поддерживания клеток in vitro в диплоидном состоянии.
Диплоидные клетки получают из различных тканей эмбриона человека (легкие, почки, кожно-мышечная ткань, сердце и др.) и животных (почки эмбриона крупного рогатого скота, свиней, почки хомяка). Диплоидные клетки в отличие от перевиваемых имеют ограниченные возможности пассирования. Максимальное число пассажей 50 ± 10, затем количество делящихся клеток резко уменьшается и они гибнут. Однако диплоидные клетки могут быть использованы в течение длительного времени, так как при каждом пассаже часть клеток можно заморозить (-196°С) и при необходимости восстановить. Диплоидные клетки имеют преимущества перед перевиваемыми и первичными клетками: 10-12 дней они могут быть в жизнеспособном состоянии без смены питательной среды; при смене среды один раз в неделю остаются жизнеспособными в течение 4 недель; особенно пригодны для длительного культивирования вирусов, у них сохранена чувствительность исходной ткани к вирусам. Суспензионные культуры клеток. В 1953г. Оуэне с сотрудниками показали способность клеток размножаться в свободносуспендированном состоянии. В последующие годы этот метод был значительно усовершенствован: была создана современная аппаратура, обеспечивающая размножение клеток со строго заданными параметрами (температура, рН, скорость перемешивания), а также адаптированы многие линии перевиваемых клеток к размножению в этих условиях. Выращивание вирусов в суспензионных культурах клеток открывает большие возможности в промышленном производстве вакцин и диагностикумов. Однако только перевиваемые клетки хорошо культивируются в суспензии. Новый подход к культивированию клеток в суспензии - применение микроносителей (сефадекс, силикагель, цитолар и др.). На микроносителях культивируемые клетки формируют монослой.
Таким образом, этот способ позволяет методами суспензионного культивирования выращивать зависимые от прикрепления к твердому субстрату клетки: первичные, субкультуры, диплоидные. Эти клетки принято называть поверхностно зависимыми. Способ культивирования на микроносителях в настоящее время чрезвычайно популярен, так как он открывает большие перспективы в клеточной биотехнологии, в получении вакцин и других биологически активных веществ (интерферон, гормоны и т.д.). Хранение культур клеток. Каждый из трех основных типов клеточных культур - первичных культур, диплоидных штаммов и перевиваемых линий клеток, используемых в вирусологических исследованиях, часто приходится консервировать, так как при продолжительном пассировании клеток in vitro есть опасность бактериального загрязнения и неконтролируемых (генетических) изменений самих клеток.
Выделенные изоляты, как и штаммы стандартных вирусов, необходимые для сравнения и серологических исследований, следует хранить в условиях, обеспечивающих им максимально длительную жизнеспособность. При рН среды 7,0-7,4 и внесении в нее определенных добавок вирус можно хранить при 4° в течение нескольких недель, а некоторые виды - в течение года без потери инфекционных свойств.
Многие вещества обладают консервирующим или защитным свойством по отношению к вирусам. Чаще всего используют глицерин, который обладает бактериостатическим действием, но в то же время и защищает вирусы. Его применяют в качестве добавок к вируссодержащему материалу в количестве 10-40%. Довольно широко применяется также фенол, который в концентрации 0,2-0,5% большинство вирусов не инактивирует (например, вирусы чумы свиней, болезни Ауэски, ящура). Для консервирования вирусов можно использовать 5-20%-ный раствор NaCI, 10%-ный раствор глицерина, 0,15 M раствор KCI. Стабильность вирусов значительно увеличивается в результате добавления 1-10% глюкозы, сахарозы или мальтозы, 10-50% сыворотки или сывороточного альбумина, 10-50% обезжиренного молока, 0,1-2,0% желатина. Чем меньше белка в вируссодержащей взвеси, тем меньше его стабильность. Поэтому очищенные вирусы быстро теряют свою биологическую активность.
При хранении вирусов целесообразно также использовать полимеры: 0,5-3%-ную метилцеллюлозу или 0,1-2%-ный поливиниловый спирт. Хорошим стабилизирующим действием на некоторые вирусы обладает 5%-ный ДМСО (диметилсульфоксид), проявляющий при этом и антибактериальные свойства. Вирусы в культуральной жидкости стабилизируются компонентами питательной среды (сыворотка, гидролизат и др.).
Таким образом, большинство вирусов можно сохранять при температуре 4 o С в течение нескольких недель и даже нескольких лет при условии добавления указанных выше компонентов-стабилизаторов. Однако известно, чем ниже температуры замораживания вируса, тем дольше сохраняется его жизнеспособность. При быстром замораживании небольших количества вируса до минус 190°С с последующим хранением при этой температуре практически не снижается титр вируса. Такая температура, однако, очень редко используется в диагностической работе. В лабораториях хорошие результаты дает сохранение вирусов при температуре минус 70°С.
Использование стабилизирующих веществ необходимо не только при хранении вируса, но и для предотвращения потерь его в процессе самого замораживания, особенно вируссодержащих образцов экстраэмбриональной и культуральной жидкости. Если же в культуральной питательной среде содержится 2-19% сыворотки или гидролизата лактальбумина, то ее можно заморозить без добавления стабилизирующих веществ. Хорошее защитное действие при замораживании вирусов и хранении их в таком состоянии оказывает добавление к вируссодержащему материалу одного из таких компонентов, как 10-30% сыворотки крови, инактивированной при 56-60°С; 0,5-1,5% желатина; 20-50% обезжиренного молока; 0,1-0,5%
Читайте также:
- Бобровая струя и гриппа
- Гомеопатия от гриппа и простуды отзывы
- Вредоносные вирусы для компании
- Народные средства для лечения бешенства матки
- Бешенство у кошек автозаводская