Препараты для диагностики вирусных инфекций

Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций подразделяются на несколько больших групп.

- Прямые методы, состоящие в выявлении непосредственно в биологическом материале самого вируса или антител к нему.

- Непрямые методы-заключаются в искусственной наработке вируса в значительных количествах, и его дальнейшем анализе.

К наиболее актуальным в повседневной практике методам диагностики относятся:

Серологические методы диагностики - выявление в сыворотке крови пациента определенных антител или антигенов в результате реакции антиген-антитело(АГ-АТ). То есть, при поиске у пациента определенного антигена используется соответствующее искусственно синтезированное антитело, и, соответственно, наоборот-при выявлении антител используют синтезированные антигены.

Реакция иммунофлуоресценции (РИФ)

Основана на использовании меченых красителями антител. При наличии вирусного антигена он связывается с мечеными антителами, и под микроскопом наблюдается специфическая окраска, которая говорит о положительном результате. При этом методе, к сожалению, невозможна количественная интерпретация результата, а только лишь качественная.

Возможность количественного определения дает иммуноферментный анализ(ИФА). Он похож на РИФ, однако в качестве маркеров используют не красители, а ферменты, превращающие бесцветные субстраты в окрашенные продукты, что и дает возможность количественной оценки содержания как антигенов, так и антител.

- Отмывают не связавшиеся антитела и антигены.

- Добавляют бесцветный субстрат, и в лунках с антигеном, который мы определяем, произойдет окрашивание, т.к. там будет связанный с антигеном фермент, после чего на специальном приборе оценивают интенсивность свечения окрашенного продукта.

По похожей схеме происходит и выявление антител.

Реакция непрямой(пассивной) гемаглютинации (РПГА).

Метод основан на способности вирусов связывать эритроциты. В норме эритроциты падают на дно планшета, образуя так называемую пуговку. Однако если в исследуемом биологическом материале находится вирус, он свяжет эритроциты в так называемый зонтик, который не упадет на дно лунки.

Теперь остановимся на методах диагностики непосредственно нуклеиновых кислот исследуемых вирусов, и прежде всего о ПЦР ( Полимеразная Цепная Реакция) .

Суть этого метода заключается в обнаружении специфического фрагмента ДНК или РНК вируса путём его многократного копирования в искусственных условиях. ПЦР можно проводить только с ДНК, то есть для РНК-вирусов предварительно необходимо произвести реакцию обратной транскрипции.

Непосредственно ПЦР проводят в специальном приборе, под названием амплификатор, или термоциклер, который поддерживает необходимый температурный режим. ПЦР-смесь состоит из добавленной ДНК, которая содержит интересующий нас фрагмент, праймеров (короткий фрагмент нуклеиновой кислоты, комплиментарный ДНК-мишени, служит затравкой для синтеза комплиментарной цепи), ДНК-полимеразы и нуклеотидов.

Стадии цикла ПЦР:

- Деннатурация-первая стадия. Температура повышается до 95 градусов, цепочки ДНК расходятся друг относительно друга.

- Отжиг праймеров. Температуру понижают до 50-60 градусов. Праймеры находят комплиментарный участок цепи и связываются с ним.

- Синтез. Температуру вновь повышают до 72, это рабочая температура для ДНК-полимеразы, которая, отталкиваясь от праймеров, строит дочерние цепи.

Цикл многократно повторяется. Через 40 циклов из одной молекулы ДНК получается 10*12 степени копий копий искомого фрагмента.

При проведении ПЦР в режиме реального времени синтезируемые копии фрагмента ДНК метятся красителем. Прибор регистрирует интенсивность свечения и по ходу реакции строит графики накопления искомого фрагмента.

Современные методы лабораторной диагностики с высокой достоверностью позволяют выявить присутствие вируса - возбудителя в организме, нередко, задолго до появления первых симптомов заболевания.

Инфекционные болезни — это заболевания, вызванные проникновением в организм бактерий, грибков или вирусов. Самая важная часть диагностики инфекций — это определение возбудителя и его концентрации. Для этих целей используются разнообразные лабораторные методы, которые позволяют выяснить, чем именно и как давно атакован организм, а в некоторых случаях — спрогнозировать эффективность лечения тем или иным препаратом.

Особенности диагностики инфекционных заболеваний

В клинической практике данный тип заболеваний встречается очень часто. Именно они, по данным Всемирной организации здравоохранения, становятся причиной 26% всех смертей. В список самых распространенных инфекционных заболеваний входят инфекционная пневмония и другие воспалительные заболевания дыхательных путей, гепатит, ВИЧ, туберкулез, малярия, воспаления органов половой системы и мочевыводящих путей, гистоплазмоз, ротавирусные инфекционные заболевания, ветряная оспа, герпес, вирус папилломы человека и еще несколько десятков болезней. Хотя бы раз в жизни каждый из нас сталкивается с инфекционными заболеваниями и необходимостью быстрой постановки диагноза.

Все инфекционные болезни делятся на пять типов — прионные, вирусные, бактериальные, протозойные и грибковые поражения. Далее будут рассмотрены последние четыре типа как наиболее распространенные. Разные возбудители иногда могут вызывать одно и то же заболевание. В частности, пневмония может быть результатом как вирусной, так и бактериальной инфекции. Лечение зависит не от проявлений, а от возбудителя болезни. Противовирусные препараты бесполезны в борьбе с бактериями и грибками, антибиотики не действуют на вирусы. Поэтому основная задача лабораторной диагностики инфекционных заболеваний — выявление типа возбудителя.

Способы лабораторной диагностики инфекционных болезней можно разделить на два типа: неспецифические и специфические методы.

К неспецифическим относятся общий анализ крови и исследование соотношения ее белковых фракций, печеночные пробы, общий анализ мочи и кала. Эти методы не дают информации о виде возбудителя, но позволяют узнать, в какой мере болезнь затронула органы и системы организма, что именно в их работе нарушено и насколько далеко зашел процесс.

Специфические — вирусологический и бактериологический методы, микроскопическое исследование возбудителей, анализы на антигены и антитела — направлены непосредственно на обнаружение возбудителя.

Современная медицина располагает множеством методов выделения возбудителей бактериальной инфекции:

Бактериоскопический . Исследуется окрашенный специальным образом мазок.

Бактериологический . Биоматериал высеивается в питательную среду, и через некоторое время специалист исследует колонию бактерий, выросшую в ней.

Биологический . Направлен на определение патогенности микроорганизмов.

Серологический . Выявляет антитела и антигены в сыворотке крови — особые вещества, которые вырабатываются организмом при контакте с возбудителем определенной болезни.

Чаще всего для исследований используют кровь или сыворотку крови, реже — слюну, мочу, кал, клетки эпителия (мазок и соскоб) и другой биоматериал.

В лабораторной диагностике вирусных заболеваний используются:

Вирусологическое исследование . Световая и электронная микроскопия дает возможность выявить наличие вирусных включений и сами вирусы и идентифицировать их.

Серологическое исследование для обнаружения антител и антигенов. Этот метод дает возможность быстро выявить агрессора, как и в случае с бактериальными инфекциями. Для диагностики используются разнообразные способы исследования материала — реакции гемадсорбции, гемагглютинации или метод непрямой иммунофлюоресценции. Имунноблоттинг, в частности, позволяет выявлять антитела сразу к нескольким инфекциям и считается современным и точным диагностическим методом.

Молекулярно-генетические методы . Последнее слово в лабораторной диагностике. Позволяют обнаружить вирус даже тогда, когда его концентрация ничтожно мала — то есть на самых ранних стадиях. Самым известным из этих методов является ПЦР, при которой фрагмент вируса многократно копируется до тех пор, пока специалист не получит достаточно материала для определения типа вируса и его изначальной концентрации.

Для выявления вирусов обычно требуется сделать анализ крови.

Так называют инфекции, вызванные простейшими паразитами, например, амебами. Малярия, амёбиаз, токсоплазмоз, лямблиоз, трихомониаз, сонная болезнь — вот неполный список самых распространенных протозойных инфекций. Лабораторная диагностика таких заболеваний включает в себя следующие методы:

Микроскопический . Простейшие паразиты выявляются путем исследования под микроскопом окрашенных образцов биоматериала. Самый простой и надежный метод для многих возбудителей.

Культуральный . Посев биоматериала в питательную следу для дальнейшего исследования размножившихся простейших. У этого метода есть существенный недостаток: результатов нужно ждать долго, сам процесс может занять не менее 5-6-ти дней.

Серологический . Используют редко ввиду малой информативности.

Аллергический . Также не является распространенным. Кожные аллергопробы делают для того, чтобы подтвердить лейшманиоз и токсоплазмоз. Это вспомогательный диагностический метод.

В качестве биоматериала для исследований в основном используется кровь, иногда — – кал или моча.

Микроскопическое исследование . Препарат окрашивается и рассматривается под мощным микроскопом. Посредством иммунофлюоресцентной микроскопии исследуется проба, помеченная флюоресцеинами — специальным красителем. Наиболее быстрый способ выявления грибка по сравнению с другими методами.

Культуральный . Происходит посев пробы на питательную среду и дальнейшее исследование полученной в результате колонии грибков.

Серологический . Используется для выявления грибковых поражений, однако для микозов он считается не особенно точным.

Гибридизация нуклеиновых кислот . Самый современный способ выявления грибковых инфекций, его применяют для идентификации основных возбудителей системных микозов. Из культуры извлекается РНК и вносится особым способом помеченная молекула ДНК. Если в пробе наличествует один из основных патогенных грибков, ДНК объединится с его РНК, создав легко различимую структуру. Несомненным преимуществом метода является возможность определить инфекцию на самых ранних стадиях.

Биоматериалом для исследований являются клетки кожи, волос и ногтей, клетки слизистых оболочек (мазок или соскоб), мокрота, моча, секрет простаты, сперма, грудное молоко.

Современные методики диагностики инфекций позволяет выявить их на начальном этапе, Чем раньше болезнь будет обнаружена, тем проще ее вылечить. Поэтому сдавать анализы на инфекции желательно регулярно, даже если вы ни на что не жалуетесь и не замечаете никаких перемен в самочувствии.

Пе­ред сда­чей био­ма­те­ри­а­ла для ис­сле­до­ва­ний иног­да тре­бу­ет­ся опре­де­лен­ная под­го­тов­ка. Так, кровь обыч­но сда­ют с ут­ра, на­то­щак, а пе­ред за­бо­ром маз­ка не ре­ко­мен­ду­ет­ся при­ни­мать душ. Эти тре­бо­ва­ния очень важ­ны: они обес­пе­чи­ва­ют точ­ность ре­зуль­та­та, по­это­му узнай­те у вра­ча за­ра­нее о под­го­то­ви­тель­ных ме­рах и точ­но сле­дуй­те всем его ре­ко­мен­да­ци­ям.

Острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) и грипп провоцируют 70% инфекционных простудных заболеваний. Практически каждый человек ежегодно испытывает на себе последствия заражения вирусом. Такие высокие статистические показатели обусловлены большим разнообразием патогенных организмов, которые постоянно видоизменяются, и легкостью способов заражения.

Несмотря на большое количество средств против ОРВИ, лечение затрудняет схожесть симптомов заболеваний, вызванных разными вирусами. Некоторые препараты при гриппе чувствительны лишь к определенному штамму микроорганизма и не будут столь же эффективны в борьбе с инфекциями, вызванными другими возбудителями. Поэтому лучше использовать противовирусные средства для профилактики ОРВИ, а если произошло заражение, как можно скорее начать лечение.

Лечение гриппа и ОРВИ: препараты и их действие

Существует несколько классификаций, систематизирующих все многообразие лекарств против вирусных заболеваний. Препараты различаются по химическому составу в зависимости от действующих веществ и их производных:

• интерферон и его индукторы;
• нуклеозиды;
• липиды;
• тиосемикарбазон;
• ладолкарболовая кислота;
• адамантан;
• растительные компоненты.

В зависимости от типа вируса, к которому чувствителен препарат, выделяют две группы лекарств:

• средства, направленные на борьбу с ДНК-вирусами: герпесом, ветряной и натуральной оспой, цитомегаловирусом, гепатитом В и С, опоясывающим лишаем;
• средства, направленные на борьбу с РНК-вирусами: иммунодефицитом, гриппом А и Б, респираторным синцитиальным вирусом.

Есть и другие типы препаратов, не попадающие под данные классификации: гомеопатические, иммуностимулирующие, вакцины и средства, действующие по принципу антибактериальных аналогов.

Противовирусные препараты при ОРВИ считаются лучшим вариантом лечения, так как они устраняют саму причину заболевания. В результате человек выздоравливает на 2–3 дня раньше, чем без применения данной категории лекарств. Сама простуда проходит легче, без осложнений и обострений других хронических воспалений. Чем раньше начать прием лекарства, тем меньше клеток сможет поразить вирус. А это значит, что он не распространится по организму и симптомы простуды будут не такими тяжелыми.

Конечно, организм и сам способен защитить себя от инфекции при помощи антител и интерферонов. Но некоторые виды вирусов могут угнетать их действие, и тогда без специальных противовирусных средств не обойтись. Но и их периодически необходимо менять, так как вирусы мутируют и приобретают устойчивость к действующему веществу лекарственного препарата.

Препараты от гриппа и ОРВИ химического происхождения

Все лекарственные средства этой группы состоят из веществ, полученных путем химического синтеза. Их действие препятствует размножению вируса на определенном этапе его жизненного цикла. При этом нормальная работа клеток человека не прерывается.

Противогриппозные препараты

Прежде чем выбрать лекарство, необходимо удостовериться, что заболевание вызвано действительно вирусом гриппа, и определить его тип. Противовирусные препараты при гриппе разделяются на две группы в зависимости от способа действия и штамма вируса, который они поражают.

К первой группе относятся блокаторы М2-каналов. Эти препараты чувствительны к вирусу гриппа А. Они блокируют ионные каналы М2 в организме вируса, тем самым препятствуя ему внедряться в человеческие клетки и размножаться в них. Действующим веществом препаратов этой группы является синтезированный амин – амантадин и его производные (римантадин, дейтифорин, мидантан).

Наиболее популярным средством считается римантадин. Формы римантадина от гриппа и ОРВИ: таблетки для взрослых ремантадин и сироп для детей альгирем. В лечебных целях их применяют согласно инструкции и рекомендациям врача, но не более 5 дней, в профилактических – в течение двух недель. Прием необходимо начать в первый же день появления симптомов заболевания. Причем здоровые члены семьи также должны употреблять препарат, чтобы не заразиться. Эффективность римантадина против вируса гриппа А составляет не менее 70%. Отмечено также облегчение симптомов заболевания, вызванного вирусом гриппа В.

Лекарства при гриппе второй группы – это ингибиторы нейроаминидазы. Их действие распространяется на штаммы А и В. Ингибирование фермента нейроаминидазы позволяет достичь нескольких положительных результатов:

• не допустить проникновения вируса в клетку человека;
• снизить распространение вируса по организму;
• не допустить развития воспаления в очаге вирусной инфекции;
• ослабить симптомы заболевания – лихорадку, снижение аппетита, ломоту в теле.

Лекарственные средства этой группы эффективны в профилактических мерах на 70%. Заболевшему человеку важно принять препарат в первые двое суток после начала болезни, и чем раньше, тем лучше. Тогда он выздоровеет на 1–3 дня быстрее. В 85% случаев приема данных препаратов болезнь проходит в легкой форме.

К ингибиторам нейроаминидазы относят два типа веществ:

• озельтамивир – препарат тамифлю в виде капсул и порошка для приготовления суспензии;
• занамивир – препарат реленза для проведения ингаляций.

Препараты широкого спектра действия

Эти средства используют в случаях, когда точно неизвестно, вызвано заболевание гриппом или другим вирусом. Наиболее популярные лекарства от гриппа и ОРВИ этой категории:

1. Рибавирин. Применяют для лечения заболеваний, вызванных респираторно-синцитиальным вирусом. При гриппе он также будет эффективен. С помощью данного препарата делают ингаляции, но только в условиях стационара, так как он может вызывать серьезные побочные эффекты.
2. Пленоконарил. Действует против риновирусов и энтеровирусов, вызывающих ОРВИ и менингит.
3. Арбидол. Подходит для лечения как гриппа, так и ОРВИ. Обладает иммуностимулирующим действием.

Препараты, повышающие содержание интерферона

Средства этой категории содержат либо синтетический интерферон, аналогичный по действию натуральному, либо вещества, способные повышать выработку интерферона организмом. Они противостоят любым вирусам, сокращая длительность заболевания и существенно облегчая его симптомы. Существуют некоторые особенности применения данных препаратов:

• прием интерферона важно начать как можно раньше;
• если заболевание вызвано бактериальной активностью, данные препараты неэффективны. В данном случае необходим прием антибиотиков;
• при тяжелой форме гриппа нельзя заменять специальные противовирусные препараты (тамифлю, римантадин, реленза) интерфероном. Его можно использовать в составе комплексной терапии.

Интерфероны

Интерфероны представляют собой специальные белки организма, которые обеспечивают иммунный ответ на вирусную атаку. Их универсальность обусловлена способом действия: интерфероны препятствуют размножению вируса на начальной, обязательной для всех штаммов, стадии. Поскольку данные вещества вырабатываются организмом, то и лекарственные средства, содержащие их, практически не имеют противопоказаний, кроме гиперчувствительности к чужеродному белку. Эффект после приема препарата проявляется уже спустя 1–3 дня. Лекарство можно использовать как в острой, так и в скрытой фазе заболевания.

Для лечения используют α- и β-интерфероны. Они продаются в виде порошка для инъекций или приготовления назальных растворов и ингаляций. Наиболее популярные средства: интерферон, циклоферон, лаферон. Для детей выпускаются свечи виферон и кипферон, а также назальные капли гриппферон. Их можно применять даже для малышей до года. Кипферон действует быстрее, чем виферон, но имеет больше побочных эффектов.

Индукторы интерферона

Эти препараты созданы на основе натуральных и синтетических компонентов, которые способствуют выработке естественного интерферона различными органами человеческого тела. Проникая в клетки организма, они программируют их на образование ранних α- и β-интерферонов и активизируют работу иммунитета. Но на запуск этого процесса необходимо некоторое время, поэтому данные препараты следует принимать сразу же после возникновения первых симптомов заболевания или для профилактики в период эпидемии.

Наиболее популярными препаратами индукторов интерферона являются:

• раствор для инъекций и назальные капли деринат;
• таблетки амиксин;
• растворы для инъекций и таблетки циклоферон (меглюмина акридонацетат);
• растворы для инъекций ридостин;
• таблетки диабазол.

Гомеопатические препараты

Лекарственные средства от ОРВИ и гриппа этой категории следует принимать при первых симптомах недомогания. Особенно часто их назначают детям и часто болеющим взрослым. О принципе работы гомеопатических препаратов до сих пор нет единого мнения, и многие представители официальной медицины их не признают. Основное их действие направлено на помощь организму в мобилизации собственных сил для борьбы с вирусом.

Следует учесть, что положительная динамика заболевания наблюдается не у всех пациентов, употребляющих гомеопатические препараты. Их действие является индивидуальным. Поэтому если в первые два дня после начала болезни и приема лекарства нет улучшения, не имеет смысла продолжать пить этот препарат. Наиболее известные представители этой группы противовирусных средств: вибуркол, афлубин, грипп-хеель, оциллококцинум.

Растительные препараты

При гриппе, простудных заболеваниях, герпесе и цитомегаловирусной инфекции можно использовать препараты на основе растительных компонентов. Они обладают противовирусным, иммуномодулирующим и противовоспалительным действием. Многие из них рекомендуются в профилактических целях. Представителями этой категории являются: флакозид (экстракт бархата амурского и Лаваля), ализарин (экстракт копеечника альпийского и желтеющего, листьев манго), мази мегозин и госсипол (хлопок и хлопчатник), мазь хелепин (из побегов леспедецы копеечниковой), альтабор (плоды ольхи черной и серой), протефлазид (экстракт луговика дернистого и вейника низкого), имупрет (орех грецкий, хвощ полевой, кора дуба).

Иммуномодулирующие препараты

В период эпидемии простудных заболеваний, чтобы повысить сопротивляемость организма вирусам, целесообразным является прием средств для укрепления иммунитета. Они используются только в целях профилактики, поскольку их эффект проявляется спустя 2–3 недели регулярного употребления.

Некоторые из препаратов этой группы назначает только врач-иммунолог в случае серьезных нарушений работы защитных сил организма. Но ряд средств может прописать и терапевт. К наиболее широко используемым иммуностимулирующим препаратам относятся: имудон, изопренозин, ИРС-19, иммунал, метилурацил, рибомунил, бронхомунал.

Выбирая чем лечить грипп и ОРВИ, необходимо обращаться за помощью к врачу, поскольку спектр препаратов данной категории очень обширный, и многие из них специфичны по отношению к определенному типу вируса. Но все они наиболее эффективны в первые часы и дни болезни. Поэтому не стоит затягивать с визитом в больницу.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ

Студент должен знать:

-морфологию, экологию, физиологию вирусов, методы их изучения;

-основы эпидемиологии вирусных инфекций (типы инфекций);

-основы химиотерапии и химиопрофилактики вирусной инфекции;

-факторы иммунитета при вирусных инфекциях.

Студент должен уметь:

-проводить профилактику вирусных инфекций;

-составлять алгоритмы действия в условиях эпидемии.

Вопросы для фронтального обсуждения:

1.Дайте понятие вирусам. Охарактеризуйте особенности строения и жизни вирусной частицы.

2.Какими факторами осуществляется защита организма человека от вируса.

3.Назовите группу и механизм действия препаратов на вирусы. Приведите примеры препаратов.

4.Назовите типы инфекции, вызываемые вирусами.

5. Назовите представителей кишечных, кровяных, респираторных вирусных инфекций, инфекций кожных покровов и слизистых.

7.Назовите, как называются мероприятия, ликвидирующие эпидемический процесс.

Самостоятельная работа студентов:

Запишите определения методов исследования вирусных инфекций.

Зарисйте в атлас внутриклеточные включения при натуральной оспе (тельца Гварниери), при бешенстве (тельца Бабеша-Негри).

3.Составьте план противоэпидемических мероприятий на вирусную инфекцию (инфекцию определяет преподаватель).

Краткие теоретические положения

Введение

Расширение возможностей в лечении и профилактике вирусных болезней с использованием противовирусных препаратов, иммуномодуляторов и вакцин с различным механизмом действия нуждается в быстрой и точной лабораторной диагностике. Узкая специфичность некоторых противовирусных препаратов также требует быстрой и высокоспецифичной диагностики инфицирующего агента. Появилась необходимость в количественных методах определения вирусов для мониторинга противовирусной терапии. Помимо установления этиологии заболевания лабораторная диагностика имеет важное значение в организации противоэпидемических мероприятий.

Ранняя диагностика первых случаев эпидемических инфекций позволяет своевременно провести противоэпидемические мероприятия – карантин, госпитализацию, вакцинацию и пр. Реализация программ по ликвидации инфекционных заболеваний, например натуральной оспы, показала, что по мере их выполнения возрастает роль лабораторной диагностики. Существенную роль играет лабораторная диагностика в службе крови и акушерской практике, например, выявление доноров, инфицированных вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), вирусом гепатита В (HBV), диагностика краснухи и цитомегаловирусной инфекции у беременных.

Методы диагностики вирусных инфекций

Для успешного выделения вирусов клинический материал должен быть взят в соответствии с патогенезом предполагаемого заболевания и в наиболее ранние сроки.

Как правило, берутся:

– при респираторных инфекциях – носоглоточный смыв;

– при энтеровирусных инфекциях – смыв и фекалии (рео-, энтеровирусы);

– при поражениях кожи и слизистых оболочек – соскобы, содержимое пузырьков (герпес, ветряная оспа);

– при экзантемных инфекциях – смывы (корь, краснуха);

– при арбовирусных инфекциях – кровь, спинномозговая жидкость.

1.Быстрые (экспресс-методы) — прямое обнаружение вируса или его компонентов (антигенов, НК), включений непосредственно в клиническом материале.

А. Вирусоскопический метод заключается в об­наружении вируса в исследуемом материале под микроскопом. Чаще всего используют электронный микроскоп. Световая микроскопия из-за нич­тожно малых размеров вирусов практически не применяется. При данном методе можно определить тип НК, размеры вириона, форму вириона, а также выявить внутрик­леточные включения, которые образуются в пораженных клетках при некоторых инфек­циях.

II. Вирусологический метод основан на:

культивировании вирусов в чувствительных биологических системах (клеточных культурах, курином эмбрионе, организмах лабораторных животных),их индикации по цитопатогенному действию на биологическую систему (рис.1), идентификации по ингибиции действия вирусов соответствующими противовирусными антителами (рис.2).

Рис. 1. Цитопатическое действие вирусов на клетку: А-нормальный рост, Б-ЦПД вирусов на клетку

Рис.2 Ингибиция вируса антителами

Вирусологическое исследование - это "золотой стандарт" вирусологии и должно проводится в специализированной вирусологической лаборатории. В настоящее время оно используется практически только в условиях возникновения эпидемической вспышки того или иного вирусного инфекционного заболевания.

III. Серологический метод — определение противовирусных антител (оптимально — IgM) и/или определение динамики нарастания их титров за определенный период заболевания в парных сыворотках. Диагностически значимым считают нарастание титра антител в 4 и более раз.

Метод парных сывороток:осуществляем сбор венозной крови в количестве 10 мл в начале болезни и в конце, приготавливаем сыворотку, определяем количество антител в первой и второй сыворотке.

При этом четырехкратное нарастание титра антител во второй сыворотке в большинстве случаев служит показателем протекающей или свежеперенесенной инфекции. При исследовании одной сыворотки, взятой в острой стадии болезни, диагностическое значение имеет обнаружение антител класса Ig М, свидетельствующее об острой инфекции.

Современные методы диагностики:

1.ПЦР-выявляют персистирующие вирусы по НК, находящиеся в клиническом материале, с трудом обнаруживаемые или не обнаруживаемые другими методами.

2.Радиоизотопный иммунный анализ (РИА)-метод основан на метке антител радиоизотопами, что обеспечивало высокую чувствительность в определении вирусного антигена. Широкое распространение метод получил в 80-е годы, особенно для определения маркеров HBV и других некультивируемых вирусов. К недостаткам метода относится необходимость работать с радиоактивными веществами и использования дорогостоящего оборудования (гамма-счетчиков).

3.Иммуноферментный анализ (ИФА) – Иммуноферментные методы определения вирусных антигенов в принципе сходны с РИФ, но основываются на мечении антител ферментами, а не красителями. Наиболее широко используется пероксидаза хрена и щелочная фосфатаза, применяют также b-галактозидазу и b-лактамазы. Меченые антитела связываются с антигеном, и такой комплекс обнаруживается при добавлении субстрата для фермента, с которым конъюгированы антитела. Конечный продукт реакции может быть в виде нерастворимого осадка, и тогда учет проводится с помощью обычного светового микроскопа, или в виде растворимого продукта, который обычно окрашен (или может флюоресцировать или люминесцировать) и регистрируется инструментально.

Поскольку с помощью ИФА можно измерять растворимые антигены, то не требуется наличия интактных клеток в образце и таким образом могут использоваться различные виды клинического материала.

Другое важное преимущество метода ИФА – возможность количественного определения антигенов, что позволяет применять его для оценки клинического течения болезни и эффективности химиотерапии. ИФА, как и РИФ, может применяться как в прямом, так и в непрямом варианте.

Твердофазный ИФА, дающий растворимый окрашеный продукт реакции, нашел наибольшее распространение. ИФА может быть использован как для определения антигена (тогда на твердую фазу – дно лунки полистиролового планшета – наносятся антитела), так и для определения антител (тогда на твердую фазу наносятся антигены).

4.Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) – Метод основан на использовании антител, связанных с красителем, например флюоресцеинизотиоцианатом. РИФ широко применяется для выявления вирусных антигенов в материале больных и для быстрой диагностики.

В практике применяются два варианта РИФ: прямой и непрямой. В первом случае применяются меченные красителем антитела к вирусам, которые наносятся на инфицированные клетки (мазок, культура клеток). Таким образом, реакция протекает одноэтапно. Неудобством метода является необходимость иметь большой набор конъюгированных специфических сывороток ко многим вирусам.

При непрямом варианте РИФ на исследуемый материал наносится специфическая сыворотка, антитела которой связываются с вирусным антигеном, находящимся в материале, а затем наслаивается антивидовая сыворотка к гамма-глобулинам животного, в котором готовилась специфическая иммунная сыворотка, например антикроличья, антилошадиная и т. п. Преимущество непрямого варианта РИФ состоит в потребности лишь одного вида меченых антител.

Метод РИФ широко применяется для быстрой расшифровки этиологии острых респираторных вирусных инфекций при анализе мазков-отпечатков со слизистой оболочки верхних дыхательных путей. Успешное применение РИФ для прямой детекции вируса в клиническом материале возможно лишь в случае содержания в нем достаточно большого числа инфицированных клеток и незначительной контаминации микроорганизмами, которые могут давать неспецифическое свечение.

5.Другие методы диагностики –

РТГА используется для диагностики заболеваний, вызванных гемагглютинирующими вирусами. Она основана на связывании антителами сыворотки больного добавленного стандартного вируса. Индикатором реакции являются эритроциты, агглютинирующиеся вирусом (формирование характерного "зонтика") при отсутствии специфических антител и оседающие на дно неагглютинированными при их наличии.

РСК является одной из традиционных серологических реакций и используется для диагностики многих вирусных инфекций. В реакции принимают участие две системы: антитела сыворотки больного + стандартный вирус и эритроциты барана + антитела к ним, а также оттитрованный комплемент. При соответствии антител и вируса этот комплекс связывает комплемент и лизиса бараньих эритроцитов не происходит (положительная реакция). При отрицательной РСК комплемент способствует лизису эритроцитов. Недостатком метода является его недостаточно высокая чувствительность и трудность стандартизации реагентов.

Для учета значимости РСК также, как и РТГА, необходимо титрование парных сывороток, то есть взятых в начале заболевания и в период реконвалесценции.

РПГА – агглютинация сенсибилизированных вирусными антигенами эритроцитов (или полистироловых шариков) в присутствии антител. На эритроцитах могут быть сорбированы любые вирусы, независимо от наличия или отсутствия у них гемагглютинирующей активности. В связи с наличием неспецифических реакций сыворотки исследуются в разведении 1:10 и более.

РНГА – агглютинация эритроцитов, сенсибилизированных специфическими антителами в присутствии вирусных антигенов. Наибольшее распространение РОПГА получила при выявлении HBs-антигена как у больных, так и у доноров крови.