Продуцент вакцины против гепатита в

Действующее вещество

Вакцина гепатита В рекомбинантная дрожжевая
Инструкция по медицинскому применению - РУ № Р N000738/01

Дата последнего изменения: 15.06.2017

Суспензия для внутримышечного введения.

Препарат содержит в 1 мл: 20 мкг антигена вируса гепатита В поверхностного рекомбинантного (HBsAg), 0,5 мг алюминия гидроксида ( Al 3+ ) и не содержит консервант – мертиолят или содержит 50 мкг мертиолята.

Гомогенная суспензия белого с сероватым оттенком цвета, без видимых посторонних включений, разделяющаяся при стоянии на бесцветную прозрачную жидкость и рыхлый осадок белого с сероватым оттенком цвета, легко разбивающийся при встряхивании.

Вакцина гепатита В рекомбинантная дрожжевая представляет собой сорбированный на алюминия гидроксиде белок (HBsAg), синтезированный рекомбинантным штаммом дрожжей Saccharomyces cerevisiae и/или Hansenula polymorpha и содержащий антигенные детерминанты поверхностного антигена вируса гепатита В (серотип ау и/или ad).

Проведение курса вакцинации приводит к образованию специфических антител к вирусу гепатита В в защитном титре более чем у 90 % вакцинированных.

Профилактика гепатита В у детей в рамках национального календаря профилактических прививок и лиц из групп повышенного риска инфицирования вирусом гепатита В (дети и взрослые, в семьях которых есть носитель HBsAg или больной хроническим гепатитом В; дети домов ребенка, детских домов и интернатов; дети и взрослые регулярно получающие кровь и ее препараты, а также находящиеся на гемодиализе и онкогематологические больные; лица, у которых произошел контакт с материалом, инфицированным вирусом гепатита В; медицинские работники, имеющие контакт с кровью; лица, занятые в производстве иммунобиологических препаратов из донорской и плацентарной крови; студенты медицинских институтов и учащиеся средних медицинских учебных заведений (в первую очередь выпускники); лица, употребляющие наркотики инъекционным путем).

Помимо вышеперечисленных категорий прививки следует проводить всем другим группам населения.

Повышенная чувствительность к дрожжам и другим компонентам вакцины.

Сильная реакция (температура выше 40 °С, отек, гиперемия >8 см в диаметре в месте введения) или осложнение (обострения хронических заболеваний) на предшествовавшее введение препарата. Плановая вакцинация откладывается до окончания острых проявлений заболевания или обострения хронических заболеваний. При нетяжелых ОРВИ, острых кишечных и других заболеваниях прививки можно проводить после нормализации температуры.

Беременность. Влияние вакцины на плод не изучено. Возможность вакцинации беременной женщины может быть рассмотрена при крайне высоком риске инфицирования.

Рекомендуется вводить вакцину внутримышечно в дельтовидную область или в передненаружную поверхность средней части бедра (новорожденным и детям до 18 мес). Введение в другое место нежелательно из-за снижения эффективности вакцинации. Не вводить внутривенно.

Детей первого года жизни, а также имеющих в анамнезе различные соматические заболевания, вакцинируют вакциной, не содержащей консервант (мертиолят).

Разовая доза составляет:

• для лиц старше 18 лет - 1 мл (20 мкг HBsAg);
• для детей и подростков до 18 лет включительно - 0,5 мл (10 мкг HBsAg);
• для пациентов отделения гемодиализа - 2 мл (40 мкг HBsAg).

Вакцина в ампулах, содержащих 1 мл препарата (взрослая доза), может быть использована для вакцинации 2-х детей (по 0,5 мл) при условии их одновременной вакцинации.

Перед употреблением вакцину встряхивают.

Для инъекции используют только одноразовый шприц.

Вскрытие ампул и процедуру вакцинации проводят при строгом соблюдении правил асептики и антисептики.

Место введения до и после инъекции обрабатывают 70 % спиртом.

Препарат во вскрытой ампуле хранению не подлежит.

Вакцинация в рамках национального календаря профилактических прививокпроводится по утвержденным в календаре схемам.

Вакцинация против вирусного гепатита В проводится всем новорожденным в первые 24 часа жизни ребенка.

Новорожденных из групп риска вакцинируют по схеме 0-1-2-12 (первая доза - в первые 24 часа жизни, вторая доза - в возрасте 1 месяца, третья доза - в возрасте 2 месяцев, четвертая доза - в возрасте 12 месяцев). Одновременно с первой прививкой рекомендуется ввести внутримышечно в другое бедро иммуноглобулин человека против гепатита В в дозе 100 ME. По такой же схеме вакцинируют детей, относящихся к группе риска, не привитых в родильном доме по медицинским противопоказаниям после снятия последних.

Новорожденных и всех детей первого года жизни, не относящихся к группам риска, вакцинируют по схеме 0-1-6 (1 доза - в момент начала вакцинации, 2 доза - через 1 месяц после 1 прививки, 3 доза - через 6 месяцев от начала иммунизации).

Детей, не получивших прививки в возрасте до 1 года и не относящихся к группам риска, а также подростков и взрослых, не привитых ранее, вакцинируют по схеме: 0-1-6 (1 доза - в момент начала вакцинации, 2 доза - через 1 месяц после 1 прививки, 3 доза - через 6 месяцев от начала иммунизации).

Примечание: В случае удлинения интервала между первой и второй прививками до 5 мес. и более, третью прививку проводят через 1 мес. после второй.

Прививки лиц, у которых произошел контакт с материалом, инфицированным вирусом гепатита В, проводят по схеме: 0-1-2 мес. Одновременно с первой прививкой рекомендуется ввести внутримышечно (в другое место) иммуноглобулин человека против гепатита В в дозе 100 ME (детям до 10 лет) или 6-8 МЕ/кг (остальные возраста). У данных лиц, получивших ранее полный курс вакцинации против гепатита В, перед проведением второй прививки определяют содержание антител к HBsAg, если титры антител составляют не менее 100 МЕ/л, вторую и третью вакцинацию не проводят.

Лица из группы риска, в силу профессиональных обязанностей имеющие постоянный контакт с кровью, должны ежегодно проходить обследование на содержание антител к HBsAg.

В случае снижения титра антител ниже 100 МЕ/л рекомендуется ревакцинация одной дозой вакцины.

Не привитым пациентам, которым планируются хирургические вмешательства, рекомендуется экстренная схема вакцинации 0-7-21 день.

Пациентам отделения гемодиализа вакцину вводят четырехкратно по схеме 0-1-2-6 мес.

О всех случаях повышенной реактогенности или развития поствакцинальных осложнений следует сообщать по телефону (факсу) или телеграфу в Минздравсоцразвития России и в адрес производителя.

Побочные явления при применении вакцины редки. В 1,8-3,0% случаев возможны незначительная преходящая боль, эритема и уплотнение в месте инъекции, а также незначительное повышение температуры, жалобы на недомогание, усталость, боль в суставах, боль в мышцах, головную боль, головокружение, тошноту.

Указанные реакции развиваются, в основном, после первых двух инъекций и проходят через 2-3 дня.

Учитывая возможность крайне редкого развития аллергических реакций немедленного типа у особо чувствительных лиц, за привитыми необходимо обеспечить медицинское наблюдение в течение 30 мин.

Места проведения прививок должны быть обеспечены средствами противошоковой терапии.

Плановые прививки против гепатита В можно проводить одновременно (в один день) с другими вакцинами национального календаря прививок (за исключением вакцины БЦЖ), а также инактивированными вакцинами календаря профилактических прививок по эпидемическим показаниям. Вакцина гепатита В может вводиться с противоаллергическими препаратами. Взаимодействие с другими лекарственными средствами не установлено.

По 1 мл (взрослая доза; 1 взрослая доза или 2 детские дозы) или по 0,5 мл (детская доза) в ампулах. По 10 ампул в контурной ячейковой упаковке в пачке картонной с инструкцией по применению.

Условия хранения и транспортирования

Препарат хранят и транспортируют по СП 3.3.2.1248-03 при температуре от 2 до 8 °С. Замораживание не допускается. Препарат хранят в недоступном для детей месте.

Допускается кратковременное (не более 72 часов) транспортирование при температуре не выше 30°С.

Срок годности - 4 года. Препарат с истекшим сроком годности применению не подлежит.

Для лечебно-профилактических и санитарно-профилактических учреждений.

О всех случаях повышенной реактогенности или развития поствакцинальных осложнений следует сообщать по телефону (факсу) или телеграфу в Федеральную службу по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России и в ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора с последующим направлением медицинской документации (119002, Москва, пер. Сивцев Вражек, 41, тел. (8499) 2413922, факс (8499) 2419238) и в адрес предприятия-изготовителя.

Вакцина от гепатита В – единственный способ предотвратить опасное заболевание печени, провоцирующее цирроз и становящееся причиной летального исхода. Многие мамы отказываются ставить ребенку прививку, опасаясь побочных эффектов, хотя они возникают редко. Проводить ли иммунизацию – личное дело каждого. Все же важно узнать о применяемых вакцинах, их особенностях, чтобы решение было взвешенным.

Вакцинация от гепатита В проводят и детям и взрослым

О чем я узнаю? Содержание статьи.

Группы риска

Прививку против гепатита ставят младенцу в первые 12 часов жизни, если отсутствуют противопоказания. Дети рискуют заразиться больше остальных. Так, инфицирование ребенка возможно от беременной матери, а затем – от взрослого любого взрослого. Гепатит B характеризуется сезонностью, что затрудняет диагностику. При этом иммунитет новорожденного несформированный.

Еще группу риска составляют:

• больные, которым переливают кровь;
• члены семьи инфицированного;
• медики, студенты мединститутов, контактирующие с зараженной кровью;
• непривитым пациентам перед операцией;
• туристам, направляющимся в страну с высоким риском встретить больных гепатитом или переносчиков вируса.

Новорожденных обязательно прививают, если они рождены мамой – носителем вируса либо проживают там, где высокая заболеваемость. Еще вакцинация требуется малышам из детдомов, детям, ранее имевшим временные противопоказания.

Необходимость иммунизации обусловлена распространенностью гепатита В. Причем большинство людей – переносчики вируса: они сами часто не догадываются об этом, но заражают окружающих. 1 мл крови содержит огромную концентрацию возбудителя, крайне устойчивого к большинству жидкостей, нагреванию, замораживанию. Есть разные ситуации, когда возможно инфицирование, а лечения, гарантирующего полное выздоровление, нет.

Виды вакцины против гепатита В

Для создания искусственного иммунитета от гепатита В допускается использовать только зарегистрированные вакцины. Они делятся на 2 группы.

Первая группа – моновакцины, содержащие только поверхностный антиген к гепатиту В:

• Вакцина против гепатита В рекомбинантная дрожжевая (Россия).
• Эувакс (Южная Корея).
• Биовак-В (Индия).
• Н-В-ВАКС II (Голландия).
• Вакцина от вирусного гепатита В Энджерикс (Бельгия).
• Моновакцина от гепатита В Регевак (РФ).

Дозировки все производители делают одинаковые. Детям – 0,5 мл препарата, включающего 10 мкг антигена, взрослым – 1 мл, где 20 мкг активного компонента.

Существуют моно и поливакцины

Вторая группа – это поливакцины (комплексные), формирующие стойкий иммунитет к нескольким инфекциям:

• Бубо-М (РФ). Эту прививку ставят детям до 6 лет для профилактики дифтерии, столбняка, гепатита В.
• Бубо-Кок (РФ). В состав вакцины входят антиген вируса гепатита B, коклюшный микроб 1 фазы, столбнячный, дифтерийный анатоксины. Препаратом проводится комплексная иммунопрофилактика детям младше 4 лет.
• Тританрикс Геп В (Великобритания). Обеспечивает профилактику гепатита В, столбняка, коклюша, дифтерии у детей с возраста 6 недель.
• Твинрикс (Великобритания). Этим препаратом вакцинируют против гепатитов А, B людей всех возрастов.
• Инфанрикс-Гекса (Бельгия). Данную прививку ставят до 3-хлетнего возраста, чтобы обеспечить профилактику гепатита В, дифтерии, столбняка, коклюша, полиомиелита.

Новорожденных прививают только посредством моновакцин. Применение поливакцин допускается лишь с 3-месячного возраста.

Противопоказания к применению вакцины от гепатита В

Ставить прививку нельзя при:

• лихорадке;
• обострении хронических болезней;
• инфекционных, воспалительных процессах;
• аллергии на состав препаратов;
• атеросклерозе;
• весе младенца менее 2 кг;
• беременности, кормлении грудью.

Абсолютным противопоказанием является лишь аллергия. Недоношенным младенцам вакцину вводят, когда они поправляются до 2 кг. При нетяжелых ОРВИ, других болезнях вакцинацию проводят, когда нормализуется температура. Если препарат провоцирует сильные реакции – температуру выше 40 градусов, отек, шишку диаметром более 8 см на месте укола, обострение хронических болезней, следующую прививку просто ставят позже, когда проходит обострение.

Схема и график введения вакцины против гепатита B

Перед вакцинацией берутся анализы крови, мочи, кала. Если обнаруживаются антитела к вирусу, это означает, что организм уже имеет собственный иммунитет, прививка не требуется.

Для остальных случаев есть 3 схемы вакцинации:

1. Стандартная. Ставится первая прививка, вторая через месяц, третья – через 5 месяцев после второй. Здоровым младенцам первая вакцина вводится сразу при рождении, далее – по схеме.
2. Альтернативная. Интервал между первыми двумя прививками – 1 месяц, а третья ставится через 2 месяца после второй. Так вакцинируют детей, имеющим проблемы со здоровьем, чтобы повысить иммунитет, а еще взрослых, контактировавших с зараженной кровью.
3. Экстренная. Вторая вакцина вводится через неделю после первой, третья – через 2 недели после второй. Такая иммунизация требуется детям, родившимся у инфицированных матерей. Еще по экстренной схеме прививают пациентов перед операцией, туристов, собирающихся в страны с неблагополучной эпидемической ситуацией.

Экстренная вакцинация проводится новорожденным от инфицированных матерей

Стойкий иммунитет формируется у 98% людей, привитых по инструкции. Эффект действует до 20 лет, иногда сохраняется пожизненно.

Ревакцинацию необходимо проводить через 20 лет после первого курса прививок. Она назначается для профилактики, поддержания ранее сформированного иммунитета.

После введения вакцины появляется маленький шрам, его лучше не мочить. Поэтому первые 3 дня стоит отказаться от приема ванны. Если же вы случайно намочили ранку, нужно сразу насухо вытереть ее. Установлено, что умеренные дозы алкоголя эффективность антигена не снижают. Однако, пока проводится вакцинация, спиртное рекомендуется исключить либо выпивать немного.

Нормальные реакции на введение вакцины

Современные препараты отличаются высшей степенью очистки, поэтому хорошо переносятся. Только 10% привитых замечают покраснение, небольшое уплотнение, болезненность места инъекции. Очень редко, максимум у 5% людей, слегка повышается температура, возникает легкое недомогание. Это нормальные реакции на препарат, не представляющие опасности, проходящие за 1-2 дня.

Побочные действия вакцин и осложнения

Вакцина против гепатита В рекомбинантная дрожжевая и остальные однокомпонентные препараты редко вызывают побочные действия. Это более характерно для многокомпонентных препаратов. Все же укол может вызвать:

• температуру более 38 градусов;
• головокружение;
• головную боль;
• слабость;
• тошноту, рвоту;
• болезненность живота;
• аллергические реакции.

Кроме прочего, прививки могут спровоцировать паралич лицевого нерва, острую почечную недостаточность, анафилактический шок, обострить рассеянный склероз. Однако это чрезвычайно редкие побочные явления, возникающие только у 1 из 200 000 вакцинированных. Гепатит, который может развиться у непривитого человека, гораздо опаснее. Ведь его последствия – цирроз, рак печени, грозящие летальным исходом.

Всем доброе время суток! Итак, с общими вопросами вакцинации мы уже знакомы. Самое время рассмотреть каждую вакцину и заболевание, против которого она направлена. Как было сказано выше, существует национальный календарь вакцинации, календарь профилактических прививок Свердловской области и календарь вакцинации по эпидемическим показаниям. Для вакцинации используют также ряд внекалендарных вакцин. Мы начнем с вакцин национального календаря.

Единственным источником инфекции является человек. Заражение происходит парентеральным путем, т.е. через поврежденные кожные покровы и слизистые оболочки (инъекции, половые контакты при наличии повреждений слизистых покровов, ссадины, порезы и т.д.). Особо следует остановиться на внутриутробной передаче вируса от матери к ребенку. Наибольший риск заражения малыша (70-90%) - в том случае, если у матери происходит активное размножение вируса в организме, что определяется по выделению одного из маркеров гепатита – HbeAg. Через грудное молоко вирус не передается.

Инкубационный период (скрытое течение болезни) может продолжаться от 6 недель до 6 месяцев. Затем наступает преджелтушный период (1-14 дней), для которого характерны слабость, вялость, снижение аппетита, тошнота, иногда боли в животе. Поскольку такие проявления не являются типичными только для гепатита, нередко начало болезни просматривается и первыми признаками могут оказаться потемнение мочи и желтушность склер. В этот период уже происходят изменения в биохимическом анализе крови и возможно выделение из крови некоторых маркеров гепатита. Вскоре наступает желтушный период (1-3,5 недели), который, кроме собственно выраженной желтизны кожных покровов и склер, сопровождается интоксикацией, увеличением печени и селезенки, а иногда и мелкой сыпью. Восстановительный период занимает около года.

Гепатит В может также протекать в атипичных формах – без выраженных внешних проявлений. Такие формы гепатита, как правило, выявляются случайно, путем лабораторной диагностики.

Как и любое инфекционное заболевание, ВГВ имеет три степени тяжести - легкая, среднетяжелая и тяжелая. Для данного заболевания еще выделяют злокачественную форму, для которой характерно очень быстрое развитие тяжелого гепатита.

Проблемы диагностики и лечения предлагаю опустить (это тема отдельной большой статьи) и перейти к вопросу исходов заболевания. Острый ВГВ может закончится выздоровлением, развитием остаточных явлений и переходом острой инфекции в хроническую. Последний исход наименее благоприятен. Частота хронизации зависит от возраста. Около 90% врожденных гепатитов переходят в хронические, при заражении в возрасте от 6 месяцев до 6 лет – 30%, у взрослых – 10%. Хронический гепатит В может иметь доброкачественное течение, но в 25 % случаев, к сожалению, этот процесс необратим.

Самое время вспомнить о вакцинации против ВГВ.

В России зарегистрированы:

Антигеп-иммуноглобулин человека против ВГВ (Биомед, Пермь, Россия)
Иммуноглобулин человека против ВГВ (Комбиотех, Россия)
Гепатект - Иммуноглобулин человека против ВГВ (Биотест Фарма, Германия)
Все моновакцины, т.е. направленные на профилактику именно ВГВ представляют собой генно-инженерные рекомбинантные интактивированные препараты (произведены искусственно из культуры дрожжевых клеток, содержат поверхностный белок вируса гепатита В – HbsAg, очищены от балластных веществ). В качестве сорбента - носителя действующего начала выступает гидроксид алюминия. Все вакцины, кроме помеченных *, содержат консервант – мертиолят. После вакцинации в организме вырабатываются защитные антитела – AНbs.

Комбинированные вакцины применяются для вакцинации против нескольких инфекций, в случае совпадения сроков постановки различных прививок.

Специфические иммуноглобулины применяют для экстренной профилактики, в тех ситуациях, когда имел место опасный в плане заражения ВГВ контакт.

Прививают по схеме: 0-1-6 месяцев. Первую прививку рекомендуется ставить в 1-й день жизни, но если кто запоздал – не беда, можно прививаться в любом возрасте. Недоношенные дети, родившиеся с весом менее 2 кг, могут давать ослабленный ответ на вакцинацию, поэтому их прививают с 2-х месячного возраста. Для детей групп риска (мама – носитель HbsAg) схема вакцинации 0-1-2-12 месяцев. В ряде стран таким малышам одновременно с вакцинацией ставят специфический иммуноглобулин.

Вакцина высокоиммуногенная, то есть защитные антитела образуются хорошо и вопрос о ревакцинации (поддерживающей дозе вакцины) актуален для медработников и людей с иммунодефицитами.

Метод введения: внутримышечно (детям в переднюю поверхность бедра, взрослым в дельтовидную мышцу, то есть в плечо сбоку). Все вакцины взаимозаменяемы.

Прививочные реакции и осложнения: в 17% случаев может быть покраснение и уплотнение в месте введения, субфебрильная (до 38,0) температура наблюдается у 6% привитых, сыпь (1:30000), крапивница (1:100000), анафилактический шок (1:600000). Существуют данные о возможной связи обострения рассеянного склероза с вакцинацией против ВГВ.

Противопоказания: тяжелые заболевания сердца и легких, острые инфекционные заболевания.

Республик (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 120376 (21) 2332953/28-13 (23) Приоритет — (32) 17. 11. 75 (51) М. Кл.

Дата опубликования описания 150480 (72) Авторы изобретения

Альфред МайеР ПРинс, Александер Роберт Ньюрат (США), Джон Внек (ЧССР) и Кристиан Трепо (Франция) Иностранная фирма

Дзе Коммьюнити Блад Каунсил оф Грейтер Нью-йорк, Инк (США) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ГЕПАТИТА В

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается производства бактерийных препаратов.

Известен способ получения вакцины против гепатита В путем выделения частиц HBsAg, содержащих е-антиген на частицах или в растворе, из плазмы крови носителей антигена гепатита В, содержащей е-антиген с последующей инактивацией целевого продукта (1) . Однако вакцина, полученная . известным способом, не обладает высокой специфичностью.

Целью изобретения является повышение специфичности вакцины.

Эта цель достигается тем, что плазму крови обрабатывают 3,04,5 вес.Ъ полиэтиленгликоля при РН

4,4-4,7, полученный осадок, содержащий HBsAg частицы размером 30-50 нм, растворяют при РН 4,9-5,1, затем

РН надосадочной жидкости доводят до 4,4-4,7, повторно обрабатывают полиэтиленгликолем и полученный осадок растворяют в физиологическом растворе.

Кроме того, целевой продукт инактивируют обработкой формалином или р -пропиолактоном или облучением рентгеновскими лучами.

Предлагаемым способом получают вакцину против вирусного гепатита, которая включает в свой состав антигенные частицы, имеющие размер частиц 20-50 нм, причем эти антигенные частицы содержат неосажденные свободные необъединенные гепатит р-поверхностные антигены. Вакцина имеет менее 10 единиц антител гепатит Р --поверхностного антигена на 1000 ед. гепатит -поверхностного антигена. 5Ъ частиц с размером, лежащим в интервале 3-50 нм, содержат неосажденные е-антигены или специфичные антигены, аналогичные частицы Дана. Антиген гепатита и е-антиген содержатся в вакцине в количестве, достаточном цля образования антител при введении нх в организм животного.

Для получения вакцины против гепатита В используют материал, состоящий из плазмы, полученной из хронического носителя, который содержит антигены. Такая плазма также содержит большое количество частиц Дана и волокон, не содержащих объединенного анти-е-антитела. Плазма может быть получена от клинически здоровых человеческих хронических носителей нВ, а также от шимпанзе, которых

728720 естественно или искусственно инфицировали вирусом HB и которые становились хроническими носителями е-антиген положительногo HBsAg.

Исходный материал должен быть бактериологически стерильным и должен быть свободным от присутствия адвентициальных вирусов.

Очистку проводят обычным способом.

Из антигенсодержащего вещества крови удаляют примеси путем подкисления до рН 4,4-4,7. Выпавший осадок вместе с клеточными остатками удаляют центрифугиронанием в течение

20 мин со скоростью 10000 об/мин.

После этого материал смешивают с

2,5-4,5 вес.Ъ полиэтиленгликоля, !

5 предпочтительно с 3,0-4,5 вес.Ъ. Более ни з кие концентрации, например

3-4Ъ, могут осаждать крупные формы частиц и поэтому при определенных обстоятельствах являются предпочти- 20 тельными. Весовой процент полиэтиленгликоля рассчитывают по отношению к общему весу смеси. Таким образом, осаждают антигенный материал, содержащий гепатит В с более крупным 25 размером частиц, например 30-50 нм, а также часть материала, содержащего оболочкоподобный гепатитный В поверхностный антиген. Осадок, содержащий

HBsAg, регенерируют, и добавляют некоторое количество воды при рН 4,9—

5,1. Образуется осадок, содержащий белковое вещество и полиэтиленгликоль, а жичкая фаза — надосадочная жидкость, содержащая HBsAg, содержит частицы Дана или волокнистое вещество, рН недостаточной жидкости доводят до 4,4-4,7. Затем ее смешивают с 3,0-4,5 нес.Ъ полиэтиленгликоля, считая на общий вес смеси, с образованием осадка, содержащего очищен- 40 ные частицы, содержащие HBsAg поверхностный антиген, имеющие оболочкооб.разную конфигурацию с размером частиц 20-30 нм и волокнистые частицы, содержащие HBsAg e-антиген, который не содержит какого-либо анти-е-антитела, причем волокнистые части— цы имеют диаметр 20-50 нм, а также частицы Дана со сферической конфигурацией, имеющие размер 40-50 нм и 50 имеющие липопротеиноную внешнюю сферу, содержащую HBsAg и е-антигены, а также содержащие сердцевину, включающую ДНК, ДНК полимеразу и HBsAg.

В результате регенерируют очищенный антигенный материал. После этого его обрабатывают с целью инактинации вируса, а полученный осадок растворяют в физиологическом растворе.

Температура каждой из смеси после Я каждой стадии смешивания поддержинают в интервале 0-80 С в ходе образоЯ вания осадков. Стадия очистки облегчается, если регенерацию усиливают в результате центрифугиронания с 65 последующими стадиями осаждения.

Полиэтиленгликоль используют н виде водного раствора, который содержит

30 вес.Ъ полиэтиленгликоля. Такой полиэтиленгликоль имеет мол. вес.

500-50000, предпочтительно около 6000.

Дальнейшую очистку осуществляют путем адсорбции очищенных антигенов на гидроксилаппатите с использованием хроматографии. Частично очищенные антигены пропускают через хроматографическую колонку, содержащую гидроксилапатит, на котором они адсорбируются. Дополнительно очищенные антигены затем регенерируют с использованием мчогоступенчатого элюирования. Частицы с размером 2550 нм регенерируются отдельно от фракций с частицами более мелкого размера (16-22 нм) и от основной массы сывороточных протеинов. После очистки фракция более крупных частиц может быть инфекционной. Для этого осуществляют инактивацию. Целевой продукт инактинируют обработкой формалином в концентрации 1:2000 в течение 4 дней при 37 С с использованием обычных методик или облучением рентгеновскими лучами. Вакцину осветляют путем фильтрации через

MiIIipore 0,22, фильтр или эквивалентный фильтр перед добавлением формалина или PJ -пропиолактона.

После инактивации конечный продукт подвергают диафильтрации с использованием Amicon РПЗО фильтра или эквивалентного фильтра против

0,9Ъ NaCI, содержащей 1:10000 ThiomerasaI и любой стабилизатор, для удаления низкомолекулярных соедине- ний, используемых для инактинации, затем стерильно фильтруют и соответствующим образом разливают в стерильные ампулы для модификации или замораживания, Вакцину используют на отсу".ствие инфекциозности, иммунологическую активность.

Вакцину можно применять путем подкожной или ннутримышечной инъекции. Применяют обычно около днух доз в месяц с последующим введением вспомогательного вещества н период от 6 мес. до 1 года после перничной иммунизации. Первоначальная дозировка зависит от веса организма, а последующие дозировки — в зависимости от уровня антител в крови после первоначальной иммунизации.

Использование получаемой вакцины против гепатита В предотвращает хроническое заболевание печени.

Пример 1. Очистка и определение НВ ассоциированных частиц из

7,8 л плазмы от одного шимпанзе-носителя HBsAg.

Вещества и методики. Источник

Антиген очищают из объединенной плазмы носителя шимпанзе, преднари728720 тельно инокулирэванйого человеческой

HBsAg — положительной.плазмой, относящейся к adn подтипу. е-Антиген присутствует на поверхности способных к идентификации частиц Дана и используемой плазме.

Очистка HBsAg и е-антигена.

HBsAg и е-антиген выделяют из плазмы путем осаждения с помощью полиэтиленгликоля (PEG). Повторно суспендированный осадок HBsAg и е-антигена очищают хроматографированием на колонке с гидроксилапатитом. Конечные стадии очистки включают плотностное градиентное центрифугирование.

Осаждение HBsAg и е-антигена с помощью PEG.

На стадии, предшествующей очистке 7,800 мп HBsAg и на содержащей е-антигена плазмы, устанавливают рН 4,6 и добавляют ЗОЪ-ный раствор 2()

PEG в дистиллированной. воде до приблизительно 2Ъ концентрации. Раствор оставляют на ночь при 4 С и осветляют центрифугированием HBsAg во всплывшем слое, осаждают увеличением концентрации PEG до 4Ъ. Всплывший слой после стояния в течение ночи при 4 С декантируют и отбрасывают. Осадок

HBsAg (содержащий е- антиген) ресуспендируют до 500 мл в дистиллированной воде. Основную часть PEG с некоторыми примесями осаждают, устанавливая рН раствора равным 5,0 и осадок удаляют центрифугированием. Прозрачный верхний слой доводят до рН 4,6 и HBsAg и ассоциированный с частицей е-А HBsAg (e) осаждают в результате добавления ЗОЪ раствора

PEG до конечной концентрации 4Ъ.

HBsAg/е удаляют центрифугированием после стояния образца в течение но- 40 чи при 4 С. Наконец, осадок HBsAg/е о ресуспендируют до 320 мл в дистиллированной воде.

Хроматографирование на колонке с гидроксилапатитом. 44

50 мл ресуспендированного .PEG осадка HBsAg/å пропускают через колонку 6,5 X 16,5 с гидроксилапатитом и элюируют прерывистым градиентом фосфатного буфера. В следующем экс- 5<) перименте 200 мл образца подвергают частичной очистке на колонке

6,5 X 35 см с гидроксилапатитом.

HBsAg, элюированный совместно с первым протеиновым пиком, пропускают

55 через колонку с гидроксилапатитом во второй раз.

Плотностное градиентное центрифугирование.

Фракции HBsAg, выделенные хроматографированием на колонке, очищают 40 скоростным зональным центрифугированием. Прерывистый градиент получают при использовании 3 мл 60 Ъ и 7 мл

40Ъ сахарозы в 0,02 М натрийфосфатном буфере при рН 7,2 (содержащем

В каждую пробирку загружают по

20 мл образца и центрируют на Spinso

SW 25,1 роторе при 18000 об/мин в течениЕ. 18 ч.Фракции объемом 1!мл собирают по каплям со дна пробирок и анализируют на содержание НВздд, Фракции, содержащие максимальное количество антигенной активности, объединяют, тщательно диализируют и концентрируют ультрафильтрацией с использованием мембраны с 30000 MW отжимным рантом (Амикон РМ-30) . -.Концентрированные фракции HBsAg подвергают конечным стадиям очистки изопикническим связыванием в линейном градиенте CsCI и скоростному зональному центрифугированию в прерывисТоМ градиенте сахарозы при обычно используемых условиях.

3а содержанием HBsAg следят методом встречного электрофореза (CEP) или твердо-фазной радиоиммунопробой

Ausria 1 или II, Abbott Laboratories

Концентрацию протеина устанавливают при 280 нм с использованием микрометодики KjehIdahI

Критерий чистоты HBsAg.

Образцы после каждой стадии очистки анализируют методами целлюлозоацетатного электрофореза, иммуноэлектрофореза и испытаниями диффузии в системе агарового геля по отноше— нию к поливалентной аытинормальной человеческой плазмапротеиновой антисыворотке.

Полиакриламидный гелевый электрофорез.

Аликвоты образцов, содержащие

0,01 натрий фосфатный буфер при рН 7,2, 1Ъ натрий додецилсульфата, 1Ъ -меркаптоэтанола и 10Ъ глицерина, нагревают в течение 2 мин на кипящей водяной бане, обрабатывают 7,510Ъ найтрийдодецилсульфатакриламидными гелями.

Результаты очистки HBsAg/е положительных сывороток осаждением с помощью полиэтиленгликоля представлены в таблице. Около 87Ъ первоначального протеина плазмы удаляются на первой стадии осаждения HBsAg (которая включает предочистку при концентрации

PEG 2Ъ) . Конечный выход после двух последовательных стадий осаждения с помощью PEG лрказывает количественную регенерацию HBsAg в присутствии лишь

4Ъ первоначальных протеинов.

Очистка объединенного HBsAg шимпанзе осаждением с помощью PEG-6000.

4% PEG 320 10 000

50 мл ресуспендированного PEG осадка НВэАу фракционируют хроматографированием на гидроксилапатите.

Элюат группируют на семь фракций, которые диализируют по сравнению с 0,02 М натрий-фосфатным буфером при рН 7,2 (содержащим 0,02% азица.натрия) и концентрируют ультрафилы- 2О рацией. Концентрированные образцы анализируют на протеины при 280 нм и на присутствие HBsAg методом CEP.

200 мл ресуспендированного PEG осадка HBsAg Фракционируют на 1000 мл колонке с гидроксилапатитом. Фракции HBsAg из первого протеинового пика (группа 1: фракции 38-83) и оставшийся элюат (группа II фракции

84-110) объединяют и концентрируют до 75 мл ультрафильтрацией.

Концентрированный образец из группы 1 повторно хроматографируют на колонк объемом 1000 мл с гидроксилапатитом.

Элюат объединяют на восемь фракций. Объединенные образцы концентрируют ультрафильтрацией и промывают

0,02 М натрий-фосфатным буфером при рН 7,2 (содержащим 0,02% азида натрия) . Эти образцы анализируют на 40 протеин и HBsAG.

Анализ образцов на содержание примесей методом иммуноэлектрофореза обнаружил очень слабую линию преципитации во фракции I, более сильную линию во фракции ll — Vl и сильно выраженную широкую линию в объединенных фракциях Vl(-ЧИ), которые мигрируют между альфа и альбуминной областями °

Электронн ая микроскопия образцов обнаружила в основном сферические частицы с диаметром 22-28 нм во фракциях 1 — ill сферические частицы и волокна, но фракциях lV -Ql, гла.вным образом небольшие сферические ча стицы и некоторое количество волокон но фракциях Vll ч Vill

Концентрированные образцы из предыдущих стадий подвергали полной очистке плотностным градиентным цент- Щ рифугиронанием.

Очищенные препараты HBsAg, состоящие главным образом из сферических частиц диаметром 20-22 нм, сферических частиц диаметром 22-28 нм, волокон различного размера и частиц

Дана, содержащих по 100 мг протеина, анализируют на полипептидный состав полиакриламид гелевым электрофорезом.

Количественную разницу наблюдают н протеиновых пиках индивидуальных образцов.

° Пики карбогидратов низкого молекулярного веса представляют собой гликолипиды, поскольку они не проявляются при голубом окрашивании по

Вакцину готовят иэ фракций крупных частиц, полученных в результате добавления человеческого сывороточного альбумина с концентрацией

0,5 мг/мл с последующей инактинацией по сериям облучением от кобальтового источника (2,5 миллиона рад) инактивацией формалином с использованием общепринятых методик (37 С, 96 ч, концентрация 1:2,000), с последующим использованием Р-пропиолактона по методикам, обычно используемым при производстве вакцин против бешенства.

Пример 2. Модифицированная .усонершенствованная PEG методика для выделения HBsAg/е.

Модифицированную методику для осаждения PEG используют на 2,6 л смешанной НВэА9, содержащей плазмы от одного шимпанзе-носителя, содержащего е-антиген н необъединенном, неосажденном виде. рН плазмы устанавливают равным приблизительно 4,6 и немедленно добавляют 30%-ный раствор PEG до конечной концентрации 2%.

Раствор вымораживают на льду н течение 30 мин (вместо стояния в течение ночи при 4 С, как в предыдущем примере) и осадок удаляют центриФугированием.

Во всплывшем слое, содержащем

HBsAg, устанавливают концентрацйю

PEG, равную 4% (нместо 4,5% н предыдущем примере) в результате добавления б,б ч на 100 30%-ного раствора

PEG при комнатной температуре. Суспензию снова вымораживают на льду в течение 30 мин и осажденный

HBsAg/е удаляют центрифугиронанием.

Осадок ресуспендируют до 200 мл в дистиллированной воде. Основную часть

PEG и сопутствующих примес и ) д ляю

,ст, КГ!;! i аП2 ТИТЕ т анаЛИ 3((: : "! т,, (3 (>1 ной изоэле: с), Препараf состоящий i >д 3;,-. - Об, Яз сферичес)ких частс(с(:ц)(д.: е !.po;:. 2

2 8 нм и Гете(эот ен ной с:1 , с;> (: с(4ей B QciloBHQ(v боле —. (рт n (ь>Г ..а!) ТОНО Ут Т 0). IJOC !1 ЕЛ! ЬНО i iò! 3,, т . . ОБЕ,Э 1(1!ОСТ -,Qi)т "„;,i) я

Дс чаГтиЦ ., ОснО Вной 17!! (;- Е -! HB аи Ти ГЕН,-1 ой;-„(:13; Bki0 01 8 !",с)УГих э кспе(эим v/>KЕН а ЛИШЬ В Ин ТeРвдЛЕ рН, I) 4 . = >. QT антиГен был Об(= (Цэч

3 ТОЙ О Лс> (т(Нст Ir/ BC TB Èòý>I>Ь 1; -,rvi !

10!)Ь)Tа-(Иe)V(.I:;ИффУ3ИИ На Х CЛe 2ГСPта (соне нный Вс(кЦиОннь) прОЦ>т кT T(QJ)r/ "

:.B1) I по методике примера 1 с и споль"Овд НИ ЕМ ЧЕЛС ВЕЧЕ Скос 0 аЛЬОУМИН д. и метоцик инактивации с желаемой ара( !е детерГентнОЙ ассОцидцеи *

П р -! !v(е р 5 . Очистка. pcicTBQp(! мото с--антиге!.а из плазмы хрони (ес-" ((их носителей IIBsAg/е для .-..тcsofii 30-,:а:-(ия В кдт!естве Вакцины

jIBsAg /e пол эр)>() пт о !э(с!а превалирует во многих плазмах та) ) 1 H гrsi для яммуниза!(ии.

Свойства растворимо "о е-антиг.",;:: =. бы/!н определены как следующие: плотнссть CsCI/Õ>28 — 1,29; S2(3„/= .1>1!6, молекулярный Brsc 150000-900000; изоэлектрическая точка 5,5-6,, б, элю);роВдние из диэтиламиноэти/л целлюл О „20 О. с последующим осаждением е-антиген=-. н некоторых протеинов плазмы с по. Qщью РЕ(при 9-13% PEG концентрации.

ЦНИИ(!И Заказ 3171/54 .Гт!

43)mHBл 1II1II EIBте>-1 T, г, 1 дд тт. i. — с k i. / .!isii, !"!P J В,! 1;т

; >тп (ро! а, "О 30 Лв с 1 I 11 С 6!"-т -rrc И)1/ =. ° . (> (! 1 —.. (vo i ф О К ; . i 1:, l i, К Е: 0 .

05 (7 .( ,! . О; 0 11! . и

Е Р -. 3 К 0 —, (- ;= >(С .11((с r 1 1 ГМ;: б, 1 ней( радliе! 10!т! О, (0 i ) ."! <>а01 В 10(т! 3(е

fj 1фе1)е ., i-— - ./:g -! >(, 1)> j>, JB 1 при 0 1 э !с

I4BCÕ с BH kj д И(И! я > - =-:;13И:l р2>Ц>(ЕИ О(- I)BÞ! J 0 ":h Qll. (13 CH .ц .!)1 (Ci

С>: ,Иенте сахгрозь!

)(ЛИ Э -(BH В с IЛОТ ИОСТ НОМ I pc. д(унтe сс рpе(е !cpa!)!(el(1 1,6 пика

0 .lи(ценнь. и д:- -т9 c"1 д били зируlОт дс— бс(влением длхсб>/ J(isci. челОВеческой сыворотки до концеи Г-)эации поря цка

0 . Э lv .is/iv!3 i, Такие препараты при кос!Цен трации

ОКОЛО 20 iv(1(B !(B дозу (0(>/T бЫТЬ пользова«ы В качес(ве вакцинь. против гспатита Б после инак(ивдции >(стеРИ)(И 3 ".1 il И. J. I p i3 (1 3 l ñl Г 2 Е с ! С ! С С 0 б Г Q 3 B (. Л S - S i i (3 =

ВЫСИТ Ь Ci(С (i, 1ôè ×IIÎÑÒ с. Попу>(ан(!ОЙ >дд К

> i-ij-, r.—!,Нl! Я (j7QCQ 17 Г!ОЛ" -(Г if) BB)1ЦНН! * Jjr)0

Тив !. Bj(B7 И д. О ll „- ". --l,i ВЫцт ЛЕНИН Час ! Ь((т I I ББ> )(сат! Ib>3(Е дl; ТИ ГЕН HB крови )Оителе--; а: †.7:.Гена Гепати(= . R, ((дЩЕ ст сд - - () т И- — си С; Ti QC1(c 1-i1",(rт-,Е и

)(ll ак "И Вс(1>,ИЕЙ Q . ..О((> 1(31>:I .-с! .. . I:.-- . : i 11)oc7 .) тт с!*с! 1>1: i. II i3! с1 3Jv!1, >

5 BCÃ, с ПС)ли . Т -(ЛЕ;1 Г>. КОЛЯ ПГЭИ 1)Н

/ (-,ОЛ!.с яют (то((рl1 4 . 9 -5 ., За! д(/т рН нацосадс,но-. -; жид)(о«" s r(osопят до

И ". - с cr!, -,т.ТС; J r!3 Л- Вс>й Hpo„ ),у! T

;)ь ri ( (О .. Г бра бОJ HQ. i (()Ормс Ji;;IH Qi i .: !! 8! («10П)(ОЛB J- . T, HQ(r(":4Л . Г блу -: д. ПЕ" 1 . О Ь> (Э т(И (iтт )Тт> - — > i rë 3(-Н; - =„.-(7 C"((Ä = -6 (с-19 1