Противовирусную активность in vivo
Введение
В настоящее время арсенал лекарственных средств для противовирусной терапии включает химиопрепараты этиотропного действия, средства для иммунокорригирующей, патогенетической и симптоматической терапии. Открытие нового вирусного агента требует тестирования уже известных антивирусных препаратов в отношении этого вируса и проведения всего комплекса научных исследований по созданию новых антивирусных препаратов, эффективных в отношении вновь обнаруженных вирусов. Другим аспектом этой проблемы является возникновение лекарственной устойчивости у хорошо известных вирусных агентов [2]. Поэтому вопрос о необходимости разработки и поиска новых противовирусных препаратов представляется особо актуальным. Одним из приоритетных направлений развития современных противовирусных препаратов в медицине является поиск биологически активных соединений, обладающих лечебными свойствами, из природных источников.
Благодаря исследованиям последних десятилетий стало известно, что базидиальные грибы являются продуцентами целого ряда биологически активных веществ: белков, липидов, полисахаридов, органических кислот, ферментов, витаминов и др. [1; 5; 7]. Установлено, что биологически активными соединениями, подавляющими репродукцию вирусов, являются терпеноиды. Так, при анализе антивирусной активности экстракта базидиального гриба Ganoderma pfeifferi в отношении вируса гриппа А и вируса простого герпеса 1 типа установлено, что основным антивирусным компонентом экстракта были тритерпеноиды: ганодермадиол, луцидодиол, апланоксиновая кислота G. В грибе чага Inonotus obliquus, обладающем противоопухолевыми и антивирусными свойствами, также выделены терпеновые соединения [4]. Из несовершенных грибов такими свойствами могут обладать нематофаговые (хищные) грибы, которые представляют собой уникальную экологическую группу грибов-микромицетов, являющихся естественными врагами паразитических нематод. В механизме хищничества существенную роль играют сесквитерпеновые соединения [1]. Объем публикаций, посвященный базидиомицетам, чрезвычайно велик, в то время как практически нет работ по исследованию противовирусной активности нематофаговых грибов. Имеется информация по ряду биологически активных веществ (БАВ), участвующих в процессе зоотрофного питания нематофаговых грибов. К ним относятся аттрактанты, привлекающие нематод; нематициды, обездвиживающие нематод и участвующие в разрушении их внешних оболочек при прорастании гиф гриба внутрь тела пойманной нематоды, а также ферменты.
В настоящей работе проведено исследование противовирусных свойств водных экстрактов базидиомицетов и нематофагового гриба в отношении вируса гриппа в экспериментах in vitro и in vivo.
Материалы и методы
Референс-препарат. Тамифлю, 75 мг, капсулы (cерия В1367В01, Ф. Хоффманн - Ля Рош Лтд., Швейцария, Roche).
Определение противовирусной активности экстрактов грибов in vitro. В исследованиях по определению противовирусной активности грибных экстрактов использовали их максимально переносимые концентрации (МПК). Готовили разведения вируссодержащей жидкости от 1 до 8 с десятикратным шагом на среде RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина. Для определения противовирусной активности грибных экстрактов в профилактической схеме на монослой культуры клеток MDCK вносили образцы в объеме 50 мкл/лунку в максимально нетоксичной концентрации, после инкубирования клеток при температуре 37 °С в атмосфере 5% CO2 в течение 1 ч вносили разведения вируссодержащей жидкости в объеме 50 мкл/лунку и вновь инкубировали клетки в течение 2-3 суток при температуре 37 °С в атмосфере 5% CO2. По окончании инкубирования клеток регистрировали цитопатическое действие вируса (ЦПД) в монослое клеток с помощью инвертированного микроскопа и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами петуха [6]. Определяли индекс нейтрализации (ИН, в lg) вируса гриппа по формуле: ИН=Титрконтроль-Титропыт.
Определение протективных свойств экстрактов макро- и микромицетов в отношении вируса гриппа в экспериментах in vivo. В опытах по изучению протективных свойств экстрактов грибов в отношении вируса гриппа использовали следующие схемы: экстренно профилактическую - экстракты вводили перорально мышам (по 200 мкл/мышь) через час после заражения вирусом гриппа А/Aichi/2/68 (H3N2) или A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1), далее экстракты вводили 1 раз в сутки в течение 5 суток; лечебно-профилактическую - экстракты вводили перорально мышам (по 200 мкл/мышь) за час до заражения вирусом гриппа А/Aichi/2/68 (H3N2) или A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1), далее экстракты вводили 1 раз в сутки в течение 5 суток. За животными наблюдали в течение 14 суток. Высчитывали процент выживаемости животных в опыте и контроле, коэффициент защиты (КЗ) и среднюю продолжительность жизни (СПЖ) мышей. КЗ высчитывали по формуле: % гибели мышей в контроле - % гибели мышей в опыте [6]. Все опыты проводили в трехкратной повторности. Статистическую обработку проводили общепринятыми методами, оценивали доверительный интервал для 95%-ной вероятности.
Результаты и обсуждение
Изучение протективных свойств экстрактов грибов макро- и микромицетов в отношении вируса гриппа в культуре клеток MDCK. В экспериментах по изучению противовирусной активности использовали экстракты грибов в дозах, нетоксичных для монослоя клеток. Эксперименты in vitro показали, что грибные экстракты обладают вируснейтрализующим эффектом в отношении вируса гриппа. Индекс нейтрализации (ИН) вирусов гриппа для большинства образцов составлял 1,4-7,5 lg. Наибольшим нейтрализующим действием в отношении вируса гриппа А/Aichi/2/68 (H3N2) в профилактической схеме введения экстрактов обладали образцы №№ 07-45, 09-78, 09-80, 09-92 и 09-93, а в отношении вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) - образцы №№ 09-76, 09-78, 09-80, 09-92, 09-93 и 09-65 ПС (образец, содержащий полисахариды) (табл. 1). В лечебной схеме применения грибных экстрактов наибольший противовирусный эффект обнаружили образцы №№ 08-09, 09-65 ПС и 11-72 в отношении вируса гриппа A субтипа A/H3N2 и образцы №№ 09-65 ПС и 09-66 ПС в отношении вируса гриппа субтипа A/H5N1 (табл. 2). Изучение противовирусной активности образцов, приготовленных на основе гриба-микромицета (Duddingtonia flagrans), обнаружило значительный противовирусный эффект в отношении обоих используемых штаммов вируса гриппа. Так, при лечебном применении экстрактов культивированной биомассы хищного гриба (№ 10-70) и культуральной жидкости (№ 10-70 КЖ) ИН были выше 4,0 lg как в отношении штамма А/Aichi/2/68 (H3N2), так и в отношении штамма A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) (табл. 1). В эксперименте с профилактической схемой введения грибных образцов ИН в отношении штамма субтипа A/H3N2 составляли 2,68±0,39 и 4,30±0,65 для образцов №№ 10-70 КЖ и 10-70 соответственно, а в отношении штамма другого субтипа - A/H5N1 ИН были максимальными в данных экспериментах и составляли 5,21±0,49 и 5,85±0,32 для этих образцов соответственно.
Таким образом, экстракты плодовых тел грибов макромицетов и экстракты нематофагового гриба микромицета Duddingtonia flagrans в экспериментах in vitro значительно подавляют репродукцию вируса гриппа разных субтипов. Изучение протективных свойств экстрактов грибов макро- и микромицетов в отношении вируса гриппа в экспериментах in vivo. В опытах in vivo, проведенных по лечебно-профилактической схеме, введенный мышам экстракт базидиомицета Inonotus obliquus (образец № 12-11) обнаружил протективную активность в отношении вируса гриппа А/Aichi/2/68 (H3N2), коэффициент защиты этого образца составил 20% при выживаемости животных - 60% (табл. 3). Экстракты всех других исследованных базидиомицетов (образцы №№ 09-11/8, 11-109 и 12-15) не проявили протективной активности (табл. 3). В инфицированной группе сравнения (введение Тамифлю) и контрольной инфицированной группе (введение дистиллированной воды) выжило 90 и 40% животных соответственно, при этом коэффициент защиты для Тамифлю составил 50%. Более высокие показатели защиты инфицированных мышей были обнаружены в экспериментах, проведенных по экстренно профилактической схеме с образцами (№№ 10-70 и 10-70 КЖ) на основе хищного гриба Duddingtonia flagrans: доля выживших животных, инфицированных вирусом гриппа А/Aichi/2/68 (H3N2), составила 80 и 60% соответственно, а коэффициент защиты - 65 и 45% соответственно (табл. 4). В контрольных группах (введение Тамифлю и дистиллированной воды) выжило 100 и 15% животных соответственно, при этом коэффициент защиты для Тамифлю составил 85% (табл. 4). В аналогичных экспериментах с образцом № 10-70 показатели защиты мышей, инфицированных вирусом гриппа птиц - A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1), были ниже таковых в отношении вируса гриппа субтипа A/H3N2. Так, доля выживших инфицированных животных при введении образца № 10-70 и коэффициент защиты составляли 19%, в контроле (введение Тамифлю) значения обоих данных показателей составляли 40% (табл. 4). Средняя продолжительность жизни животных, инфицированных вирусом гриппа А/Aichi/2/68 (H3N2), при введении им образцов № 10-70 и Тамифлю была достоверно выше по сравнению с СПЖ зараженных этим же вирусом мышей контрольной группы (без введения препарата) (табл. 4).
Заключение
Таким образом, водные экстракты грибов макромицетов и микромицетов обладают противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа субтипов A/H3N2 и A/H5N1 в экспериментах in vitro и in vivo, что делает перспективными дальнейшие исследования по использованию их для разработки профилактических и лечебных препаратов против гриппа.
Таблица 1 - Противовирусная активность экстрактов макро- и микромицетов в клетках MDCK, инфицированных вирусом гриппа
(профилактическая схема) (М±m, n=3)
Образец
Индекс нейтрализации (Титр контроль - Титр опыт), lg
С. Я. ЛОГИНОВА 1 , С. В. БОРИСЕВИЧ 1 , В. Н. ЩУКИНА 1 , М. В. ЛЫКОВ 1 , Г. В. БОРИСЕВИЧ 1 , В. П. БОНДАРЕВ 1 , В. Е. НЕБОЛЬСИН 2 , О. А. СУТОЧНИКОВА 3 , А. Г. ЧУЧАЛИН 3
Ключевые слова: грипп A (H1N1), Ингавирин ® , противовирусная активность.
S. Ya. Logi Nova, S. V. Borisevich, V. N. Shchukina, M. V. Lykov, G. V. Borisevich, V. P. Bondarev, V. E. Nebolsin, 0. A. Sutochnikova, A. G. Chychalin
Virusological Centre, Branch of Central Research Institute No. 48 of the Ministry of Defense of the Russian Federation, Sergiev Posad
Valenta Farm, Moscow
Research Institute of Pulmonology, Moscow
High in vitro and in vivo efficacy of Ingavirin ® against the Mexican pandemic influenza virus A/H1H1/2009. strains A/California/ 04/2009 (M1N1) and A/California/07/2009 (H1N1) vs. the reference drug Arbidol ® was studied and verified when used therapeutically and prophylactically.
Key words: influenza virus A (H1N1), Infavirin, antiviral activity.
К настоящему времени стратегия отбора эффективных неспецифических медицинских средств защиты для многих вирусных инфекций описана в руководствах по доклинической оценке лекарственных средств [3,4].
Ранее была показана противовирусная эффективность in vitro и in vivo нового отечественного химиопрепарата Ингавирин ® в отношении эпидемически и предпандемически значимых подтипов H3N2, H5N1 вируса гриппа типа А, вируса гриппа В и аденовируса 5. Кроме того, была показана эффективность Ингавирина ® в отношении возбудителя пандемического гриппа A/H1N1/09 в культуре клеток MDCK [12]. На втором этапе исследований необходимо было провести оценку эффективности препарата на лабораторных животных и завершить исследования в культуре клеток.
Культура клеток. Использована постоянная культура клеток почек собаки - MDCK. В качестве ростовой среды и среды поддержания использовали полусинтетическую среду (ПС-4) на растворе Хенкса, содержащую 7,5 и 2% фетальной сыворотки теленка, соответственно.
Монослой клеток MDCK инфицировали вирусом гриппа А при температуре 37°С в течение 60 мин в дозе 0,001 ЦПД50 Оценку цитопатической активности вируса в присутствии и отсутствии химиопрепаратов проводили с использованием светового микроскопа. Исследуемый препарат вносили спустя 1 час после инфицирования монослоя.
Титрование возбудителя гриппа А. Биологическую активность оценивали титрованием вируссодержащей суспензии в РКЭ (lg ЭИД50/мл) и по ЦПД в культуре клеток MDCK.
Оценка противовирусной эффективности Ингавирина ® осуществлена в соответствии с официальными требованиями [4]. Изучение активности Ингавирина ® в отношении вируса гриппа А проводили на белых мышах, инфицированных интраназально в дозе 1,1х10 3 ИД50. Препарат вводили по профилактической (за 5 суток до инфицирования, ежедневно однократно в дозе 5 мг/кг) и лечебной (через 24 ч после инфицирования и далее в течение 5 суток однократно в дозе 15 мг/кг) схемам.
Препарат контроля Арбидол ® вводили в дозах и схемах в соответствии с Инструкцией по его медицинскому применению с учётом равноэквивалетности доз для человека.
Основными критериями оценки эффективности in vitro являлись:
- коэффициент ингибирования гемагглютинирующей активности (Ки, %);
- коэффициент подавления цитопатической активности вируса (%).
Основным критерием оценки эффективности препаратов in vivo являются показатели уровня ингибирования формирования специфического гемагглютинина и уровня накопления вируса в легких белых мышей на 5 и 7 сутки после инфицирования (Ки, % и Δ, lg).
Таблица 1.
Подавление цитопатического действия вируса гриппа A/H1N1/09 препаратами в культуре клеток MDCK (n=3)
| Препарат | Концентрация препарата, мкг/мл | Инфицирующий препарат - вирус гриппа A/H1N1/09, штамм. | Частота ЦПД | Коэффициент ингибирования цитопатической активности вируса, X±σх, % |
| Ингавирин ® | 200 | A/California/07/09 | 13/30 | 56,7±3,2 |
| Арбидол ® | 25 | 19/30 | 36,7±3,2 | |
| Контроль без препарата | 30/30 | - | ||
| Ингавирин ® | 200 | A/California/04/09 | 12/30 | 60,0±0,0 |
| Арбидол ® | 25 | 19/30 | 36,7±3,2 | |
| Контроль без препарата | 30/30 | - |
При изучении способности Ингавирина ® подавлять гемагглютинирующую активность штаммов A/California/04/2009(H1N1) и A/California/ 07/2009(HlNl) вируса гриппа в культуре клеток MDCK установлено, что исследуемый препарат подавляет формирование специфического гемагглютинина возбудителя на 66,7 и 58,3% соответственно (табл. 2). Показатель подавления формирования специфического гемагглютинина вируса гриппа для препарата Арбидол ® составил 50,0% для обоих штаммов. Ингавирин ® более эффективно ингибирует размножение вируса гриппа A(H1N1), штаммы A/California/04/2009 и А/Саlifornia/07/2009 в культуре клеток МДСК, чем препарат сравнения Арбидол ® .
Таблица 2.
Подавление образования специфического гемагглютинина вируса гриппа A/H1N1/09 препаратами в культуре клеток MDCK (n=3)
| Препарат | Концентрация препарата, мкг/мл | Инфицирующий препарат - вирус гриппа A/H1N1/09, штамм. | Уровень гемагглютинина, ГА, ед., X±σх | Коэффициент ингибирования гемагглютинирующей активности вируса, X±σх, % |
| Ингавирин ® | 200 | A/California/07/09 | 13,3±2,7 | 58,3±8,3 |
| Арбидол ® | 25 | 16,0±0,0 | 50,0±0,0 | |
| Контроль без препарата | 32,0±0,0 | - | ||
| Ингавирин ® | 200 | A/California/04/09 | 2,7±0,7 | 66,7±8,3 |
| Арбидол ® | 25 | 4,0±0,0 | 50,0±0,0 | |
| Контроль без препарата | 8,0±0,0 | - |
Результаты изучения эффективности Ингавирина ® в отношении экспериментальной гриппозной инфекции A/H1N1/09 у белых мышей, интраназально инфицированных вирусом гриппа, штамм А/ California/07/2009, в дозе 1,1х10 3 ИД50 свидетельствуют о том, что препарат эффективно подавляет накопление вируса в лёгких животных (табл. 3) на 5 и 7 сутки после инфицирования (по уровню формирования специфического гемагглютинина). При применении Ингавирина ® по схеме профилактики в дозе 5 мг/кг препарат подавляет образование специфического гемагглютинина в лёгких инфицированных белых мышей на 5 сутки после заражения животных на 89,6%; на 7 сутки - на 83,4%. Уровень накопления гемагглютинина при этом составил 6,7 и 4,0 ед. соответственно. Препарат сравнения Арбидол ® менее эффективно, чем Ингавирин ® , ингибирует формирование специфического гемагглютинина в лёгких белых мышей на протяжении всего срока наблюдения после инфицирования. На 5 и 7 сутки после заражения животных Арбидол ® подавляет формирование специфического гемагглютинина вируса гриппа в органе-мишени при использовании его в качестве профилактического средства на 75,0 и 79,2%, уровень накопления гемагглютинина при этом составил 16,0 и 5,3 ед. соответственно. Уровень гемагглютинина вируса гриппа в лёгких инфицированных белых мышей, не получавших лекарственные препараты, составил на 5 сутки 64 ед., на 7 сутки - 26,7 ед. (см. табл. 3).
Таблица 3.
Подавление накопления вируса гриппа, штамм A/California/07/2009, в лёгких интраназально инфицированных белых мышей при профилактическом и лечебном применении препаратов
| Препарат | Схема введения | Доза препарата, | 5 сутки после заражения | 7 сутки после заражения | ||
| Уровень гемагглютинина, ГА, ед., X±σх | Коэффициент ингибирования формирования специфического гемагглютинина в легких, X±σх, процент | Уровень гемагглютинина, ГА, ед., X±σх | Коэффициент ингибирования формирования специфического гемагглютинина в легких, X±σх, процент | |||
| Ингавирин ® | Профилактическая | 5 | 6,7±1,3 | 89,6±2,1 | 4,0±0,0 | 83,4±4,2 |
| Арбидол ® | 30 | 16,0±0,0 | 75,0±0,0 | 5,3±1,3 | 79,2±4,1 | |
| Контроль без препарата | - | - | 64,0±0,0 | - | 26,7±5,3 | - |
| Ингавирин ® | Лечебная | 15 | 5,3±1,3 | 89,6±2,1 | 4,0±0,0 | 83,4±4,2 |
| Арбидол ® | 130 | 21,3±5,3 | 58,3±8,3 | 5,3±1,2 | 79,2±4,1 | |
| Контроль без препарата | - | - | 53,3±10,6 | - | 26,7±5,3 | - |
Таким образом, на 5 сутки после инфицирования изученные препараты, применяемые по профилактической схеме, достоверно эффективно (с вероятностью 0,95) подавляют формирование специфического гемагглютинина вируса гриппа А в лёгких интраназально инфицированных белых мышей, уровень накопления которого статистически достоверно ниже такового показателя в контрольной группе. При этом Ингавирин ® более эффективно подавляет формирование специфического гемагглютинина в лёгких белых мышей, чем Арбидол ® с уровнем значимости p≤0,05. На более поздних сроках наблюдения (7 сутки после инфицирования) только Ингавирин ® достоверно с вероятностью 95% эффективно подавляет формирование специфического гемагглютинина в лёгких, уровень накопления которого статистически достоверно отличается от такового показателя в контрольной группе. Уровень формирования гемагглютинина при использовании Арбидола ® значимо не отличается от контроля, т. е. достоверные отличия отсутствуют (см. табл. 3). При пероральном введении Ингавирина ® по лечебной схеме в дозе 15 мг/кг препарат подавляет образование специфического гемагглютинина на 5 сутки после заражения животных на 89,6%; на 7 сутки - на 83,4% (см. табл. 3). Уровень накопления гемагглютинина при этом составил 5,3 и 4,0 ед. соответственно. Препарат сравнения Арбидол ® при применении по лечебной схеме подавлял формирование специфического гемагглютинина на 5 сутки после заражения животных на 58,3%, на 7 сутки - на 79,2%. Уровень накопления гемагглютинина при этом составил 21,3 и 5,3 ед. соответственно. Уровень гемагглютинина вируса гриппа в лёгких инфицированных белых мышей, не получавших лекарственные препараты, составил на 5 сутки 53,3 ед., на 7 сутки - 26,7 ед. (табл. 3). Анализ полученных данных свидетельствует о том, что на 5 и 7 сутки после инфицирования Ингавирин ® , применяемый по лечебной схеме, достоверно эффективно (с вероятностью 95%) подавляет формирование специфического гемагглютинина в лёгких, уровень накопления которого статистически достоверно отличается от такового показателя в контрольной группе.
При изучении влияния Ингавирина ® на репродукцию вируса гриппа, штамм A/California/ 07/2009, в лёгких интраназально инфицированных белых мышей было установлено, что при применении по схеме профилактики препарат на 5 сутки после заражения снижает уровень накопления вируса на 3,0 lg, при этом коэффициент ингибирования составил 99,9%. На 7 сутки после заражения Ингавирин ® также высокоэффективно ингибировал накопление вируса в органе-мишени. Уровень снижения вируса в лёгких составил 2,8 lg, коэффициент ингибирования - 99,8% (табл. 4). Препарат сравнения Арбидол ® при применении по схеме профилактики снижал накопление вируса на 5 и 7 сутки после заражения на 1,9 и 1,4 lg, при этом коэффициент ингибирования составил 98,6 и 95,5% соответственно. Анализ полученных результатов выявил, что на 5 сутки после инфицирования оба препарата, применяемые по профилактической схеме, достоверно (с вероятностью 95%) эффективно подавляют накопление вируса в лёгких, уровень накопления которого статистически достоверно ниже такового показателя в контрольной группе. Вместе с тем эффективность Ингавирина ® по подавлению накопления вируса в лёгких белых мышей, выше эффективности Арбидола ® с уровнем значимости p≤0,05. На 7 сутки после инфицирования изученные препараты достоверно (с вероятностью 95%) эффективно подавляют накопление вируса в лёгких, уровень накопления которого статистически достоверно отличается от такового показателя в контрольной группе. Ингавирин ® более эффективно подавляет накопление вируса в лёгких белых мышей, чем Арбидол ® с уровнем значимости p≤0,05 (см. табл. 4).
Таблица 4.
Накопление вируса гриппа, штамм A/California/07/2009, в лёгких интраназально инфицированных белых мышей при профилактическом применении препаратов
| Препарат | Доза препарата, мг/кг | Изучение биопроб на. сутки после заражения | Уровень накопления вируса в легких, lgЭИД50/мл, X±σх | Снижение уровня накопления вируса, Δ, lg, X±σх | Коэффициент ингибирования накопления вируса, %, X±σх |
| Ингавирин ® | 5 | 5 | 3,6±0,1 | 3,0±0,1 | 99,9±0,0 |
| Арбидол ® | 30 | 4,8±0,1 | 1,9±0,1 | 98,6±0,2 | |
| Контроль без препарата | - | 6,6±0,1 | - | - | |
| Ингавирин ® | 5 | 7 | 3,6±0,1 | 2,8±0,1 | 99,8±0,1 |
| Арбидол ® | 30 | 5,0±0,2 | 1,4±0,2 | 95,5±2,8 | |
| Контроль без препарата | - | 6,4±0,1 | - | - |
При изучении влияния Ингавирина ® на накопление вируса гриппа, штамм A/California/ 07/2009, в лёгких интраназально инфицированных белых мышей при применении по лечебной схеме было установлено, что препарат снижает уровень накопления вируса на 5 сутки после заражения на 2,5 lg, при этом коэффициент ингибирования составил 99,6%. На 7 сутки после заражения уровень накопления вируса снизился на 2,1 lg, коэффициент ингибирования составил 99,1% (табл. 5). Препарат сравнения Арбидол ® подавляет размножение вируса гриппа A/H1N1/09 в лёгких в течение 5 суток после инфицирования животных, о чем свидетельствует уровень накопления вируса - 2,6 lg и коэффициент ингибирования - 99,8%. На 7 сутки после инфицирования снижение репродукции вируса в лёгких белых мышей на фоне приёма Арбидола ® составило всего 1,0 lg, коэффициент ингибирования - 90,4%. Сравнительный анализ результатов исследования эффективности препаратов в отношении вируса гриппа А/Н1N1/09 выявил, что на 5 сутки после инфицирования Ингавирин ® и Арбидол ® , применяемые по лечебной схеме, достоверно эффективно (с вероятностью 95%) подавляют накопление вируса в лёгких, уровень накопления которого статистически достоверно отличается от такового показателя в контрольной группе. На 7 сутки после инфицирования оба препарата достоверно эффективно (с вероятностью 95%) подавляют накопление вируса в лёгких, уровень накопления которого статистически достоверно меньше такового показателя в контрольной группе. При этом следует отметить, что Ингавирин ® более эффективен, чем Арбидол ® с уровнем значимости p≤0,05 (табл. 5).
Таблица 5.
Накопление вируса гриппа, штамм A/California/07/2009, в лёгких интраназально инфицированных белых мышей при лечебном применении препаратов
| Препарат | Доза препарата, мг/кг | Изучение биопроб на. сутки после заражения | Уровень накопления вируса в легких, lgЭИД50/мл,X±σх | Снижение уровня накопления вируса, Δ, lg, X±σх | Коэффициент ингибирования накопления вируса, %, X±σх |
| Ингавирин ® | 15 | 5 | 6,1±0,2 | 2,5±0,1 | 99,6±0,2 |
| Арбидол ® | 130 | 6,0±0,1 | 2,6±0,1 | 99,8±0,0 | |
| Контроль без препарата | - | 8,6±0,1 | - | - | |
| Ингавирин ® | 15 | 7 | 5,3±0,2 | 2,1±0,02 | 99,1±0,1 |
| Арбидол ® | 130 | 6,4±0,1 | 1,0±0,1 | 90,4±1,8 | |
| Контроль без препарата | - | 7,4±0,1 | - | - |
Таким образом, результаты изучения эффективности Ингавирина ® по подавлению репродукции вируса в лёгких белых мышей, интраназально инфицированных вирусом гриппа, штамм А/Калифорния/07/2009(НШ1), выявили, что препарат эффективно подавляет накопление возбудителя в органе-мишени на 5 и 7 сутки после инфицирования при использовании его как по схеме профилактики, так и по схеме лечения [5, 6, 8, 9, 13].
Задуманные и разработанные эксперименты: CE OP SL. Выполняли эксперименты: CE SED MH SU ERH EH RS. Проанализированы данные: CE SED ERH RS SL. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: JL. Написал документ: CE SL.
Инфекции вирусами гриппа A (IAV) по-прежнему относятся к числу основных причин сильно заразных тяжелых респираторных заболеваний, которые не только оказывают разрушительное воздействие на здоровье человека, но также оказывают значительное влияние на экономику. Помимо вакцинации, которая представляет собой лучший вариант защиты от инфекций IAV, были одобрены только два класса противогриппозных препаратов, ингибиторы ионного канала M2 и нейраминидазы, часто вызывающие резистентные варианты IAV. Именно поэтому потребность в эффективных и доступных антивирусных средствах против IAV имеет высокий приоритет. Здесь мы вводим LADANIA067 из листьев дикой черной смородины (Ribes nigrum folium) в качестве мощного соединения против инфекций IAV in vitro и in vivo. Обработка LADANIA067 привела к уменьшению титров вируса потомства в клеточных культурах, инфицированных штаммами вируса вируса птичьего гриппа и человека разных подтипов. При эффективной дозе 100 мкг / мл экстракт не оказывал явного вредного воздействия на жизнеспособность, метаболизм или пролиферацию клеток. Кроме того, вирусы не проявили тенденции к развитию резистентности к LADANIA067 по сравнению с амантадином, что привело к появлению устойчивых вариантов после нескольких проходов. На молекулярной основе защитный эффект LADANIA067, по-видимому, обусловлен главным образом вмешательством в интернализацию вируса. В мышиной инфекции модель LADANIA067 уменьшает титры вируса потомства в легком при интраназальном применении. В заключение, выдержка из листьев дикой черной смородины может стать многообещающим источником для разработки новых противовирусных соединений для борьбы с инфекциями IAV.
Вирусы гриппа A (IAV), члены семейства родов Orthomyxoviridae, характеризуются отрицательно ориентированным сегментированным одноцепочечным РНК-геномом. Хотя природный резервуар этих вирусов находится в дикой живой водоплавающей птице, IAV также заражает людей и несколько видов животных [1]. Как распространенная причина сильно заразных тяжелых респираторных заболеваний у людей IAV в основном поражают верхние дыхательные пути, такие как нос, горло и бронхи [1]. Инфекции характеризуются внезапным началом лихорадки, ангины, головной боли, сильного недомогания, мышечной боли и воспаления носа. Таким образом, IAV не только вызывает разрушительный эффект для здоровья человека, но также оказывает значительное влияние на экономику. Помимо сезонных вспышек, IAV несет потенциал для развития нового патогенного IAV. Постоянная и быстрая аварийная ситуация с новым высокопатогенным вирусом птичьего гриппа (HPAIV) типа H5N1, передаваемым от домашней птицы к человеку, и недавней вспышкой IAV пандемического гриппа H1N1v, к которой не были доступны вовремя никакие вакцины, подчеркивают настоятельную необходимость эффективные противовирусные препараты для борьбы с вирусами гриппа. Хотя вакцинация является наилучшим вариантом защиты от заражения IAV, трудоемкие процессы генерации ограничивают ее достаточную доступность. В настоящее время доступны два класса противовирусных препаратов, которые либо нацелены на белок M2 (амантадин, римантадин), либо нейраминидазу (NA) (озелтамивир, занамивир) IAV. К сожалению, эти соединения характеризуются быстрым развитием резистентности. Большинство вирусов H3N2 и человеческих изолятов вирусов H5N1 уже устойчивы к M2-блокаторам, и сообщалось о растущей частоте развития резистентности к NA-блокаторам [2], [3], [4], [5]. В то время как вирусы гриппа свиного происхождения (S-OIV) полностью устойчивы к адамантанам, интересно, что несколько S-OIV пандемии 2009 года также обладают естественной устойчивостью к NA-блокаторам [6], [7], что, таким образом, обладает потенциалом для множественной лекарственной устойчивости вирусы гриппа [8]. Из-за очевидной потребности в новых и достаточно доступных противовирусных агентах, которые не проявляют склонности вызывать токсические побочные эффекты или вызывать резистентные варианты вирусов, все большее внимание уделяется использованию экстрактов или соединений, полученных из растений. Хотя в различных исследованиях был продемонстрирован антивирусный потенциал соединений растительного происхождения в клеточной культуре, исследования, которые изучают их молекулярный способ действия или их активность in vivo, все еще недостаточны.
Что касается активных ингредиентов растительных экстрактов, для группы полифенолов был продемонстрирован значительный антивирусный потенциал [9]. Обладая более чем 8000 фенольными структурами, эти вещества широко распространены в растительном царстве. Однако имеются предельные знания об абсорбции, биораспределении и метаболизме полифенолов. Хотя небольшие полифенолы поглощаются клетками и проявляют антиокислительные функции, полимерные полифенолы только плохо усваиваются или метаболизируются. Многочисленные исследования указывают на противовирусную или антибактериальную функцию полифенольных веществ [9], а противовирусную активность против инфекции вируса гриппа продемонстрировали in vitro и in vivo
[10], [11].
Недавно CYSTUS052, полифенольное вещество, полученное из Cistus incanus spp. tauricus функционально охарактеризован в контексте инфекций вируса гриппа. CYSTUS052 непосредственно препятствует вирусным частицам и тем самым блокирует прикрепление вируса неспецифическим образом [10], [11]. В то же время клетки кажутся инертными против действия ингредиентов экстракта, по-видимому, из-за того, что активные соединения слишком велики, чтобы проникать в клетки и метаболизироваться. Кроме того, довольно неспецифический охват самих вирионов снижает риск появления новых устойчивых к вирусу вариантов вируса. Наконец, эффективность этого экстракта против респираторных инфекций уже была проверена в проспективном рандомизированном плацебо-контролируемом клиническом исследовании у пациентов [12].
Здесь мы сосредоточились на другом обогащенном полифенолом растении, Ribes nigrum folium, который обладает широкими целебными свойствами [9], [13], [14], [15], [16], [17]. В рамках настоящего исследования мы исследовали активность вируса гриппа LADANIA067, который представляет собой экстракт, полученный из листьев дикой формы Ribes nigrum (черная смородина). Завод выращивается, но также растет в дикой природе в Центральной и Восточной Европе. Это часть кустарникового слоя на уровне и в горах. Ribes nigrum folium богата фенольными кислотами, флавоноидами и каротиноидами [18]. Кроме того, Ribes nigrum folium также содержит большое количество проантоцианидинов, особенно продельфинидинов и аскорбиновой кислоты [19]. До сих пор были описаны антивирусные и антибактериальные свойства плодов Ribes nigrum, которые использовались в прошлом как сок против простуды. [15]. Показано, что выход антиоксидантов выше в листьях, чем в ягодах [18]. Наши результаты показали мощную противовирусную активность LADANIA067 против IAV in vitro и in vivo без токсических эффектов или склонности к индуцированию вирусной резистентности.
LADANIA067 Извлечение чисел заряда: # 10/17; 020709/069; 180510/158; 150211/281; 140113/523; 140113/524 и CYSTUS052 # 080110/095 были поставлены и первоначально разработаны Dr. Pandalis NatUrprodukte GmbH & Co. KG (Гландорф, Германия). Справочный экстракт CYSTUS052 представляет собой препарат Cistus incanus spp. tauricus, как описано в [10], [11]. LADANIA067 — это препарат из листьев дикой формы Ribes nigrum (черная смородина). LADANIA067 доставляли в растворе и растворяли в стерильной среде для культивирования клеток от 10 до 200 мкг / мл и добавляли непосредственно в среду или вирусную массу.
Вирус птичьего гриппа A / FPV / Братислава / 79 (FPV) (H7N7), рекомбинантный вирус гриппа человека A / Пуэрто-Рико / 8/34 (PR8) (H1N1rec) и вирус пандемического вируса гриппа свиного происхождения (S-OIV) A / Nordrhein -Wesfalen / 173/2009 (H1N1pan), укрывающий мутацию устойчивости осельтамивира NA (H275Y) [20], размножались и пассировались в клетках почки Madin Darby (MDCK). Прототипный изолят вируса гриппа человека A / Пуэрто Рико / 8/34 (PR8) (H1N1) выращивали в 10-дневных эмбриональных куриных яйцах. После инкубации при 37 ° С в течение 2 дней жидкость аллантоса собирали и использовали для заражения, как описано ниже [21].
Для инфицирующих клеток промывали в PBS, инкубировали с вирусом, разведенным в PBS / BA (PBS, содержащем 0,2% BSA, 1 мМ MgCl2, 0,9 мМ CaCl2, 100 ед / мл пенициллина и 0,1 мг / мл стрептомицина) в течение 30 мин при 37 ° C при указанных кратностях инфекции (МВД). Инокулум аспирировали и клетки инкубировали с MEM или DMEM, содержащим 0,2% BSA, 1 мМ MgCl2, 0,9 мМ CaCl2 и антибиотиками. В случае инфицирования H1N1, среда H1N1rec или H1N1pan была дополнена 2 мкг / мл трипсина. Клетки MDCK выращивали в MEM, а липидную линию клеток A549 эпителиальных клеток человека выращивали в DMEM соответственно. Все среды были дополнены 10% инактивированной теплом эмбриональной бычьей сывороткой (FBS). Для проапоптотической или провоспалительной стимуляции клеток Staurosporine (Sigma) (1 мкМ, 4 ч или 8 ч), TNF (Sigma) (5 нг / мл, 20 мин) или человеческих рекомбинантных EGF (R & D systems Minneapolis, USA ) (30 нг / мл, 5 мин) были непосредственно добавлены в среду.
Супернатанты, собранные в указанные моменты времени, использовали для оценки количества инфекционных частиц (титров бляшек) в образце. Вкратце, клетки MDCK, выращенные до 90% слияния в 6-луночных чашках, промывали PBS и заражали серийными разведениями супернатантов в PBS / BA в течение 30 мин при 37 ° C. Инокулум аспирировали и клетки инкубировали с MEM / BA (среда, содержащая 0,2% BSA и антибиотики), дополненную 0,6% агаром (Oxoid), 0,3% DEAE-декстраном (Pharmacia Biotech) и 1,5% NaHCO3 при 37 ° C, 5% CO2 в течение 2-3 дней. Вирусные бляшки визуализировались путем окрашивания нейтральным красным. Титра вируса представлены в виде единиц образования бляшек на мл (БОЕ / мл). Была оценена генерация устойчивых вариантов вируса к противовирусному лечению. Вкратце клетки A549 были инфицированы штаммом вируса гриппа A FPV (MOI = 0,001) и оставались необработанными или обработаны указанными количествами LADANIA067. Если не указано иное, клетки и вирусы предварительно инкубировали с LADANIA067 в течение 30 мин, а LADANIA067 дополнительно добавляли к среде во время инфекции. Для оценки развития резистентности были выделены супернатанты на 24 ч после инфицирования (p.i.) и использованы для второго раунда заражения. Эта процедура повторялась для нескольких последующих отрывков. В качестве эталонных антивирусных соединений клетки обрабатывали амантадином (Sigma) (5 мкМ), который, как известно, очень быстро индуцирует резистентность к ИАВ. Супернатанты анализировали на выход вируса потомства стандартными титрованиями бляшек. Выходы вирусов из обработанных ими клеток были произвольно заданы как 100%.
Анализ MTT [3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолиумбромид] основан на ферментативной реакции митохондриальной янтарной дегидрогеназы. В жизнеспособных и пролиферирующих клетках этот фермент расщепляет тетразолиевые кольца бледно-желтого МТТ, что приводит к образованию темно-синего формазана, который в значительной степени непроницаем для клеточных мембран и поэтому накапливается в здоровых клетках. Количество сформированного формазана можно измерить в колориметрическом анализе при OD 562 нм и прямо пропорционально количеству пролиферирующих клеток. Клетки A549 оставались необработанными или обрабатывались указанными количествами LADANIA067 в течение разных периодов времени. Затем клетки промывали PBS и инкубировали с МТТ (5 мг / мл) в течение 3 часов при 37 ° С. Реакцию блокировали ДМСО (Sigma) и клетки дополнительно инкубировали в течение 20 мин при 37 ° С. Цветную реакцию измеряли в прецизионном микропланшет-ридере Emax с длиной волны 562 нм. Необработанный контроль был произвольно установлен на 100%.
Концентративную активную плазмиду люциферазы CMV-промотора трансфицировали Lipofectamine 2000 (Invitrogen) в клетки A549 согласно протоколу Basler et al. [22]. Восемь часов после трансфекции клеток оставляли необработанными или обрабатывали указанными количествами LADANIA067 или 10 мкг / мл циклогексимида (BioTrend) в течение 18 часов. Затем клетки собирали 200 мкл буфера для лизиса [50 мМ Na-MES, pH 7,8, 50 мМ Трис-HCl, pH 7,8, 10 мМ дитиотреитола (DTT) и 2% Triton X-100]. Активность люциферазы измеряли и определяли как относительную активацию сгиба — SD из девяти образцов в качестве отношения активности люциферазы к контролю ДМСО.
Клетки A549 оставались необработанными или обрабатывались LADANIA067 количеств и для указанных времен. Клетки промывали PBS, трипсинизировали, снова промывали и ресуспендировали в PBS, содержащем иодид пропидия (PI), в концентрации 50 мкг / мл. После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре (RT) PI удаляли промывкой клеток с PBS и определяли флуоресценцию в FL2-канале (585 нм) с использованием цитометра FACScalibur (Becton Dickinson). В качестве положительного контроля клетки A549 обрабатывали Staurosporine (1 мкМ) и EDTA (5 мМ) в течение 4 часов и анализировали, как описано выше.
Для клеток Вестерн-блоттинга лизировали на льду с помощью буфера для лизиса RIPA (1% (об. / Об.) NP-40, 0,5% (об. / Об.) DOC, 1% (мас. / Об.) SDS, 150 мМ NaCl, 50 мМ Tris pH 8, 90% H2O, 200 мкМ пефоблок, 5 мкг / мл апротинина, 5 мкг / мл лейпептина, 1 мМ ванадата натрия, 5 мМ бензамидина) в течение 30 мин. Клеточные лизаты очищали центрифугированием, и результаты белка оценивали с использованием реагента с белковым красителем (Bio-Rad Laboratories). Равные количества белка разделяли электрофорезом в SDS-полиакриламидном геле и затем промокали на нитроцеллюлозных мембранах. Моноклональная антисыворотка против PARP была приобретена в BD Transduction Laboratories. Антисыворотка против белка вируса гриппа M1 была получена из ABSerotec. Антисыворотки против фосфоспецифического EGFR (Y1068), EGFR и фосфоспецифического ERK1 / 2 (pT202 / pY204, pT185 / pY187) были приобретены у Cell Signaling Technology. Антисыворотка против IκBα была приобретена у Santa Cruz Biotechnologies. Контроль загрузки выполнялся с помощью антисыворотки ERK2 (Santa Cruz Biotechnologies). Протеиновые полосы визуализировались в стандартной усиленной реакции хемилюминесценции.
Вирусы гриппа характеризуются их способностью к агглютинации эритроцитов. Эту гемагглютинирующую активность можно визуализировать при смешивании вирусных разведений с эритроцитами курицы в планшетах для микротитрования. Эритроциты курицы (Lensing-Baeumer, Ibbenbueren), дополненные 1,6% цитратом натрия (Sigma) в стерильной воде, разделяли центрифугированием (800 × g, 10 минут, комнатной температурой) и три раза промывали стерильным PBS (Invitrogen). Наименьшее количество вирусных частиц, способных агглютинировать эритроциты курицы, определяли в серийном вирусном разведении и использовали для исследования ингибирующего действия LADANIA067 по сравнению с CYSTUS052 на гемагглютинирующую активность. Необработанные эритроциты осаждаются на дно пластины, а при предварительной инкубации с вирусом клетки крови имеют четкое и диффузное распределение. Вкратце, LADANIA067 и CYSTUS052 последовательно разбавляли, как указано. Из содержимого вируса (H7N7, 1 × 109 pfu) было произведено 1/128 разведений и добавлено 50 мкл / лунку этого разведения вируса, как указано. После предварительной инкубации 45 мин в раствор смешивали куриные эритроциты (1/20 в PBS).
Клетки A549 оставляли необработанными или обрабатывали LADANIA067 (100 мкг / мл) в течение 1 часа при 37 ° C. Впоследствии биотинилированный Sambucus nigra agglutinin (SNA), приобретенный у Linaris (Wertheim, Germany), (1 мкг / мл), инкубировали в течение 1 часа при 4 ° C с клетками A549. SNA распознает α-2-6 галактозидазы, преимущественно присутствующие на поверхности клеток A549 и ответственные за связывание IAV видов человека. Затем клетки инкубировали с Cy3-конъюгированным стрептавидином для обнаружения лектинов и анализировали в флуоресцентной микроскопии. Флуоресценцию визуализировали с использованием микроскопа Axiovert 2000 ApoTome с цифровой камерой AxioCam и программным обеспечением AxioVision (Zeiss). Для мониторинга клеточной морфологии применялась световая микроскопия с использованием того же оборудования.
Все исследования на животных проводились в соответствии с правилами охраны животных (номер разрешения Az 8.87-50.10.36.09.007 Государственным агентством по охране природы, окружающей среды и защите прав потребителей [LANUV], Германия).
Восемь недельных мышей BALB / c получали из животноводческих комплексов Harlan-Winkelmann. Для заражения животных анестезировали внутрибрюшинной инъекцией 200 мкл раствора кетамина (Ceva) и ксилазина (Ceva, равное количество 2% раствора ксилазина и 10% раствора кетамина смешивали 1:10 с PBS). Мышей обрабатывали LADANIA067 с использованием системы нанесения аэрозолей для мышей COAALA (Activaero GmbH). Экстракт LADANIA067 растворяли в стерильной H2O и готовили исходные растворы 10 мг LADANIA067 / ml и 15 мг LADANIA067 / мл. Мышей BALB / c помещали в трубчатый цилиндр и подвергали воздействию 1,5 мл (на мышь), 2 бара аэрозольного экстракта LADANIA067 в течение 10 минут два раза в день для трех (титр легких) или пять дней (масса тела). Контрольную группу обрабатывали таким же количеством Н2О соответственно. Мыши инфицировали через десять минут после первого облучения через интраназальный путь штаммом вируса гриппа A / FPV / Bratislava / 79 (H7N7) (103 pfu) или рекомбинантным вирусом гриппа A / Пуэрто-Рико / 8/34 (H1N1rec) (4 × 102 pfu) в объеме 50 мкл для определения вирусной репликации в легких или A / FPV / Bratislava / 79 (H7N7) (5 × 102 БОЕ) для контроля массы тела. Общее состояние здоровья животных контролировалось два раза в день, а вес тела измеряли каждый день. Из-за защиты ограничений на здоровье животных мышей умерщвляли при потере массы тела на 20%. Для определения титра легочного вируса мышиные легкие собирали в 3 мл PBS в день 3 п.и. Образцы гомогенизировали с использованием гомогенизатора FastPrep24 (MP Biomedicals) с матрицей Lysing Matrix D (MP Biomedicals). Образцы центрифугировали при 10 000 об / мин в течение 10 мин при 4 ° С. Супернатанты брали и анализировали в стандартном анализе бляшек, как описано выше.
В первом эксперименте мы исследовали, оказывает ли LADANIA067 противовирусное действие против инфекции вируса гриппа A (IAV) в культивируемых клетках. Поэтому широко используемую альвеолярную клеточную линию A549 человека альвеолярного типа II инкубировали с LADANIA067 в различных концентрациях в течение 30 мин до инфицирования и во время продолжающегося процесса инфицирования. Кроме того, вирус предварительно инкубировали с LADANIA067 при различных концентрациях в течение 30 мин до заражения (фиг.1А-С). Для инфицирования мы использовали различные штаммы IAV, в том числе высокопатогенный вирус гриппа H7N7 вируса A / FPV / Bratislava / 79 (FPV) (фиг.1A), резистентный к озельтамивиру вариант вируса гриппа H1N1 свиного происхождения, штамм A / Nordrhein- Westfalen / 173/09 (H1N1pan) (фиг.1B) и изолята прототипа человека H1N1 A / Пуэрто-Рико / 8/34 (PR8) (H1N1) (фиг.1C). Для всех трех вирусов было зарегистрировано дозозависимое снижение титров вируса потомства при лечении LANDANIA067 в однотактных (8 ч) и многоцикловых (24 ч, 32 ч) экспериментах, указывающих на широкую противовирусную активность по отношению к различным штаммам IAV.
Читайте также: