Рекомбинантные белки вируса эбола

По данным Минздрава Демократической Республики Конго, на начало декабря этого года в стране зарегистрировано 3201 подтвержденных случаев заболевания лихорадкой Эбола, 2209 заболевших умерли.

Сергей Нетёсов, доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией биотехнологии и вирусологии факультета естественных наук Новосибирского государственного университета, член-корреспондент РАН

Африканский вирус оказался более актуальным, чем российские

Возбудитель лихорадки — вирус Эбола — впервые был обнаружен в 1976 году во время вспышки болезни в районе реки Эбола, протекающей между тогдашним Заиром (ныне Демократическая Республика Конго) и Суданом.

Если рассмотреть хронику создания вакцины против вируса Эбола и современное состояние дел в этой области в мире и в России, то становится понятным, как это поможет всем нам.

Вирус Эбола был впервые идентифицирован в 1976 году во время крупной вспышки вызванного им заболевания в Судане и тогдашнем Заире (теперь Демократическая Республика Конго; ДРК). Поскольку такие вспышки позднее случались не каждый год и их охват в несколько последующих лет был намного меньше, то ученые ограничились в те времена лишь разработкой иммуноферментных диагностикумов на ее маркеры.

Правда, основные фундаментальные исследования были проведены, в том числе секвенирование генома этого возбудителя, причем российские ученые здесь были одними из первых, включая вашего покорного слугу.

В 1990-е, а особенно в 2000-е годы масштаб и число вспышек заметно увеличились, и некоторые лаборатории в США и Канаде начали разработки и вакцинных препаратов, и средств лечения, а также диагностикумов нового типа на основе полимеразной цепной реакции. Однако для проведения полного цикла доклинических испытаний вакцинных препаратов необходимы весьма значительные средства, а с учетом особой опасности этой инфекции значительную часть таких работ необходимо проводить в лабораториях высшего, четвертого уровня биобезопасности. Ввиду этих причин полного цикла доклинических исследований перспективных, кандидатных, как говорят специалисты, вакцин против Эбола-вирусной инфекции до 2014 года так и не было завершено ни в одной из лабораторий мира.

По самым последним данным, природным резервуаром вируса Эбола вернее всего являются фруктоядные летучие мыши. Три вида таких мышей (Hypsignathus monstrosus, Epomops franqueti и Myonycteris torquata) могут быть носителями вируса без признаков заболевания. Из 24 видов растений и 19 видов позвоночных, экспериментально зараженных вирусом Эбола, удалось заразить только летучих мышей. Причем они не заболели, а просто несли в себе вирус в течение долгого времени. В обследовании в 2002–2003 годах 1030 животных, включая 679 летучих мышей из Габона и Республики Конго, только 13 фруктоядных мышей несли этот вирус. Кроме того, фрагменты вируса Эбола выделяли из тканей некоторых умерших западноафриканских равнинных горилл и центральноафриканских шимпанзе, которые иногда питаются фруктоядными летучими мышами. Что еще более важно, фрагменты РНК вируса Эбола были выявлены у клинически здоровых летучих мышей разных видов. Это означало, что летучие мыши могут быть носителями вируса без признаков заболевания, то есть хроническими носителями. А это и есть главное условие поддержания циркуляции вируса Эбола в природе.

Неожиданная по размаху, месту возникновения и продолжительности вспышка этого заболевания 2014 года в Гвинее, Сьерра-Леоне и Либерии сдвинула ситуацию с места. И уже в конце 2015 года несколько лабораторий и научно-исследовательских институтов в США, Канаде и некоторых других странах объявили о завершении доклинических испытаний нескольких кандидатных, вакцинных препаратов.

О создании прототипной вакцины объявили и у нас в России. Первыми были публикации группы ученых из НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи Министерства здравоохранения России о разработке живой вакцины на основе рекомбинантного аденовируса. Однако к этому времени и сама вспышка закончилась, так что испытывать эти вакцины в полевых условиях реальной эпидемии стало негде.

В том же 2018 году, и опять неожиданно, началась вспышка Эбола-вирусной инфекции в ДРК. Как оказалось, один из вакцинных препаратов, разработанный на основе рекомбинантного живого вируса везикулярного стоматита, прошел к этому времени ограниченные клинические испытания в США.

От человека к человеку вирус передается при попадании вируссодержащих жидкостей от больных людей или инфицированных животных на слизистые оболочки или на микротравмы на коже. У больных и умерших концентрация этого вируса в крови и на слизистых оболочках необычайно велика и достигает 10 млн вирусных частиц на 1 мл. Поэтому близкое общение с больным с большой вероятностью приводит к заражению. Наконец, уже выздоровевший человек может нести в себе вирус (в семени мужчин, в грудном молоке женщин) до одного года после выздоровления.

Фото: Артем Геодакян / ТАСС

Производит сейчас этот препарат под названием Ervebo всемирно известный фармгигант MSD (Merck, Sharp and Dohme). Вследствие этого Всемирная организация здравоохранения совместно с правительством ДРК приняли решение о начале клинических испытаний данной вакцины прямо в очаге инфекции.

В настоящее время выявлено пять таксономических видов вируса Эбола, которые отличаются друг от друга процентом летальности. Штаммы вида Заир, которые и циркулируют сейчас в Демократической Республике Конго, самые опасные — со смертностью до 80%.

К настоящему времени, по данным сайта promedmail.org, этой вакциной привито уже более 250 тыс. человек из числа контактных лиц. По имеющимся данным, ни один из вакцинированных не заболел. Однако вспышку пока остановить не удалось, поскольку она развивается в зоне военного межплеменного конфликта, и даже просто находиться там опасно: были случаи убийств местных и иностранных врачей, да и противодействие вакцинации части населения тоже имеет место.

Между тем американская же компания Johnson & Johnson довела до клинических испытаний другую, двухкомпонентную вакцину на основе рекомбинантных аденовируса и вируса осповакцины, производящих при инъекции в организм антигенно значимые белки вируса Эбола. И в середине ноября эта вакцина также была разрешена ВОЗ для проведения полевых испытаний в ДРК, которые в ноябре же и начались.

В России за последнее десятилетие не было ни одного больного эболавирусной инфекцией. В то же время за эти же годы у нас в стране были десятки тысяч больных другими, домашними вирусными инфекциями (ветряная оспа, ротавирус, респираторно-синцитиальный вирус, метапневмовирус, вирусы парагриппа и другие) и сотни умерших от них.

Может, пора вспомнить про эти патогены и начать, наконец, разработки и производство вакцин против них, гораздо более актуальных для России инфекций?

Вирионы вируса Эбола (Вирус Эбола) обычно имеют нитевидную форму, диаметр нитей составляет около 80 нм, и в их состав входят семь структурных белков. Средняя длина частиц вируса Эбола варьирует в пределах от 974 до 1086 нм. При этом их длина не зависит от размера вирусной геномной РНК. Показано, что вирусоподобные частицы, содержащие минигеном Вирус Эбола, имеющий длину всего 2 т.н.о., по морфологии неотличимы от частиц аутентичного Вирус Эбола.

Электронномикроскопические исследования показали, что вирусные частицы Вирус Эбола состоят из центральной структуры — нуклеокапсида или рибонуклеопротеидного (РНП) комплекса, состоящего из молекул белка NP, покрывающих геномную РНК и образующих вокруг нее спиралевидный слой, а также трех дополнительных минорных белков: VP35, VP30 и L. Нуклеокапсид окружен липидной оболочкой, происходящей из плазматической мембраны клетки-хозяина. На поверхности вирионов присутствуют глобулярные структуры в виде шипов, образованные трансмембранным гликопротеином GP Структурные белки VP24 и VP40, по всей видимости, локализуются на внутренней стороне мембраны.

Трансмембранный гликопротеин I типа GP располагается в виде тримсров на поверхности вирусных частиц. Длина белковой цепи гликопротеина Вирус Эбола составляет 676 а.о., а молекулярная масса мономера составляет 125 кДа. Центральный домен белка GP наиболее вариабелен и высоко гидрофилен. В его состав входит множество N- и О-связанных гликанон, которые составляют более половины молекулярной массы всего белка.

Поверхностный гликопротеин отличает от прочих структурных белков Вирус Эбола сложная стратегия синтеза и посттрансляционного созревания. мРНК полноразмерного GP синтезируется в результате транскрипционного редактирования, добавления РНК- зависимой РНК-полимеразой дополнительного остатка аденина во время синтеза последовательности, комплементарной полиуридиновому тракту (сайту редактирования), находящегося внутри гена GP. Это явление, вследствие которого происходит сдвиг рамки считывания в позицию -1, наблюдается приблизительно у 20% GP-специфических мРИК. 80% GP-специфических мРНК представлены нередактированными транскриптами, с которых синтезируется неструктурный секретируемый гликопротенн sGP.

Первичный продукт трансляции prcGP подвергается многоступенчатому процессингу в эндоплазматическом ретикулуме аппарате Гольджи, который включает в себя отщепление сигнального пептида, N-гликозилирование, олигомеризацию и О- гликозилирование, а также протеолитическое расщепление на большую N-концевую субъединицу GPi (33-501 а.о.) и малую С-концевую субъединицу GP2 (502-676 а.о.) в цистернах аппарата Гольджи субтилизин-подобной конвертазой фурином Сайтом узнавания фурина является короткая последовательность из положительно заряженных а.о (498-501 о.а.).

Таким образом, зрелый поверхностный гликопротеин Вирус Эбола состоит из двух различных по размеру и функциям субъединиц GPi и GP2 . GPi является рецептор- связывающей субъединицей, a GP2 содержит трансмембранный якорь и домен слияния, гомологичный доменам слияния гликопротеинов ретровирусов.

Значительный объем исследований гликопротеина Вирус Эбола посвящен изучению цитотоксического действия этого белка При экспрессии гена GP в составе гибридных плазмид под контролем промоторов, распознаваемых эукариотическими Р11К- полимеразами, в культурах различных клеточных линий, в том числе и первичных, а также эксплантатах артерий животных и человека, наблюдалось нарушение адгезии, отслаивание и округление клеток. Авторы одной из работ связывают данное явление со снижением уровня экспрессии на поверхности трансформированных гибридными плазмидами клеток и предполагают, что GP способен связывать в цитоплазме клетки, не позволяя им достигнуть ее мембраны. Детерминанты цитотоксичности были картированы в трансмембранном домене GP2 субъединицы и С-концевой области GPi, в участке, обогащенном остатками серина и треонина (муцин-подобном домене). Введение различных мутаций в муцип-подобный домен не приводило к снижению цитотоксического действия GP, однако полное удаление этого домена приводило к подавлению цитотоксичности гликопротеина, не оказывая при этом влияния на его структуру. Продемонстрирована способность GP, находящегося в составе ВПЧ, так же как и живого Вирус Эбола in vivo, индуцировать секрецию цитокинов (ФНО-а, ИЛ-6, ИЛ-1(3) и хемокина ИЛ-8 в культуре макрофагов человека. Для индукции, по-видимому, большое значение имеет стабилизированная четвертичная структура GP, связанного с мембраной, поскольку рекомбинантный GP в растворимой форме индуцирует макрофаги со значительно меньшей эффективностью.

Кроме того, известно, что частицы Вирус Эбола обладают и иммуносупрессивным свойствами. Так было показано, что интактные вирусные частицы вызывают ингибирование пролиферации лимфоцитов in vitro. Было выяснено, что супрессивными свойствами непосредственно обладает 469 а.о. GPi субъединица вирусного гликопротеина, а также рекомбинантный олигопептид длиной 40 а.о., соответствующий последовательности из N-концевого района GP.

Было показано, что GP является антигеном pi иммуногеном. В его структуре было выявлено несколько эпитопов: один из них (линейный) был картирован составе субъединицы GP2, ключевым аминокислотным остатком для связывания моноклональных антител с данным эпитопом являлся остаток His-549; второй (конформационпый) — в составе субъединицы GPi, состоял pi3 трех аминокислотных остатков: Arg-134, Phe-194 и Leu-199.

Структурный белок вириона 40 (VP40) является основным компонентом матрикса вирионов Вирус Эбола. Его размер составляет 326 а.о. Этот белок негомологичен ни одному Pi3 матриксных белков других представителей порядка Mononegavirales.

VP40 является мажорным компонентом вирионов Вирус Эбола и играет важнейшую роль на последних стадиях сборки вирионов. Свои функции он выполняет благодаря наличию в его составе нескольких функциональных мотивов .В первую очередь это вирусные L-домены (от английского late): РТАР, YXXL, N-концевые PPXY, а также консервативные СН-,-связывающие сайты.

В результате изучения кристаллической структуры VP40 в его составе были выявлены два структурных домена, имеющих идентичную глобулярную структуру, состоящую из (3-складок, соединенных коротким гибким линейным участком. Присущее белку VP40 Вирус Эбола преобладание (3-складчатых структур над а- спиральными нехарактерно для большинства вирусных матриксных белков. Как следует из биохимических и структурных исследований, в составе С-концевого домена содержится большое количество экспонированных на поверхность гидрофобных остатков, располагающихся в наиболее консервативных среди представителей семейства Filoviriade участках. Гидрофобные аминокислотные остатки обеспечивают взаимодействие VP40 с плазмолеммой. Помимо С-концевых гидрофобных аминокислот, N-концевой домен также может связываться с мембраной посредством содержащегося в нем тракта положительно заряженных аминокислот. Между двумя структурными доменами VP40 существует лишь одно спираль-спиральное взаимодействие и гидрофобная молния. Интересно, что С-концевая область белка лежит на междоменной поверхности. Эта поверхность имеет специфическую пространственную структуру и играет важную функциональную роль. Усечение VP40 с С-конца (в позиции 212) приводит к спонтанной гексамеризации белка, образованию кольцевой структуры и потере способности VP40 связываться с мембраной. Это позволяет предполагать, что С- концевой домен в жесткой мономерной структуре препятствует олигомеризации YT40,по-видимому, имеющей место в процессе сборки вириона. Данных о протеолитическом расщеплении VP40 в процессе вирусной инфекции нет, однако in vivo MOiyr происходить конформационные изменения белка, в результате которых олигомеризация становится возможной. В недавних исследованиях было показано, что гексамеризация может инициироваться изменением конформации междоменной поверхности при обработке мочевиной, отщеплении семи С-концевых аминокислотных остатков, лежащих на этой поверхности, либо при связывании полноразмерного VP40 с эндосомами in vitro.

VP40 играет ключевую роль в процессе сборки вирионов Вирус Эбола. Экспрессия полноразмерного гена VP40 в составе гибридных плазмид в культуре клеток приводит к выходу в культуральную жидкость ВПЧ, образуемых рекомбинантным белком. Необходимость наличия L-доменов для образования ВПЧ in vitro была продемонстрирована в нескольких работах. Введение мутаций в районы 11- доменов полностью выключает способность VP40 высвобождаться в виде ВПЧ из клеточных культур — продуцентов VP40. Одной из исследовательских групп была предложена модель сборки филовирусных частиц с участием VP40, состоящая из трех стадий. Согласно этой модели на первой стадии происходит взаимодействие VP40 с липидным бислоем, на второй — конформационные изменения VP40, приводящие к его гексамеризации, и на последней стадии, предположительно, происходит образование сетчатой структуры, состоящей из гексамеров VP40, соединенных С-концевыми доменами, на внутренней стороне клеточной мембраны, и взаимодействующих с цитоплазматическими или трансмембранными доменами молекул GP.

Благодаря наличию в структуре VP40 L-домеиов, VP40 взаимодействует с клеточными белками, такими, как убиквитин лигаза Nedd4 и TSG101, содержащим UEV-домен (от англ, ubiquitin enzyme variant).

Показано, что in vitro в результате взаимодействия VP40 с дрожжевым гомологом Nedd4 Rsp5p образуются конъюгированные с убиквитином формы VP40, однако их наличие в системе in vivo выявлено не было. Таким образом, функциональное значение присоединения молекул убиквитпна к белку VP40 не ясно.

Матрнксный белок VP40 играет ключевую роль в процессах сборки и почкования вирусных частиц. Кроме того, он осуществляет транспортировку вирусных компонентов из цитоплазмы к мембране клетки. Показано, что VP40 непосредственно взаимодействует in vitro и in vivo с тубулином, основным компонентом микротрубочек. В результате этого взаимодействия микротрубочки реорганизуются в пучки, устойчивые к действию деполимеризующих агентов. Эти явления наблюдаются не только при экспрессии VP40 в культуре клеток, но и при инфекции клеток вирусом Эбола. Делегирование 18 С-концевых аминокислотных остатков приводит к потере способности VP40 связываться с тубулином. Кроме того, VP40 имеет гомологию с клеточными белками, стабилизирующими микротрубочки, такими как МАР2 и Таи. В последовательности белка VP40 был обнаружен С-концевой домен, занимающий позиции 223-253 а.о., имеющий гомологию с тубулин-связывающими повторами МАР2 и Таи. В N-концевой части VP40 присутствуют обогащенные пролином мотивы, также обнаруженные и в тубулин-связывающих белках.

Структурный белок вириона 24 (VP24) длиной 251 а.о., также входит в состав матрикса вирионов Вирус Эбола, однако в меньших количествах, чем VP40. Хотя наименование связано с молекулярной массой белка, которая составляет 24 кДа, показаны различия в электрофоретической подвижности белков VP24 различных штаммов Вирус Эбола. В частности, снижение электрофоретической подвижности VP24 показано для высоковирулентного для морских свинок варианта Вирус Эбола SMC, полученного в результате проведения нескольких пассажей Вирус Эбола на этих животных.

Белок VP24 ассоциирован с мембраной зрелого вириона. В отличие от VP40 белок VP24 полностью не диссоциирует из РНП-комплекса в изотонических условиях. YP24 обогащен гидрофобными аминокислотными остатками, особенно высокое их содержание выявлено в районе, занимающем позиции 90-130 а.о. В N- концевом районе белка имеется единичный цистеиновый остаток в позиции 27. Кроме того, аминокислотная последовательность VP24 содержит три потенциальных сайта N- гликозирования (в позициях 84, 185 и 246 а.о.), однако данная посттрансляционная модификация для VP24 пока не выявлена. VP24 связывается с липидным бислоем, и, кроме того, обладает способностью к олигомеризации в физиологических условиях, образуя преимущественно тетрамерные формы с молекулярной массой 112 кДа. Способность к олигомеризации является общим свойством матриксных белков различных вирусов и, по всей видимости, важна для процесса сборки вирусных частиц. N-концевые аминокислотные остатки необходимы для теграмеризации VP24. Делетирование фрагментов различной длины с N-конца белка приводит к возрастанию тенденции к агрегации молекул VP24 и образованию олигомеров более высокого порядка.

Роль VP24 в жизненном цикле филовирусов на сегодняшний день остается наименее ясной, однако, эксперименты по селектированию штаммов с измененной вирулентностью, таких как адаптированный к морским свинкам вариант 8МС, указывают на критичность единичных аминокислотных замен в VP24 для изменения патогенных свойств Вирус Эбола.

Кроме того, в двух работах было показано участие VP24 в процессе сборки вирусных частиц. Huang с соавт. (2002) постулировали, что белок VP24, наряду с NP 32и VP35, необходим для сборки вирусных нуклеокапсидов. Поскольку сам белок VP24 при этом не входит в состав образующихся филаментозных структур, было сделано предположение, что он выполняет функцию катализатора взаимодействия между NP и VP35. Исследование, проведенное Licata с соавт. (2004), показало, что одновременная экспрессия VP40, способного самостоятельно образовывать почкующиеся ВПЧ, с NP и VP24 приводит к более эффективной продукции ВПЧ, по сравнению с экспрессией вирусных генов VP40+VP24 и VP40+NP. Авторы предположили, что VP24 опосредует взаимодействие NP с VP40 в процессе сборки вирионов. Интересно, что одно из последних исследований с применением методов обратной генетики подвергает сомнению критическую значимость VP24 для процесса сборки эболаподобных вирусных частиц. Так было показано, что при экспрессии структурных генов, минигеном способен формировать ВПЧ, морфологически идентичных нативным вирусным частицам. При этом VP24 не является необходимым компонентном не только сборки, но и почкования ВПЧ.

Нукдеопротеин (NP) кодируется геном, расположенным в 3’-концевой области геномной РНК. NP составляет основную массу белков вириона. Молекулярная масса белка NP, рассчитанная на основе его первичной последовательности (739 а.о.), составляет 83 кДа, что в значительной мере не соответствует электрофоретической подвижности этого белка (115 кДа). Различия этих характеристик объясняется наличием модификаций некоторых аминокислотных остатков в составе белка. Первоначально было выявлено несколько фосфорилированных аминокислотных остатков, что, тем не менее, не объясняло снижение электрофоретической подвижности NP. Затем было обнаружено, что NP также содержит О-связанные гликаны, в состав которых входят остатки N-ацетил-глгокозамина, N-ацетил-галактозамина, а также остатки сиаловой кислоты. Скорее всего, модификации NP важны для образования стабильного РНП- комплекса в процессе сборки вирусной частицы.

РНП-комлекс, образуемый вирусными белками NP, VP35, L и вирусной геномной РНК, является минимальной структурой, обеспечивающей репликацию вирусного генома. NP является основным структурным компонентом РНП- комплекса. Белок NP обладает свойством гомоолигомеризации Показано, что это свойство белка связано, прежде всего, с N-концевым (450 а.о.) и центральным районом белка NP. Кроме того, известно, что удаление 234 С-концевых аминокислот изменяет пространственную структуру образующихся нуклеокапсидов, Возможно, одной из причин изменений является то, что эта часть белка NP отвечает за его взаимодействие с другими компонентами нуклеокапенда. К примеру, уже показано, что 50 С-концевых а.о. отвечают за взаимодействие NP с белком VP40.

Белок NP является антигеном и иммуногеном. Было установлено, что антигенные детерминанты (линейные эпитопы) белка NP локализованы в 110-ти С-концевых а.о. С- терминального района.

Высокомолекулярный белок L (от англ, large) кодируется геном, расположенном в 5’-концевом районе линейного филовируоного генома. Белок L, входящий в состав Р.НП- комплекса вирионов Вирус Эбола, имеет длину 2212 а.о. и молекулярную массу около 267 кДа.

В результате компьютерного анализа была выявлена значительная гомология между белками L различных видов вирусов с негативным РНК-геномом. Существует целый ряд общих черт, характерных для белков L: высокое содержание остатков лейцина и изолейцина, большой суммарный положительный заряд, наличие нескольких кластеровосновных аминокислотных остатков, потенциальные центры связывания АТФ, два близко расположенных остатка цистеина в С-концевом районе белка, а также локализация генов, кодирующих эти белки.

- Сейчас в перечне кандидатных вакцин против COVID-19, который формирует Всемирная организация здравоохранения, числится 83 разработки, - сообщила пресс-служба Роспотребнадзора . Как отмечают в ведомстве, в этот список включено 9 вакцин, разработанных в России . То есть на отечественные разработки приходится более 10% перечня ВОЗ.

- Пептидная вакцина на платформе, использовавшейся ранее для создания вакцины против вируса Эбола

- Живая векторная вакцина на основе вируса кори

- Рекомбинантная интраназальная вакцина на основе вируса гриппа А

- Векторная вакцина на основе вируса везикулярного стоматита

Еще две вакцины — разработки компании БИОКАД:

- Инкапсулированная в липосомы мРНК

И еще одна вакцина разработана Санкт-Петербургским научно- исследовательским институтом вакцин и сывороток. В ее основе рекомбинантный белок, наночастицы (на основе S-белка и других эпитопов).

КОММЕНТАРИЙ ЭКСПЕРТА

Безопасная и эффективная вакцина может появиться в марте — апреле следующего года

- Среди российских разработок вакцин представлены препараты многих типов. Это хорошо, потому что означает: потенциально мы как страна претендуем на то, что можем работать практически со всеми известными технологиями разработки вакцин, - отмечает иммунолог, эксперт по исследованиям, разработке и регистрации лекарственных средств, кандидат медицинских наук Николай Крючков.

Иммунолог, эксперт по исследованиям, разработке и регистрации лекарственных средств, кандидат медицинских наук Николай Крючков. Фото: Личный архив

- Также плюсом можно назвать то, что нет монополии разработок, - продолжает эксперт. - В борьбе с коронавирусом участвуют разработчики вакцин и из нескольких государственных институтов, и ученые крупной биотехнологической компании.

Теперь о том, чего нельзя допустить, на что нужно обращать пристальное внимание. Очень важно, чтобы были проведены качественные клинические исследования. Многие страны, включая нашу, пошли на ускоренную, упрощенную процедуру доклинических испытаний (на клеточных культурах и на животных). И если это еще допустимо, то неоправданное ускорение исследований на людях может сыграть злую шутку. Во время таких испытаний определяется безопасность и иммуногенность вакцин (то есть их способность формировать иммунитет). Если не соблюсти необходимые процедуры исследований, то можно получить в лучшем случае неработающие вакцины. А в худшем случае — опасные для здоровья побочные эффекты.

- Какой срок нужен, чтобы убедиться, что разработанные вакцины действительно качественные и эффективные? На совещании у Владимира Путина академик Александр Гинцбург сообщил, что испытания одной из вакцин на людях начнутся уже в июне этого года.

- Если отталкиваться от этой даты, то расклад такой. В клинических исследованиях на людях — здоровых добровольцах — определяется сначала безопасность вакцины. На следующем этапе — ее иммуногенность (по сути — эффективность). Для этого должно быть проведено либо два отдельных исследования, либо одно многоэтапное. Как минимум это может занять в лучшем случае 5 — 6 месяцев. Затем идут процедуры регистрации вакцины. С учетом всех упрощений и сокращений на этом этапе может пройти около двух месяцев. Если параллельно разработчики уже начнут производить вакцину, то первых вакцинаций можно будет ожидать в марте — апреле следующего года.

Спаситель человечества в толстовке.Знаете, как выглядит главный разработчик российской вакцины против коронавируса? Скорее всего, не так, как вы себе его представляете

ПО ТЕМЕ

Уже отобраны 60 человек, которых привьют первыми: среди них — разработчик вакцины. Как за ними будут наблюдать и какие есть риски — в нашем материале (подробности)

Вирус Эбола вызывает смертоносную лихорадку

Лихорадка Эбола — это острая вирусная болезнь. Она поражает печень, желудочно-кишечный тракт и центральную нервную систему. Вероятность летального исхода при заражении достигает 90% [1]. Полагают, что вирус Эбола так опасен, в частности, потому что образует белок, который подавляет иммунную систему. Это мешает организму самостоятельно бороться с болезнью и дает возможность вирусу беспрепятственно размножаться [2]. Однако недавние успехи ученых говорят о том, что именно в иммунной системе человека заложено главное оружие против вируса. Первые косвенные данные о том, что организм человека способен и сам справиться с вирусом, появились уже давно. Дело в том, что часто спасительным для больных было переливание крови от уже победивших вирус людей. Такой метод впервые применили еще в 1995 году [3].

В 2014 году вновь произошла вспышка вируса Эбола. В Гвинее, где раньше такая болезнь не встречалась, появился и быстро распространился новый вариант вируса, несмотря на помощь международных медицинских организаций [4]. Вспышку вируса удалось приостановить только спустя 5 месяцев. К 31 августа 2014 года насчитывалось 3685 случаев заражения; из них 1841 — с летальным исходом [5]. Вирус широко распространился по таким странам, как Гвинея, Нигерия, Либерия и т.д. Полагают, что вспышка будет продолжаться еще, по крайней мере, несколько месяцев.

Вакцины, которая прошла бы клинические испытания, или другого лекарства против вируса Эбола на данный момент нет. Поэтому заразившихся людей лечат с помощью простого ухода за ними, а также их изолируют, чтобы предотвратить распространение болезни. Но все-таки без вакцины для больных можно сделать лишь немногое.

Попытки разработать вакцину ведутся уже давно. Были испробованы различные методы лечения. Однако большинство лекарств оказывались неэффективными, если их применяли не сразу, а спустя хотя бы сутки после заражения. Очень важным было найти средство, которое помогало бы после явного проявления симптомов и установления диагноза. Хорошее лекарство должно побеждать вирус даже спустя несколько дней его пребывания в организме. Недавно ученым удалось разработать средство, которое исцеляет макак резусов со 100% эффективностью, если его вводить животным в течение пяти дней после заражения [6]. Этим средством против вируса Эбола оказалась смесь различных моноклональных антител.

Принцип действия моноклональных антител

Что же это за лекарство? Моноклональные антитела [7] — это белковые молекулы, одна часть которых связывает вирус, а вторая привлекает к нему факторы иммунной системы (рис. 1). Самостоятельно организм вырабатывает антитела против вируса слишком долго. Во-первых, филовирусы, к которым относится вирус Эбола, обладают защитным гликопротеиновым слоем (рис. 2), а во-вторых, они кодируют белок, который, предположительно, подавляет иммунитет [2]. А если вводить уже готовые антитела против вируса Эбола, то иммунитет срабатывает практически мгновенно. В борьбу с болезнью вступают клетки крови — так называемые естественные киллеры. Также активируется система комплемента [8]. Вместе с антителами больному вводят еще одно вещество — адъювант. В состав адъюванта входят инактивированные частицы другого вируса. Он еще больше возбуждает иммунную систему, заставляя ее работать активней.

Рисунок 1. Моноклональные антитела направляют клетки иммунной системы на свою мишень

Рисунок 2. Вирус Эбола и близкий ему вирус Марбург являются представителями семейства филовирусов (Filoviridae), возбудителей острой геморрагической лихорадки у человека — заболевания, приводящего к смерти пациентов с частотой до 90%, в зависимости от конкретного штамма вируса. Эбола заражает преимущественно клетки эндотелия сосудов, а также некоторые клетки иммунной системы и печени. Среди симптомов заболевания — жар, головная боль, кровоточение слизистых, боль в мышцах, кашель, обезвоживание.

Коктейль антител против вируса Эбола назвали ZMapp. Он прошел доклинические испытания, результаты которых оказались оптимистичны. Зараженные приматы выздоравливали. Важно, что когда животным вводили антитела, симптомы у них проявлялись уже ярко: лекарство оказывало действие при приеме спустя 72 часа после заражения. Значит, применение ZMapp оставляет достаточно времени для диагностики.

Скажем спасибо обезьянам

Доклинические испытания проводили на макаках. И это вселяет надежду, что и для человека испытанное лекарство также подойдет. Макаки резусы эволюционно довольно близки к людям, как и приматы в целом, по сравнению с другими млекопитающими. Это подтверждается и по сходству многих белков: например, α-цепи гемоглобина у нас и у макак резусов отличаются всего тремя аминокислотами, в то время как у нас и у мыши — уже четырнадцатью [9]. Макаки резусы широко распространены, хорошо адаптируются к людям, городам и вивариям, что делает их удобным объектом изучения. На них проводят медицинские и нейробиологические исследования (в частности, изучают влияние марихуаны на иммунную систему), и даже их геном расшифровали первым [10]. Словом, исследований проведено множество, и уже не новость, что реакцию макак резусов на лекарство принимают, как близкую к человеческой.

Так, с помощью обезьян было получено лекарство, которое увеличивает вероятность выздоровления приматов при заражении вирусом Эбола до 100%. Однако стоит отметить, что в ходе тестирования препарата выявили, что у одного из животных на третий день после инфицирования вирусов в крови было в 100 раз больше, чем у других. Для этой особи обычной дозы антител оказалось недостаточно для выздоровления. Такой случай говорит о том, что течение и развитие болезни зависит от индивидуальных свойств каждого организма.

Дальнейшие перспективы использования моноклональных антител

Тем не менее, моноклональные антитела несут в себе большой потенциал для медицины. Их даже рассматривают как возможное средство защиты от биологического оружия. А успешное применение антител против вируса Эбола у приматов позволяет надеяться, что вскоре удастся спасти и жизни множества людей. С помощью ZMapp уже излечились от лихорадки Нэнси Райтбол и Кент Брэнтли (рис. 3).

Рисунок 3. Американцы Нэнси Райтбол и Кент Брэнтли испытали на себе действие ZMapp — нового лекарства против вируса Эбола

Читайте также: