Ртга для определения типа вируса
Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций подразделяются на несколько больших групп.
- Прямые методы, состоящие в выявлении непосредственно в биологическом материале самого вируса или антител к нему.
- Непрямые методы-заключаются в искусственной наработке вируса в значительных количествах, и его дальнейшем анализе.
К наиболее актуальным в повседневной практике методам диагностики относятся:
Серологические методы диагностики - выявление в сыворотке крови пациента определенных антител или антигенов в результате реакции антиген-антитело(АГ-АТ). То есть, при поиске у пациента определенного антигена используется соответствующее искусственно синтезированное антитело, и, соответственно, наоборот-при выявлении антител используют синтезированные антигены.
Реакция иммунофлуоресценции (РИФ)
Основана на использовании меченых красителями антител. При наличии вирусного антигена он связывается с мечеными антителами, и под микроскопом наблюдается специфическая окраска, которая говорит о положительном результате. При этом методе, к сожалению, невозможна количественная интерпретация результата, а только лишь качественная.
Возможность количественного определения дает иммуноферментный анализ(ИФА). Он похож на РИФ, однако в качестве маркеров используют не красители, а ферменты, превращающие бесцветные субстраты в окрашенные продукты, что и дает возможность количественной оценки содержания как антигенов, так и антител.
- Отмывают не связавшиеся антитела и антигены.
- Добавляют бесцветный субстрат, и в лунках с антигеном, который мы определяем, произойдет окрашивание, т.к. там будет связанный с антигеном фермент, после чего на специальном приборе оценивают интенсивность свечения окрашенного продукта.
По похожей схеме происходит и выявление антител.
Реакция непрямой(пассивной) гемаглютинации (РПГА).
Метод основан на способности вирусов связывать эритроциты. В норме эритроциты падают на дно планшета, образуя так называемую пуговку. Однако если в исследуемом биологическом материале находится вирус, он свяжет эритроциты в так называемый зонтик, который не упадет на дно лунки.
Теперь остановимся на методах диагностики непосредственно нуклеиновых кислот исследуемых вирусов, и прежде всего о ПЦР ( Полимеразная Цепная Реакция) .
Суть этого метода заключается в обнаружении специфического фрагмента ДНК или РНК вируса путём его многократного копирования в искусственных условиях. ПЦР можно проводить только с ДНК, то есть для РНК-вирусов предварительно необходимо произвести реакцию обратной транскрипции.
Непосредственно ПЦР проводят в специальном приборе, под названием амплификатор, или термоциклер, который поддерживает необходимый температурный режим. ПЦР-смесь состоит из добавленной ДНК, которая содержит интересующий нас фрагмент, праймеров (короткий фрагмент нуклеиновой кислоты, комплиментарный ДНК-мишени, служит затравкой для синтеза комплиментарной цепи), ДНК-полимеразы и нуклеотидов.
Стадии цикла ПЦР:
- Деннатурация-первая стадия. Температура повышается до 95 градусов, цепочки ДНК расходятся друг относительно друга.
- Отжиг праймеров. Температуру понижают до 50-60 градусов. Праймеры находят комплиментарный участок цепи и связываются с ним.
- Синтез. Температуру вновь повышают до 72, это рабочая температура для ДНК-полимеразы, которая, отталкиваясь от праймеров, строит дочерние цепи.
Цикл многократно повторяется. Через 40 циклов из одной молекулы ДНК получается 10*12 степени копий копий искомого фрагмента.
При проведении ПЦР в режиме реального времени синтезируемые копии фрагмента ДНК метятся красителем. Прибор регистрирует интенсивность свечения и по ходу реакции строит графики накопления искомого фрагмента.
Современные методы лабораторной диагностики с высокой достоверностью позволяют выявить присутствие вируса - возбудителя в организме, нередко, задолго до появления первых симптомов заболевания.
РТГА относится к реакциям нейтрализации in vitro.
Механизм. У некоторых вирусов (например, вируса гриппа) есть гемагглютинин, вызывающий агглютинацию эритроцитов различных животных в зависимости от вида вируса. При наличии в сыворотке антител – антигемагглютининов наблюдается ингибированные гемагглютинирующей активности вирусов (рис.32).
1) исследуемый материал – аллантоисная жидкость куриного эмбриона;
2) диагностические противогриппозные сыворотки с антителами против серотипов вируса гриппа А: А(Н1N1), А(Н2N2), А(Н3N2 и др.;
3) 3,5% взвесь куриных эритроцитов – индикатор реакции;
4) физиологический раствор.
Реакция ставится на стекле капельным способом. На стекло наносят по 1 капле диагностических сывороток и исследуемого материала, перемешивают, затем добавляют 1 каплю взвеси эритроцитов. При положительной реакции наблюдается гомогенное покраснение, а при отрицательной – выпадение хлопьев красного цвета (гемагглютинация).
9.8 Реакции связывания комплемена: РСК Борде-Жангу, РСК,
Вассермана, РИБТ – реакции иммобилизации бледной трепонемы
Специфические АТ, обуславливающие лизис (растворение) клеток, носят название лизинов. Эти АТ применительно к бактериям называются бактериолизинами, к эритроцитам – гемолизинами и т.д.
Лизины способны проявить свое лизирующее действие на АГ только в присутствии комплемента, который является составной частью любой свежей сыворотки.
Таким образом, в основе реакции лизиса (РСК) лежит взаимодействие трех компонентов:
1) АГ (бактериальных клеток, эритроцитов, вирусов и др.);
2) специфических АТ иммунной сыворотки (бактериолизинов, гемолизинов и др.);
3) комплемента (сыворотка морской свинки).
В начале реакция идет по типу агглютинации, затем к комплексу АГ-АТ через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент. Наступает активация компонентов комплемента, которая приводит к потери подвижности бактерий (р. иммобилизации трепонем - при сифилисе), изменению формы (набухают), и, наконец, совсем растворяются (р. агглютинации-лизиса при лептоспирозе, р. лизиса - при возвратном тифе).
РСК отличается высокой чувствительностью и специфичностью и применяется для:
1) серологической диагностики (определения противомикробных антител) инфекционных заболеваний (р. Вассермана, Борде-Жангу и др.)
2) идентификации бактерии и др. микробов. Например, реакция бактериолизиса (РСК) применяется при холере с целью идентификации вибрионов.
РСК относится к сложным серологическим реакциям, в которых участвуют, кроме АГ и АТ, ещё гемолитическая система (р. гемолиза), выявляющая результат реакции.
РСК проводится в два этапа при участии двух систем:
первая система (тестовая) – инкубация смеси, содержащей АГ-АТ-комплемент;
вторая система (индикаторная) – гемолитическая сыворотка (гемолизины) + эритроциты – показывает исход реакции в первой системе: в случае положительного результата реакции в первой системе (образования комплекса АГ+АТ+комплемент), во второй системе не произойдет гемолиза ввиду отсутствия комплемента (эритроциты оседают на дно пробирки). В случае отрицательного результата в первой системе вторая сопровождается гемолизом, т. к. образуется комплекс эритроциты + гемолизины + комплемент (рис.33).
Для постановкиРСК Борде-Жангу,которая применяется с цельюопределения антител к гонококку (N. gonorrhoeae) при хронической гонореи требуются следующие компоненты:
1.Компоненты тестовой системы:
1) испытуемая сыворотка неизвестными противогонококковыми антителами (предварительно инактивируют нагреванием при 56°С в течение 30 минут);
2) гонококковый диагностикум– взвесь убитых N. gonorrhoeae; ;
2.Индикаторная (гемолитическая) система:
1) 3% взвесь эритроцитов барана (корпускулярный антиген-агглютиноген);
2) гемолитическая сыворотка;
В качестве комплемента в РСК применяют свежую и высушенную сыворотку морской свинки, т. к. в крови морской свинки комплемент содержится в наибольшем количестве и присутствует постоянно, чем у др. животных. Перед постановкой РСК следует проводить титрование комплемента в реакции гемолиза (эритроциты барана, гемолитическая сыворотка, комплемент, физ. раствор) и определение рабочей дозы.
Титр комплемента – наибольшее разведение комплемента которое вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии гемолитической сыворотки.
Рабочая доза комплемента – количество комплемента, которое выше титра на 25%.
Гемолитическая сыворотка готовится путём иммунизации кроликов 50% взвесью эритроцитов барана. Полученную сыворотку инактивируют нагреванием при 56°С, определяют титр и рабочую дозу.
Титр сыворотки – максимальное разведение сыворотки, которое вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии комплемента. В качестве рабочей дозы берут гемолитическую сыворотку в тройном титре.
РСК Вассерманаставится для диагностики сифилиса с целью обнаружения противотрепанемных антител в сыворотке крови, а также для определения эффективности специфической терапии. Она основана на принципе реакции связывания комплемента Борде-Жангу. Существенным отличием реакции Вассермана является применение двух диагностикумов - перекрестнореагирующих антигенов № 1 и № 2:
- диагностикум № 1 – специфический, трепонемный (взвесь убитых Tr. рallidum);
- диагностикум №2 – неспецифический, кардиолипиновый антиген (собой высокоочищенный экстракт бычьего сердца).
Одновременно с основным опытом ставят 2 контроля: с заведомо отрицательной и заведомо положительной сыворотками.
Первый период сифилиса является серонегативным и характеризуется отрицательной реакцией Вассермана. У 50% больных реакция становится положительной не ранее чем через 2-3 недели после появления твердого шанкра. Во втором и третьем периодах сифилиса частота положительных реакций достигает 75-90%. После проведенного курса лечения реакция Вассермана становится отрицательной.
Реакция может быть ложноположительной при ряде заболеваний и состояний: беременность, онкопроцессы, туберкулез, после приема жирной пищи и алкоголя и др.
Для диагностики поздних и латентных форм сифилиса можно ставить реакцию Вассермана, используя спинномозговую жидкость с теми же антигенами, что и в реакции с сывороткой больного.
РИБТ – реакции иммобилизации бледной трепонемыприменяется для серологичекой диагностики сифилиса, то есть определения противотрепанемных антител в сыворотке кров. РИБТ позволяет дифференцировать биологически ложноположительные результаты реакции Вассермана и осадочных реакций от истинных, что делает ее незаменимой при распознавании скрытого сифилиса, диагноз которого может быть поставлен часто лишь на основании серологических исследований.
· испытуемая сыворотка с противотрепанемными антителами (иммобилизины);
· антиген - взвесь бледных трепонем, полученный из яичка кролика зараженного сифилитическим орхитом;
· комплимент – сыворотка морских свинок в рабочей дозе;
| | | следующая лекция ==> | |
| Развернутые реакции агглютинации Видаля, Вейгля и Райта | | | Иммуноферментный анализ (ИФА) |
Дата добавления: 2019-04-03 ; просмотров: 886 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ
|
