Серологическая диагностика гриппа а

Цель: определение а/т к вирусу гриппа в сыворотке крови и их нарастание в парных сыворотках.

Компоненты: сыворотка крови, антиген вируса гриппа (гемагглютинин) и эритроциты.

Ход: РТГА это вариант РН, основана на нейтрализации гемагглютинирующих свойств вирусов специфическими а/т находящимися в сыворотки больного, что проявляется отсутствием агглютинации эритроцитов с формированием на дне лунки компактного осадка (точечка, а не зонтик). Сыворотки крови обрабатывают периодатом калия для устранения неспецифических ингибиторов агглютинации, затем к разным разведениям сыворотки добавляют равное кол-во известных вирусных частиц (антигенов) и инкубируют. После чего добавляют, равны объем 1,0% взвеси эритроцитов, инкубируют и читают результат. Диагностическим титром считают наибольшее разведение, в котором тормозится гемагглютинация.

Выявление вируса гепатита А при иммунной электронной микроскопии:

Цель: выявление обнаружение вируса в материале и идентификация:

Компоненты: материал от больного, противовирусной сыворотки, контрастирующее вещество.

Ход: материал содержащий вирусов обрабатывают противовирусной сывороткой содержащей антилела к HAVAg, затем добавляют фосфорно-вольфрамовую кислоту для контрастирования. Смесь наносят на пленку и высушивают. Затем микроскопируют в электронном микроскопе и находят скопление вирусных частиц.

Экспресс-Ds-ка ротавирусной инфекции в реакции гемадсорбции на твердой основе (РГагТО):

Цель: определение антигенов ротавируса вируса в материале.

Компоненты: противоротавирусная сыворотка (а/т), материал от больного с вирусом и его а/г, сенсибилизированные иммуноглобулином эритроциты.

Ход: лунки полистироловых планшетов обрабатывают противоротавирусной сывороткой, затем вносят в них исследуемый вируссодержащий материал и через 30-60 минут лунки промывают буферным раствором, после чего добавляют взвесь сенсибилизированных специфическим иммуноглобулином эритроцитов и через 30-60 минут читают результат. Если в материале был вирусный антиген, он соединяется с антителами сыворотки адсорбированными на поверхности лунки, а затем с иммуноглобулином на поверхности эпитроцитов и происходит гемагглютинация.

Выявление антигенных маркеров вируса бешенства при помощи РИФ:

Цель: выявление а/г вируса бешенства.

Компоненты: культура клеток инфицированная материалом от больного (с а/г), антирабического иммуноглобулина или моноклинальных антител, меченных флюорохромом (флюорисцином).

Ход: культуру клеток обрабатывают меченым иммуноглобулином и микроскопируют. При наличии вируса в клетке а/т адсорбируются на клетке и наблюдается ее свечение.

Идентификация вируса гриппа в аллантоисной жидкости РКЭ в РТГА:

Цель: идентификация вируса гриппа по известным антителам.

Компоненты: аллантоисная жидкость инфицированного вирусом РКЭ, противогриппозные диагностические сыворотки типа А, В, С и эритроциты кур.

Ход: Р-я основана на нейтрализации гемагглютинирующей активности вируса различных типов вируса гриппа А, В, С соответствующими сыворотками. Смесь соответствующей сыворотки и аллантоисной жидкости смешивают с эритроцитарный взвесью. Отсутствие гемагглютинации с одной из сывороток, указывает на тип вируса.

Идентификация вируса гриппа в аллантоисной жидкости РКЭ в РГА:

Цель: определение вируса или его а/г в материале.

Компоненты: Аллантоисную жидкость РКЭ инфицированного материалом от больного, эритроциты кур.

Ход: Аллантоисную жидкость титруя разводят от 1:10 до 1:52 и вносят по 0,5 мл в лунки планшета, и добавляют по 0,5 мл 1% взвеси эритроцитов кур, инкубируют 40 минут и читают результат. Гемагглютинация говорит о наличии вируса в аллантоисной жидкости.

Серологическая диагностика кори при помощи РНГА:

Цель: выявление а/т к вирусу кори в сыворотки крови и нарастание их титра.

Компоненты: сыворотка крови больного, эритроцитарный коревой диагностикам.

Ход: Основана на способности эритроцитов с адсорбированными на их поверхности а/г к вирусу кори взаимодействовать с а/т в сыворотке крови и образовании на дне луки в виде фестончатого осадка (зонтик с неровными краями).

Серологический метод диагностики клещевого энцефалита при помощи РСК:

Цель: определение а/т в сыворотки крови и нарастание их титра.

Компоненты: парные сыворотки крови больного, а/г клещевого энцефалита для РСК, гемолитическая сыворотка и эритроциты барана.

Ход: 1 фага – антитела в сывороточных разведениях взаимодействуют с а/г диагностикума, в результате чего происходит связывание комплимента. 2 фаза – индикаторная – определение в смеси наличия свободного комплемента путем добавления гемолитической системы (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка), если комплимент свободен, то происходит гемолиз эритроцитов (РСК отрицательная), а если комплимент связан, то гемолиз не наступает (РСК положительная).

Определение антител к вирусу ВИЧ при помощи ИФА:

Цель: определение а/т в ВИЧ.

Компоненты: антигены ВИЧ, сыворотка крови больного, антиглобулиновую человеческую сыворотку меченую ферментом пероксидазой хрена субстрат для фермента.

Ход: сыворотку крови добавляют в лунки планшета с адсорбированными а/г ВИЧ и инкубируют. Затем лунки отмывают и добавляют антиглобулиновую сыворотку меченую ферментом., затем снова отмывают и добавляют субстрат для фермента с индикатором. Если в сыворотке а/т нет, то адсорбция последующих компонентов реакции и разложение субстрата не наблюдается.

Определение маркеров вируса гепатита В при помощи ИФА:

Цель: выявление а/г HBsAg в сыворотки крови больного.

Компоненты: сыворотка крови, антитела к HBsAg.

Цель: выявление а/т в ВИЧ.

Ход: на полоски наносят сыворотку крови и инкубируют, затем отмывают и наносят меченую антиглобулиновую сыворотку. Образовавшийся комплекс а/г-а/т-анти-а/т выявляют добавлением субстрата, изменяющего окраску при действии фермента.

Известно более 200 разновидностей вирусов, избирательно поражающих респираторный тракт человека (возбудителей ОРВИ).

У большинства возбудителей ОРВИ первичное размножение вирусов происходит в слизистой оболочке дыхательной системы, поэтому клиническая картина сходная, заболевание протекает в виде ринита, ринофарингита, как правило, в легкой форме. У детей раннего возраста вирусы могут поражать нижние отделы респираторного тракта, и болезнь протекает в более тяжелой форме в виде бронхитов, бронхиолитов, пневмоний. Наиболее тяжело протекающей острой вирусной респираторной инфекцией является грипп, который часто принимает эпидемическое распространение, характеризуется явлениями общей интоксикации, лихорадкой, поражением дыхательного тракта, нервной и сердечно-сосудистой систем. Максимальное число тяжелых форм течения инфекции наблюдается в период пандемий, обусловленных новым вариантом вируса гриппа.

Лаборатория оуществляет диагностику с помощью экспресс-методов, вирусологических и серологических методов исследования. Быстрая (экспресс) диагностика гриппа и ОРВИ:

1)метод флюоресцирующих антител (МФА) - основан на выявлении вирусных антигенов в клетках эпителия носовых ходов, конъюнктивы (при явлениях конъюнктивита). Исследуемый материал: мазки из носа, конъюнктивы, взятые в первые 3 дня и не позднее 5 дня болезни. Определяемые возбудители: - вирусы сезонного гриппа типа А (H1N1) - вирусы сезонного гриппа типа А (H3N2) - вирусы гриппа типа В - вирусы парагриппа 1, 2, 3 типов - аденовирусы - респираторно-синцитиальный вирус;

2) метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)- основан на обнаружении в клинических пробах генетического материала вирусов (РНК или ДНК)- является наиболее современным, высокочувствительным методом.

Исследуемый материал: мазки из носа и зева, взятые в первые 3 дня и не позднее 5 дня болезни, секционный материал. Определяемые возбудители:

- вирусы пандемического высокопатогенного гриппа типа А (H1N1)

- вирусы гриппа типа А

- вирусы гриппа типа В - вирусы парагриппа 1, 2, 3,4 типов

- аденовирусы - респираторно-синцитиальный вирус;

Вирусологическая диагностика - выделение вируса на чувствительной клеточной культуре с последующей идентификацией в реакции нейтрализации или ПЦР.

Этот метод отличается трудоемкостью и длительностью и используется, главным образом, для эпидемиологических и научных целей (изучается изменчивость вирусов, что помогает прогнозировать эпидемические подъемы гриппа, отбираются актуальные штаммы, пригодные для изготовления вакцин) Исследуемый материал: мазки из носа и зева (в первые 3 дня и не позднее 5 дня болезни).

- вирусы гриппа типа А (разные серотипы)

- вирусы гриппа типа В Серологическая диагностика является ретроспективной. Она выявляет прирост титров антител к возбудителям заболевания в парных сыворотках крови, что позволяет установить точную этиологию даже при отрицательных результатах других методов лабораторной диагностики, а также при бессимптомном или атипичном течении гриппа, широко применяется и для эпидемиологических целей. Исследуемый материал: сыворотки крови, взятые в начале заболевания и через 10- 14 дней.

Возбудители к которым определяется прирост титров антител:

- вирусы сезонного гриппа типа А (H1N1)

- вирусы сезонного гриппа типа А (H3N2) - вирусы гриппа типа В

- вирусы парагриппа 1, 2, 3 типов

В период подьема заболевамости гриппом и ОРВИ (в октябре- декабре 2009г.) вирусологической лабораторией обследовано методом флюоресцирующих антител (МФА) 432 человека. У 27% заболевших был выявлен аденовирус, у 8,3% - вирус парагриппа 3 типа, у 8% - респираторно-синцитиальный вирус, у 2% - вирусы парагриппа 1, 2 типов, у 0,2% - вирус сезонного гриппа типа А (H1N1).

При обследовании методом ПЦР 565 больных с подозрением на высокопатогенный грипп типа А (H1N1) РНК вируса обнаружена у 213 человек (в 38% проб). По даннным серологического обследования 67 больных ( в октябре и ноябре) заболевания гриппозной этиологии составили 4,3 % (грипп А(H1N1) сезонный - 2 человека), парагрипп 3 типа — 4,5% ( 3 человека), парагрипп 2 типа — 1,5% ( 1человек).

В настоящее время широко применяются серологические реакции (СР), в которых участвуют меченые АГ или АТ. К ним относятся реакция иммунофлюоресценции, радиоиммунный и иммуноферментный методы, реакция иммуноблотинга, проточная цитометрия и электронная микроскопия.

1) для серодиагностики инфекционных заболеваний, т. е. для выявления АТ с помощью набора известных конъюгированных (химически соединённых) с различными метками (ферментами, флюорохромными красителями), антигенов;

2) для определения микроорганизма или его серовара с помощью стандартных меченных диагностических антител (экспресс-диагностика).

Готовят диагностические сыворотки иммунизацией животных соответствующим АГ, затем выделяют иммуноглобулины и конъюгируют их со светящимися красителями (флюорохромами), ферментами, радиоизотопами.

Диагностических моноклональных антител получают с помощью гибридных клеток, образованных путем слияния иммунного В-лимфоцита с миеломной клеткой. Гибридомы способны быстро размножаться in vitro в культуре клеток и продуцировать при этом иммуноглобулин, характерный для взятого В-лимфоцита.

Меченые СР по специфичности не уступают другим СР, а по своей чувствительности они превосходят все СР.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

В качестве метки используются светящиеся флюорохромные красители (изотиоционат флюоресцеина и др.).

Существуют различные модификации РИФ. Для экспресс – диагностики инфекционных заболеваний - для выявления микробов или их антигенов в исследуемом материале применяется РИФ по Кунсу.

Выделяют два метода РИФ по Кунсу: прямой и непрямой.

Компоненты прямой РИФ:

1) исследуемый материал (испражнение, отделяемое носоглотки и др.);

2) меченая специфическая иммунная сыворотка, содержащая АТ к искомому антигену;

3) изотонический раствор хлорида натрия.

Мазок из исследуемого материала обрабатывают меченой антисывороткой.

Происходит реакция АГ-АТ. При люминесцентном микроскопическом исследовании в том участке, где локализуются комплексы АГ-АТ, обнаруживают флюоресценцию метки (рис.34).

Компоненты непрямой РИФ, предназначенной для экспреесс-диагностики гриппа А:

1) исследуемый материал смыв с носоглотки больного с подозрением на грипп;

2) специфическая антисыворотка с антителами против вируса гриппа А;

3) антиглобулиновая сыворотка (АТ против иммуноглобулина), меченная флюорохромом;

4) изотонический раствор хлорида натрия.

Мазок из исследуемого материала сначала обрабатывают иммунной сывороткой к искомому антигену, а затем – меченной антиглобулиновой сывороткой.

Иммунные комплексы АГ-АТ – меченные АТ обнаруживаются при помощи люминесцентного микроскопа.

Преимущество непрямого метода состоит в том, что нет необходимости приготовления широкого набора флюоресцирующих специфических сывороток, а применяется лишь одна флюоресцирующая антиглобулиновая сыворотка.

Для серологической диагностики гриппа А,то есть для определения антител против вируса гриппа А в сыворотке крови с помощью непрямой РИФиспользуют гриппозный диагностикум (антиген вируса гриппа А). Серодиагностика вирусных инфекций в основном носит ретроспективный характер и применяется для подтверждения диагноза и эпидемиологического анализа.

Иммуноферментный анализ (ИФА): конкуретный способ (определение HBs-АГ вируса гепатита В) и непрямой способ (серологическая диагностика ВИЧ - инфекции)

Иммуноферментный анализ (ИФА)

В качестве метки используются ферменты: пероксидаза, щелочная фосфатаза и др.

Индикатором реакции является способность ферментов вызывать цветные реакции при действии на соответствующий субстрат. Например, субстратом для пероксидазы является раствор ортофенилдиамина (ОФД) или тетраметилбензидин (ТМБ).

Наиболее широко применяется твердофазный ИФА (рис.35), непрямой и конкурентные способы (рис.36).

Результаты ИФА можно оценить визуально и измерением оптической плотности на спектрофотометре (ИФА – анализаторе).

К преимуществам ИФА следует отнести:

- простота методов оценки реакции;

- легко поддаётся автоматизации.

В качестве примеров приводятся следующие типы ИФА:

А) конкурентный тип

Предназначен для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HBs Ag) в сыворотках и плазме крови при диагностики вирусного гепатита В и определения носительства HBs Ag.

1) исследуемый материал – сыворотка или плазма крови;

2) антитела к HBs Ag, адсорбированные на поверхности лунки полистиролого микропланшета;

3) конъюгат – мышиные моноклональные антитела к HBs Ag, меченые пероксидазой;

4) ортофенилендиамин (ОФД) – субстрат;

5) фосфатно – солевой буфер;

6) контрольные сыворотки:

- положительная (сыворотка с HBs Ag);

- отрицательная (сыворотка без HBs Ag).

1. Внесение контрольных и исследуемых сывороток.

2. Инкубация 1 час при 37°С.

3. Отмывание лунок.

4. Внесение конъюгата.

5. Инкубация 1 час при 37°С.

6. Отмывание лунок.

7. Внесение ОФД. При наличии HBs Ag раствор в лунках желтеет.

8. Учёт ИФА проводят по оптической плотности с помощью фотометра. Степень оптической плотности будет обратно пропорциональной концентрации исследуемых HBs Ag.

Реакция протекает в три фазы:

1. HBs Ag исследуемой сыворотки (плазмы) связывается с гомологичными АТ, адсорбированными на поверхности лунки. Образуется ИК АГ-АТ. (HBs Ag – anti HBs АТ).

2. Антитела к HBs Ag, меченые пероксидазой связываются с оставшимися свободными детерминантоми HBs Ag комплекса АГ-АТ. Образуется комплекс АТ-АГ-меченые АТ (anti HBs АТ - HBs Ag - anti HBs АТ, меченые пероксидазой).

3. ОФД взаимодействуют с пероксидазой комплекса АТ-АГ-АТ и происходит жёлтое окрашивание.

В) непрямой тип

Является основной тестовой реакцией диагностики ВИЧ – инфекции.

Цель: Серологическая диагностика ВИЧ-инфекции – обнаружение антител к антигенам ВИЧ.

1) исследуемый материал – сыворотка крови (АТ к АГ-м ВИЧ);

2) синтетические пептиды имитирующие 2-х антигенов ВИЧ: gp 120 и gр 41, адсорбированные на поверхности полистироловой лунки;

3) антиглобулиновая сыворотка, меченная пероксидазой, полученная путём иммунизации кроликов глобулинами человека (АТ к АТ);

5) фосфатно-солевой буфер;

6) контрольные сыворотки:

1. Внесение контрольных и исследуемых сывороток.

2. Инкубация 30 минут при 37°С.

4. Внесение антиглобулиновой сыворотки меченой ферментом.

5. Инкубация 30 минут при 37°С.

Реакция протекает в 3 фазы:

1. Антитела к ВИЧ исследуемой сыворотки связываются с гомологичными антигенами (gр 120 и gр 41), и на поверхности сорбента образуется ИК АГ-АТ ( АГ ВИЧ - АТ к ВИЧ).

2. Образование ИК АГ-АТ-АТ, меченое пероксидазой, т.к. АТ исследуемой сыворотки являются антигенами для антиглобулиновой сыворотки.

3. ОФД взаимодействует с пероксидазой комплекса АГ-АТ-АТ, и происходит жёлтое окрашивание раствора лунки. Степень ферментативной активности прямо пропорциональна концентрации исследуемых АТ.

Дата добавления: 2018-02-28 ; просмотров: 1396 ;

Бесплатная горячая линия юридической помощи

• Главная
• ПРИКАЗ Минздравмедпрома РФ N 101, Госкомсанэпиднадзора РФ N 46 от 19.04.95 "О ЗАЩИТЕ НАСЕЛЕНИЯ ОТ ГРИППА И ДРУГИХ ОСТРЫХ РЕСПИРАТОРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ"

3. Серологические методы диагностики гриппа и других ОРЗ

Серологические реакции, такие как реакция торможения гемагглютинации (РТГА), реакция связывания комплемента (РСК), иммуноферментный анализ (ИФА), используются для определения уровня специфических антител в сыворотках больных ОРЗ с целью ретроспективного подтверждения диагноза. Эти методы используются также для определения уровня коллективного гуморального иммунитета, ретроспективного анализа природы эпидемических вспышек, оценки иммуногенной активности гриппозных вакцин.

3.1. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)
для диагностики гриппа и парагриппозной инфекции

Метод основан на подавлении гемагглютинирующей активности вируса в присутствии специфических антител.

Для проведения РТГА с гриппозными антителами используют диагностикумы из штаммов, резистентных к неспецифическим сывороточным ингибиторам. Перед постановкой реакции парные сыворотки крови от больных, взятые в острой фазе инфекции и в период реконвалесценции, разводят в 10 раз физиологическим раствором (ФР) и прогревают в водяной бане при 56 °С в течение 30 мин. При постановке РТГА с парагриппозными антигенами сыворотки необходимо дополнительно освобождать от неспецифических гемагглютининов. Для этого к сывороткам, разведенным в 10 раз, добавляют по 1 капле осадка эритроцитов морской свинки, смесь встряхивают и оставляют на ночь при температуре +4 °С. В работе используют надосадочную жидкость.

При проведении РТГА с вирусами гриппа используют эритроциты кур или человека 0(1) группы крови, с вирусами парагриппа - эритроциты морской свинки. Для получения эритроцитов морской свинки используют 2,5% раствор лимоннокислого натрия на ФР, который добавляют к цельной крови в соотношении 1:5, эритроцитов кур - раствор Альсевера (1:1), состоящий из глюкозы (2,05 г), хлористого натрия (0,42 г) и лимоннокислого натрия (0,8 г), разведенных в 100 мл дистиллированной воды. Эритроциты хранят при +4 °С до появления первых признаков гемолиза (в течение 1 недели). Перед постановкой опыта эритроциты кур и морских свинок отмывают ФР три раза, человека - 6 раз с помощью центрифугирования при 1000 об/мин в течение 15 мин. В реакции используют 1% суспензию эритроцитов.

В РТГА используют раствор антигена, содержащий 4 ГЕ/0,1 мл.

Предварительно в реакции гемагглютинации (РГА) определяют титр антигена. Для этого вряду лунок планшета, содержащих по 0,1 мл ФР, готовят двукратные разведения антигена (начиная с 1:2 до титра, указанного на этикетке). После этого в каждую лунку вносят дополнительно по 0,1 мл ФР и 0,2 мл 1% суспензии эритроцитов. Для контроля оседания эритроцитов в отсутствие антигена в дополнительном ряду смешивают по 0,2 мл ФР и 0,2 мл эритроцитов. Через 45-60 мин инкубации при температуре 20+-5°С при полном оседании эритроцитов в контрольном ряду учитывают результаты реакции.

Титром антигена считают его последнее разведение, при котором наблюдается полная агглютинация эритроцитов.

Кратность разведения антигена для получения заданной дозы вируса определяют как частное от деления титра антигена на 4. В полученном растворе определяют правильность выбранной дозы повторным титрованием антигена с доведением ее (при несоответствии) до 4 ГЕ добавлением ФР или вирусного антигена. Дополнительно дозу вируса уточняют по результатам его взаимодействия со стандартной иммунной референс-сывороткой, которая должна в повторных опытах нейтрализовать 4 ГЕ в одном и том же разведении.

Парные сыворотки от больного исследуют в одном опыте. Готовят серию двукратных разведений сывороток на ФР (от 1:10 до 1:320) в объеме 0,1 мл. К каждому разведению добавляют по 0,1 мл (4 ГЕ) вируса. Панели встряхивают и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. После этого в каждую лунку добавляют по 0,2 мл 1% суспензии эритроцитов. Результаты реакции учитывают после оседания эритроцитов в контрольных лунках (без вируса). Титром сыворотки считают ее наибольшее разведение, в котором наблюдается полное ингибирование гемагглютинации вируса. Диагностически достоверным считается не менее, чем 4-кратное увеличение титров антител в постинфекционной сыворотке по сравнению с сывороткой острой фазы заболевания.

Использование иммуноферментного метода индикации антител к возбудителям острых респираторных вирусных инфекций обеспечивает ряд преимуществ перед традиционными тестами.

К ним относятся:

- высокая чувствительность тестов (титры выявляемых антител в сотни раз превышают регистрируемые в РТГА и РСК);

- специфичность анализа (на результат реакции не влияет присутствие неспецифических ингибиторов сывороток);

- повышенная (на 10-40%) частота распознавания вирусных ОРЗ при гриппе А, аденовирусной и РС-вирусной инфекциях;

- возможность дифференцированной индикации специфических антител классов IgG и IgM и распознавании тем самым острой фазы заболеваний, например, при внутрибольничных инфекциях, при вспышках ОРЗ и др.;

- возможность использования микроколичества сыворотки (1 мкл) для проведения анализа;

- отсутствие необходимости в трудоемких операциях по титрованию антител (при количественной индикации результатов реакции на мультискане).

Для проведения иммуноферментного анализа используют тест-системы, разработанные и выпускаемые НИИ гриппа РАМН.

1. Антигены сухие (0,1 мл) вируса А (ВГА (или вируса гриппа В (ВГВ) РС-вируса (РСВ) аденовируса (АВ) парагриппа 3 типа (ПГ3)	1 амп.
2. Планшеты для иммуноферментного анализа 1 шт.
3. Контрольные сыворотки, содержание антитела к используемым антигенам, сухие, 0,1 мл (К+)	1 амп.
4. Контрольные сыворотки, не содержащие антител к используемым антигенам, сухие, 0,1 мл (К-) 1 амп.
5. Антитела диагностические к иммуноглобулинам человека класса IgG (или IgM), меченные пероксидазой (конъюгат), 0,01 мл 1 фл.
6. Ортофенилендиамин (ОФД), 10 мг 1 фл.
7. Перекись водорода, 3% раствор, 0,1 мл 1 фл.
8. Карбонатно-бикарбонатный буфер (КББ), смесь солей, 45 мг 1 фл.
9. Фосфатно-солевой буфер (ФСБ), смесь солей, 5,25 г 1 фл.
10. Твин-20, 0,250 мл 1 фл.
11. Желатиновая смесь, 4 мл 3 фл.
12. Натрий фосфорнокислый двузамещенный двуводный 108 мг 1 фл.
13. Лимонная кислота, 63 мг 1 фл.
14. Серная кислота - 1 М раствор, 5 мл 1 фл.

Для получения 0,5 л ФСБ содержимое флакона N 9 растворяют в 500 мл дистиллированной воды.

2. Промывающий раствор (ПР)

Для получения ПР к 500 мл ФСБ добавляют 0,25 мл твина-20.

3. Раствор для разведения К-, К+, конъюгата и исследуемых сывороток (РРК)

Для получения РРК во все флаконы с желатиновой смесью добавляют по 4,0 мл подогретой (50-55 °С) дистиллированной воды, содержимое флаконов объединяют, к смеси добавляют 40 мл ПР.

Для получения раствора КББ содержимое флакона N 8 растворяют в 10 мл дистиллированной воды.

5. К+, К- и исследуемые сыворотки

В ампулы с К+ и К- добавляют дистиллированную воду по 0,1 мл и разводят как указано на этикетке. Исследуемые сыворотки разводят 1:400 и 1:800 на РКК.

6. ОФД. Готовят непосредственно перед употреблением.

Навеску натрия фосфорнокислого двузамещенного двуводного (флакон N 12) растворяют в 3 мл дистиллированной воды (раствор А). Навеску лимонной кислоты (флакон N 13) растворяют в 3 мл дистиллированной воды (раствор В). Смешивают 2,5 мл раствора А и 2,5 мл раствора В, доводят объем до 10 мл дистиллированной водой (цитратно-фосфатный буфер (ЦФБ) рН 5,0+-0,1). Навеску ОФД (флакон N 6) растворить в 10 мл ЦФБ, добавить 0,1 мл 3%-ного раствора перекиси водорода (флакон N 7), перемешать.

7. Конъюгат. Рабочее разведение.

Содержимое ампулы (0,01 мл) растворяют в РКК до титра, указанного на этикетке.

8. Антигены. Антигены регидрируют дистиллированной водой до первоначального объема (0,1 мл), затем добавляют 10 мл КББ.

Проведение иммуноферментного анализа

1. В лунки планшета вносят по 100 мкл раствора антигена. Планшет накрывают крышкой, инкубируют 18 ч при (4-6) °С.

2. По окончании инкубации раствор антигена удаляют, планшеты промывают 3 раза ПР.

3. В лунки планшета А1, В1 вносят по 100 мкл раствора К+, в лунки С1, D1 - по 100 мкл раствора К-, в лунки Е1, F1, G1, H1 - по 100 мкл ФСБ. В остальные лунки планшета вносят по 100 мкл исследуемых сывороток, разведенных каждая 1:400 и 1:800 на РКК.

4. Планшеты накрывают крышкой и инкубируют 2 ч при 37 °С.

5. По окончании инкубации планшеты освобождают от содержимого, промывают 4 раза ПР.

6. Во все лунки вносят по 100 мкл рабочего раствора конъюгата.

7. Инкубируют планшеты в закрытом виде 45 мин при 37 °С.

8. Удаляют содержимое лунок, планшеты промывают 4 раза ПР.

9. Во все лунки вносят по 100 мл раствора ОФБ.

10. Инкубируют 10-20 мин при температуре 20-25 °С в темном месте.

11. Для остановки реакции в каждую лунку добавляют по 50 мкл серной кислоты (флакон N 14).

Учет и интерпретация результатов

Результаты ИФА учитывают спектрофотометрически при длине волны 490 нм. Установку "бланк" спектрофотометра осуществляют по лункам С1-Н1 каждого планшета. Оценку результатов исследования производят только в том случае, если средний показатель оптической плотности (ОП490) в К+ выше, чем в К-, не менее, чем на 0,5 ед. ОП490. Увеличение ОП490 на 0,3 ед. и более в сыворотке реконвалесцента по сравнению с сывороткой в том же разведении, полученной в острой фазе заболевания, расценивается как диагностически достоверное.

Адрес изготовителя: 197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 15/17 НИИ гриппа; тел. 234-12-10, 234-58-75, 234-15-48 факс (812) 234-01-50

Начальник Управления
профилактической медицины
Минздравмедпрома России
Р.И.ХАЛИТОВ

Начальник Управления Государственного
санитарно-эпидемиологического надзора
и экспертизы Госкомсанэпиднадзора
России
В.И.ЧИБУРАЕВ

Приложение 5
к приказу Минздравмедпрома
и Госкомсанэпиднадзора РФ
от 19 апреля 1995 г. N 101/46

ОРВИ и грипп имеют респираторные симптомы и общие. Их можно распознать по катаральным признакам со стороны дыхательных путей и общей симптоматике, характерной для большинства заболеваний.

Современные методы диагностики данной группы заболеваний

Различают несколько видов диагностики, которые различаются по особенностям проведения и методу выявления возбудителя. Это:

• экспресс-методы;
• серологическая диагностика;
• вирусологическая диагностика.

Первая группа - экспресс-методики. Это быстрый способ подтвердить или исключить наличие болезни. Используется метод флюоресценции и ПЦР. Рассмотрим их подробнее.

Изучение флюоресцирующих антител - МФА. Способ основан на определении антигенов к вирусу в эпителиальных клетках носовой слизистой, на конъюнктиве (если есть глазные поражения). Антитела при действии антигена реагируют специфическим свечением, которое легко заметить при микроскопическом исследовании. Этот параметр считается маркером диагностики и является основой для подтверждения результата. Способ имеет диагностическую ценность начиная с 3 и заканчивая 5 днем заболевания. Чувствителен к таким антигенам: вирус гриппа типа А, В, вирус парагриппа, аденовирусы и возбудитель РС-инфекции. Это удобный и быстрый метод, не требующий особых ресурсов, который часто применяется в ходе диагностики.

Метод полимеразно-цепной реакции базируется на основе обнаружения участков нуклеиновых кислот генетического материала вируса и определении их групповой принадлежности по этому критерию. Методика имеет высокую диагностическую ценность, является современным и качественным способом подтверждения заболевания. Считается “золотым стандартом” диагностики, так как не дает ложных результатов и является специфическим для определения конкретных патогенов, широко применяется в стационарных и амбулаторных условиях.

Вирусологические методики основаны на чистом выделении вирусных микроорганизмов и их конкретных штаммов, за чем следует их прикрепление к клеточным культурам в лабораторных условиях. Далее следует определение вида вируса с помощью ПЦР или других реакций. Метод требует значительных ресурсов, довольно длительный и трудоемкий. Его ценность заключается в получении эпидемиологических данных и основе для научных работ. То есть, детальное изучение вируса, частоты его распространения позволяет прогнозировать эпидемическую картину, создавать вакцины. Для исследования берется мазок из носа и носоглотки. Материал пригоден в течении 3-5 дня заболевания. С помощью вирусологических методов можно определить такие возбудители:

Серологические методы диагностики - это ретроспективное исследование, которое дает точные данные относительно стадии процесса, степени активности и типа возбудителя. Используется для эпидемиологических целей.

Для анализа используется сыворотка крови, в которой необходимо определить количество и виды антител. Используется известный антиген вируса. При возникновении реакции с материалом пациента формируются иммунные комплексы антиген-антитело, что подтверждает диагноз. Для диагностики также важен прирост титра антител, для чего используются парные сыворотки.

Результат имеет высокую точность и может определиться даже если все другие методы не дали результата, так как имеет высокую чувствительность. особенно важно использование метода для стертых форм с минимальными клиническими проявлениями. Сыворотки для анализа берутся в начале болезни, а также через 10-14 дней после её завершения. Используется метод для подтверждения наличия в организме таких возбудителей: вирусы гриппа А, В, возбудители парагриппа, аденовирусы и РС-вирусы.

Наличие вируса гриппа можно подтвердить с помощью РТГА - реакции торможения геммааглютинации. Метод основан на свойстве снижения гемагглютинирующих способностях вируса, если в крови есть антитела к нему. Для этого используется кровь с эритроцитами, антиген. Препараты крови берутся парными, в начале болезни, и в период выздоровления. Метод имеет высокую диагностическую ценность, точный и чувствительный.

Виды исследуемого материала и особенности сдачи

Для диагностики используются смывы из носа, мазки из носовых ходов, носоглотки, а также препараты крови.

Забор мазка и смыва проводит медицинский персонал. Он следит за тем, чтобы препараты строго соответствовали должной локализации. Забор проходит в чистых условиях, стерильными инструментами и в стерильную тару. До того, как взять мазки пациента просят высморкаться, чтобы очистить носовые ходы от слизи. Зонд вводится легко, на глубину 2-3 см. Проводится стандартное движение по нижней части носового хода и под раковиной носа. Необходимо, чтобы забор происходит в современной клинике, где есть возможность правильно хранить и транспортировать собранный материал в короткий срок до лаборатории.

Мазок из глотки берется по похожей методике, чтобы затронуть те участки слизистой, на которой скапливается возбудитель. Перед забором необходимо легко прополоскать рот, чтобы взятый материал был чистым. Желательно забирать материал на 3-й день после начал болезни.

Нормы и отклонения от них, расшифровка результатов

Экспресс-тест дает результаты сразу после диагностики, его расшифровка не вызывает трудностей, так как определяет наличие вируса или его отсутствие в организме.

Серологические реакции более сложные и могут расшифровываться по разному: наличие антител класса М говорит об острой стадии процесса, антитела G формируются при хроническом течении.

Сроки готовности результатов

Результаты исследования готовы на 1-2 день после сдачи. Экспресс-тест дает результат сразу. Серологические методы требуют больше затрат времени для сравнения титров антител. Более быстрые методы важны для диагностического процесса, а те, что более затратны - для эпидемиологического и научного исследования.

Скорость диагностики зависит от правильности сдачи препаратов, условий лаборатории, качества реактивов.

Вовремя сданный анализ позволяет точно и быстро определить диагноз. Это - залог правильного и эффективного лечения. Если болезнь запустить, она грозит осложнениями, которые особенно опасны, если у человека грипп. Это актуально для детей, пожилых людей, беременных женщин и лиц с дефицитом иммунной системы, ведь осложнения чаще всего проявляются у них.

Лаборатория АО "СЗЦДМ" предлагает услуги, обеспечивающие комплексное и преемственное лабораторное обследование пациента

Диагностика В медицинских центрах АО "СЗЦДМ" проводят качественные диагностические исследования всего организма

Лечение Наши медицинские центры ориентированы на обслуживание пациентов в амбулаторном режиме и объединены единым подходом к обследованию и лечению пациентов.

Реабилитация Реабилитация - это действия, направленные на всестороннюю помощь больному человеку или инвалиду для достижения им максимально возможной полноценности, в том числе и социальной или экономической.

Выезд на дом Внимание! Действует акция "Выезд на дом - 0 рублей"

Профосмотры АО "СЗЦДМ" проводит профилактические осмотры работников, которые включают в себя - комплексы лечебных и профилактических мероприятий, проводимых для выявления отклонений в состоянии здоровья, профилактики развития и распространения заболеваний.