Спектра антител класса igm вируса гепатита с сорбированных раздельно на 4-х стрипах
Антителогенез у больных HCV-инфекцией
В.И. Лучшев, Т.Я. Чернобровкина, С.Н. Жаров
Из литературных источников известно, что геном вируса гепатита С (ВГС) кодирует три структурных белка: протеин С (core, ядерный), Е1 и Е2 (протеины оболочки) и четыре неструктурных белка: NS2, NS3, NS4 (A,B), NS5 (A,B). К каждому из белков в организме человека вырабатываются антитела, циркулирующие в крови. В настоящее время предлагается широкий спектр современных иммунологических и молекулярно-биологических диагностических тест-систем, а также гистологических исследований печени для выявления антительных, антигенных маркеров и RNA вируса гепатита С, различающихся своей чувствительностью и специфичностью [1, 2, 5, 8, 10]. Наиболее ранним маркером инфекции является обнаружение в сыворотке крови RNA-HCV через 1-3 недели от момента инфицирования. Однако, положительная RNA-HCV в сыворотке крови регистрируется только у 25% инфицированных ВГС на фоне нормальных уровней активности трансаминаз, поэтому чаще заболевание длительное время не диагностируется [2].
Обычно антитела к структурным белкам выявляются в сыворотке крови через 6-8 недель от инфицирования, причем они не обладают вируснейтрализующими свойствами, достаточными для элиминации вируса. Именно белки внешней оболочки (Е1 и Е2) ВГС имеют участки с высокой частотой аминокислотных замен, в результате которых образуются большое число генотипов и субтипов. Антитела к неструктурным белкам определяются в сыворотке крови несколько позже (через 10 недель от начала болезни) [3, 4, 5, 6]. В литературе появляется все больше данных о предполагаемых функциях и прогностическом значение как антигенов так и антител к ВГС. Считают, что нуклеокапсидный белок активирует апоптоз инфицированных клеток, способствует увеличению числа рецепторов апоптоза на клеточной мембране гепатоцита и повышению чувствительности клетки к проапоптотическим стимулам. Так, за чувствительность к интерферону возможно отвечает NS5 (A,B) белок. Высокий титр антител к поверхностным (структурным) белкам в острой фазе заболевания характеризует благоприятное течение HCV-инфекции [3]. Отсутствие антител к NS5 белку у больных ОГС характерно для периода реконвалесценции [5]. Выявление анти-NS4 ассоциируется с поздними морфологическими стадиями болезни – циррозом печени [4, 7, 9]. Диагностическая интерпретация антител к NS3 неструктурному белку по данным литературы неоднозначна. Кроме того, данные о маркерах вируса С изучались в образцах сыворотки крови больных в основном при моно инфекции HCV. Однако, доказанная репликация ВГС не только в клетках печени, но и в клетках эпителия, кератиноцитах, лимфоидных клетках и даже клетках крови послужила основанием для исследования маркеров ВГС на эритроцитах крови больных [7, 11].
Поэтому целью нашей работы являлось усовершенствование дифференциальной диагностики НСV-инфекции на основании исследования антител к структурным и неструктурным белкам ВГС не только в сыворотке, но и на эритроцитах крови больных.
Материалы и методы
Изучение клинической картины, лабораторных показателей и антителогенеза проводилось у 57 больных, страдающих HCV-инфекцией и микст-инфекцией HCV + HBV. Первую группу пациентов получавших базисную терапию, составили 17 больных с острым гепатитом С (ОГС), вторую 15 с обострением хронического гепатита С (ХГС), третью 25 пациентов с микст-инфекцией HCV+HBV по типу супер-инфекции острый гепатит В на фоне хронического гепатита С (ОГВ+ХГС). Пациенты находились на стационарном лечении в Инфекционной клинической больнице №3 г. Москвы (главный врач – Лазуткина Л.И.).
Верификацию вирусных гепатитов проводили с использованием иммуноферментного анализа (ИФА) и полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Учет результатов проводили спектрофотометрически при длине волны 450 нм. Рассчитывалась критическая оптическая плотность (ОП) каждого антигена по формуле:
ОП крит. core-Ag = среднее значение ОП К- (core) + 0,2
Реакция считалась положительной при превышении результата над показателем критической ОП не менее чем на 20%.
ИФА проводился в лаборатории кафедры инфекционных болезней, тропической медицины и эпидемиологии РГМУ на базе клинической инфекционной больницы №3.
Результаты и обсуждение
При исследовании спектра маркеров HCV-инфекции в сыворотке и на эритроцитах крови, в условиях динамического наблюдения за больными получены следующие результаты.
У всех больных с моно-HCV-инфекцией при госпитализации в стационар обнаруживаются антитела к ядерному белку ВГС (100%) и в несколько меньшем проценте (84%) у пациентов с микст-инфекцией ОГВ+ХГС. В динамике заболевания сохраняется 100% выявляемость этих антител во всех группах (табл. 1).
Таким образом, наличие антител к core-белку в сыворотке крови практически у всех больных при поступлении в стационар и после базисной терапии может свидетельствовать о наличии у пациента только HCV-инфекции, не указывая на длительность течения и период заболевания. Следовательно, характерный спектр антител к структурному core-белку в сыворотке крови больных будет недостаточным для дифференциальной диагностики HCV-инфекции.
Параллельное определение спектра антител на эритроцитах крови показало, что в них сохраняется наибольшая выявляемость антител к core-белку у всех больных в период разгара и в период реконвалесценции у пациентов с ХГС и микст-инфекцией, в противоположность ОГС (20%, р Задать вопрос Оставить отзыв
Как будет работать пропускной режим в Москве и в Подмосковье. Инструкция с 15 апреля 2020 года
Антитела к гепатиту С (АТ) – один из основных маркеров инфицирования. Лабораторное определение иммуноглобулинов (IgG и IgM) входит в протоколы обязательного обследования работников торговли, медицинских и детских образовательных учреждений, беременных женщин и т.д.
С учетом распространения HCV (по данным статистики, инфицировано порядка 200 млн. человек) очень важно наличие точных и доступных методов диагностики. Только так можно вовремя выявить не проявляющую себя болезнь и немедленно начать лечение, которое при использовании современных препаратов будет результативным практически у 100% пациентов.
Структуру возбудителя гепатита С (Ц) составляют различные протеины, которые проникая в организм провоцируют ответную реакцию иммунной системы. Эти патогенные белки, антигены, стимулируют иммунитет, и результатом подобного взаимодействия служит появление антител.
Исследование, позволяющее выявить наличие иммуноглобулинов к антигенам HCV в крови человека, называют ИФА (иммуноферментным анализом). Благодаря современным технологиям, проведение данного теста не представляет сложности и возможно в условиях практически любой лаборатории.
Более того, в аптеках появляется все больше экспресс-тестов, предназначенных для предварительной диагностики вирусного гепатита С (ВГС) в домашних условиях.
Но расшифровка результатов серологических исследований проводится с оглядкой на особенности функционирования иммунитета. При некоторых заболеваниях, на фоне приема ряда лекарственных препаратов АТ или не вырабатываются, или синтезируются в недостаточном для лабораторного выявления количестве.
И наоборот, избыток антител вследствие системной инфекции (например, туберкулеза) или появление нетипичных белковых соединений при беременности нередко приводит к ложноположительному результату.
Что значит антитела к HCV?
Антитела к вирусу гепатита С (АТ) – продуцируемые в крови белковые соединения в ответ на контакт организма с антигенами возбудителя инфекции. Соответственно, если при исследовании обнаружены специфические Ig (G или M), это значит (за редким исключением), что человек инфицирован.
Иногда больной не подозревает о своем диагнозе. По статистике, у 50–65% пациентов гепатит С диагностируется случайно при прохождении медицинского осмотра, постановке на учет при беременности и т.д.
Количественная полимеразная цепная реакция позволяет определить активность патологического процесса (вирусную нагрузку). ИФА не дает такой информации.
В ходе диагностики болезни, определение наличия антител проводят несколькими способами (в зависимости от показаний).
Тип проводимого иммуноферментного анализа | Краткое описание |
Определение суммарного титра антител (обычно обозначается Total) | |
Антитела IgM | Результат необходим для дифференцирования острой инфекции от хронического течения болезни |
Антитела IgG и авидность IgG | |
Антигены определенных неструктурных протеинов HCV и ядерного белка core | Анализ не входит в стандартный протокол обследования, но является более специфичным и часто проводится в комплексе с выявлением IgG |
Классы антител
В настоящее время известно о 5 классах антител, циркулирующих в крови человека либо вырабатываемых при инфицировании, аллергической реакции и других синдромах.
Их обозначают буквами латинского алфавита (указывается после аббревиатуры Ig):
Учитывая патогенез развития гепатита С, диагностическое значение имеет только два класса иммуноглобулинов М и G. Но при выявлении HCV-инфекции немалую роль играют и антитела к структурным белкам и ядерному протеину core.
Такое исследование назначается не всем пациентам, но данный анализ часто необходим для определения прогноза терапии (особенно при решении вопроса для назначения схемы лечения).
Anti-core | Является основным маркером заражения, но учитывается только при первичной диагностике, так как повышенные титры сохраняются и после результативного лечения |
Anti-NS3 | Вырабатывается при остром течении инфекции (иногда доктора сразу не начинают терапию, давая иммунной системе самостоятельно справиться с инфекцией) |
Anti-NS4 | Титры этого Ig коррелируют с тяжестью поражения печени |
Anti-NS5 | Предиктор перехода патологии в хроническую стадию |
Когда возможно выявление антител гепатита С
Знание сроков, когда появляются те или иные иммуноглобулины, позволяет максимально точно провести диагностику и свести к минимуму риск ложноотрицательных результатов.
Так, выявление антител гепатита С целесообразно проводить с учетом следующих данных:
Класс антител | Сроки появления в кровотоке |
Недифференцированный Anti-HCV | До 2 месяцев после попадания HCV в кровь (за счет выработки IgM) |
IgM | Сроки появления индивидуальны, в среднем – до полутора месяцев |
Anti-NS3 | Обнаруживаются и циркулируют в крови практически одновременно с IgM |
Anti-NS5 | Вырабатываются через 4–6 месяцев при постепенном затухании острого процесса и переходе болезни в хроническую вялотекущую стадию |
IgG | Вырабатываются при хронической форме заболевания, через 6–8 месяцев после заражения |
Anti-NS4 | Антитела обычно появляются на стадии поражения печени, обычно 10–11 месяцев, иногда – год, после инфицирования |
Точные сроки появления антител (вне зависимости от класса и включая АТ к структурным и неструктурным протеинам вируса) назвать практически невозможно, все зависит от интенсивности иммунного ответа. Поэтому, если не обнаруживается маркер Anti-HCV Total, но риск инфицирования велик. Рекомендовано повторное проведение теста через 14–21 день.
И наоборот, если антитела гепатита С есть, а ПЦР отрицательный, необходимо определить причину подобного результата. Но в любом случае человек остается под медицинским наблюдением. Направления на сдачу крови выдаются раз в 2–4 месяца до получения однозначного результата.
Лабораторные исследования ПЦР и ИФА
В настоящее время специалисты с уверенностью говорят, ВГС вполне излечим, но при условии своевременной диагностики. Процесс обследования пациента проходит в несколько стадий. Таким образом врач получает максимально полную картину о состоянии пациента.
Показаниями к проведению анализа методом ИФА (Anti-HCV Total) служат:
- регулярное ежегодное обследование (по требованиям законодательства);
- комплексная диагностика женщин при беременности;
- сомнительные результаты печеночных проб;
- типичные для ВГС клинические проявления;
- предполагаемое заражение, например, при использовании общих медицинских инструментов или половом акте с инфицированным;
- постоянное проживание с больным;
- наличие ВИЧ и других иммунодефицитных состояний.
Позитивный результат анализа на АТ является показанием для проведения других диагностических тестов. Назначаются:
- тест на авидность антител (для определения ориентировочных сроков инфицирования);
- дифференцированный анализ ИФА (отдельное выявление Ig различных классов).
Но иногда данными исследованиями пренебрегают и сразу назначают ПЦР. Суть данного анализа состоит в определении РНК возбудителя инфекции.
Полимеразная цепная реакция – наиболее точный маркер ВГС и делится на несколько типов:
- качественная, необходима только с целью выявления РНК;
- количественная;
- генотипирование, проводится после подтверждения диагноза для установления разновидности вируса.
Другие анализы и инструментальные исследования назначают по усмотрению доктора.
Обнаружение антигенов к HCV не входит в протокол обязательных диагностических исследований. Анализы проводят при положительных тестах ИФА для прогнозирования дальнейшего развития инфекции. В некоторых случаях терапию не начинают, дожидаясь возможного самоизлечения (вероятно у трети больных без приема каких-либо препаратов).
Выявление Anti-NS5 как предиктора перехода в хроническую форму служит показанием для начала лечения. Превышение показателей anti-NS4 – возможный признак тяжелой печеночной энцефалопатии. Это также служит показанием к соответствующей терапии: назначению сильнодействующих схем лечения, соответствующих гепатопротекторов, обязательном соблюдении строгой диеты и т.д.
Но в соответствии с последними рекомендациями ВОЗ, при наличии критериев ВГС либо маркеров хронизации патологического процесса необходимо начинать соответствующее лечение.
На этапе терапии критерием ее эффективности является только результаты количественной и качественной ПЦР. Дело в том, что антитела класса G (IgG) вырабатываются на фоне хронической формы HCV и долгое время остаются в крови и, соответственно, определяются методом ИФА и после лечения гепатита С. Как правило, они исчезают через 3–5 лет после окончания терапии, но иногда их выявляют и на протяжении всей жизни.
После проведенного терапевтического курса единственным критерием выздоровления служит отрицательный результат качественной ПЦР (она более чувствительна по сравнению с количественной методикой определения).
Суммарные антитела к вирусу гепатита С
Суммарное определение иммуноглобулинов проводят на первой стадии диагностики. В норме результат отрицательный.
Но вероятность ошибочного позитивного результата возникает:
- при вынашивании ребенка (выделяются специфические протеины, которые ошибочно распознаются тест-системами как Анти HCV);
- при системных инфекциях, когда существенно повышается уровень иммуноглобулинов всех классов;
- при перенесенном ранее гепатите С в острой форме, после чего в крови надолго сохраняются IgG.
Если АТ к гепатиту С обнаружены у ребенка, это далеко не всегда является критерием инфицирования. Специфические Ig могут появляться сразу после рождения и сохраняться на протяжении 1– 3 лет (потом отмечают их исчезновение) при наличии IgG или IgM у матери во время беременности вследствие активной инфекции либо перенесенного заболевания.
Риск внутриутробной передачи вируса невелик. Современные технологии родоразрешения практически на 100% защищают младенца от заражения. Но ребенок с положительным ИФА (при условии отрицательной ПЦР) должен оставаться под наблюдением врача до получения отрицательных результатов анализов.
Исследование на суммарные антитела к вирусу гепатита С может быть ложноотрицательным при:
- аутоиммунных заболеваниях (в том числе аутоиммунном гепатите);
- ВИЧ/СПИД;
- различных иммунодефицитных состояниях на фоне нарушения системы кроветворения, приема некоторых лекарственных препаратов (иммунодепрессантов, цитостатиков, противоопухолевых средств, больших доз кортикостероидов и т.д.).
Поэтому перед назначением анализов врач тщательно собирает анамнез пациента, обязательным является исследование на ВИЧ. Эта информация поможет избежать ненужных обследований и способствует правильной расшифровке результатов диагностических тестов.
Расшифровка анализа крови
Практически во всех бланках лабораторных исследований на антитела к вирусу гепатита С приведены референсные результаты (норма для здорового человека). При определении конкретного вида иммуноглобулинов указываются их количественные значения (титр), что свидетельствует о тяжести течения вирусной инфекции.
Примерная расшифровка данных ИФА приведена в таблице.
Метод проведения анализа | Вероятная трактовка при положительном результате |
Anti-HCV Total, Anti-HCV core |
|
IgM HCV | Острая форма инфекции |
IgG |
|
Anti-NS3 | Острое течение вируса, недавнее инфицирование |
Anti-NS4 | Длительное течение гепатита С, высока вероятность необратимых изменений печеночной ткани |
Anti-NS5 | Начальные стадии хронической формы гепатита С, наличие РНК вируса в высоких концентрациях |
Но только доктор сможет точно объяснить, что значит, когда антитела к гепатиту С обнаружены или пропали после предшествующего анализа методом ИФА.
Диагноз HCV ставится только на основании нескольких анализов, включая ПЦР с определением значимых уровней вирусной нагрузки. Самостоятельная интерпретация результатов, а тем более начало терапии может закончиться резистентностью вируса и тяжелыми необратимыми последствиями.
Уже после пройденного курса терапии пациента обычно интересуются, остаются ли антитела после лечения гепатита С. Когда исчезают специфические иммуноглобулины, зависит от активности иммунной системы, вирусной нагрузки, длительности течения заболевания.
Как правило, доктора говорят о нескольких годах после терапии, иногда повышенные титры IgG сохраняются на протяжении всей оставшейся жизни. Но положительный результат качественной и/или количественной ПЦР уже после пройденного лечения свидетельствует либо о повторном инфицировании, либо о возобновлении патологического процесса.
Кто относится к группе риска
С появлением доступных схем терапии, гепатит С перестал быть приговором. Но эффективность и прогноз лечения напрямую связан с тем, на каком этапе обнаружена патология.
Поэтому при наличии повышенного риска заражения рекомендуют сдавать кровь методом ИФА 1–2 раза в год:
- работникам в сфере медицины, причем речь идет не об администраторах, а медсестрах, врачах, работниках донорских служб, которые постоянно контактируют с кровью и другими биологическими жидкостями;
- трудящимся в сфере услуг (особенно, выполняющих маникюр и педикюр) из-за высокого риска заражения при использовании острых инструментов;
- пациентам с иммунодефицитными состояниями (особенно ВИЧ), аутоиммунными заболеваниями, онкологических больных;
- людям с тяжелыми болезнями, вынужденным по состоянию здоровья проходить частые инвазивные медицинские процедуры (гемодиализ, диагностические манипуляции, переливание крови и ее элементов, трансплантацию органов);
- парам, предпочитающим гомосексуальные отношения (особенно при отсутствии постоянного полового партнера).
Риск заражения существенно повышен у людей, ведущих асоциальный образ жизни.
Иммуноглобулины класса М при HCV-инфекции – антитела, которые вырабатываются в ответ на проникновение в организм Hepatitis C Virus. При гепатите С IgM выявляются в крови спустя 1-1.5 месяца после инфицирования. Они быстро достигают пиковых значений. Спустя полгода титр антител класса М уменьшается, что свидетельствует о хронизации инфекции.
Что означают антитела IgM
Вирус гепатита С (ВГС) – возбудитель вирусного воспаления печени, который самокопируется в:
- В-лимфоцитах;
- моноцитах;
- макрофагах;
- нейтрофилах;
- гепатоцитах (печеночных клетках).
При заражении гепатитом иммунная система синтезирует иммуноглобулины IgG и IgM к структурным (core) и неструктурным (NS) белкам вируса. Они уменьшают восприимчивость клеток к инфекции, препятствуют ее прогрессированию. У 95% пациентов они появляются в системном кровотоке спустя 1-3 месяца после инфицирования.
Иммуноферментный анализ (ИФА) – метод выявления иммуноглобулинов к возбудителю, который основан на реакции антиген-антитело. Чтобы обнаружить антитела класса M (anti-HCV IgM), применяют специальные ферменты в качестве маркеров для регистрации сигнала.
- высокая специфичность;
- быстрое получение результата (до 3 суток);
- низкая вероятность ложных результатов.
По статистике, серонегативный вариант наблюдается только в 5% случаев. А у 0.5-1% больных гепатитом иммуноглобулины IgM не обнаруживаются никогда. Чаще всего это связано с угнетением иммунитета на фоне вторичных патологий.
IgM к ВГС синтезируются быстрее, чем IgG. Они обнаруживаются через 5-6 недель после заражения. Спустя полгода их уровень снижается, а повышается только при реактивации вируса, то есть в случае обострения гепатита.
Когда нужно сдать кровь на антитела
Анализ крови на иммуноглобулины проводится с целью первичной диагностики вирусного гепатита. Скрининговое обследование выполняют для:
- определения активности инфекционного процесса;
- уточнения стадии гепатита С;
- дифференциальной диагностики патологий печени.
Гепатологи рекомендуют проводить ИФА на антитела IgM к вирусу гепатита при:
- обследовании на этапе планирования беременности;
- перенесенном воспалении печени неизвестного происхождения;
- подверженности HCV-инфекции (медработники, инъекционные наркоманы, реципиенты крови).
Серологический тест на IgM к HCV выполняют при симптомах повреждения печени:
- плохое пищеварение;
- горечь во рту;
- расстройство стула;
- кратковременное пожелтение кожи;
- снижение работоспособности;
- боли в правом подреберье;
- умеренное повышение температуры;
- обесцвечивание кала;
- тошнота;
- потемнение мочи;
- раннее насыщение.
ИФА на IgM проводится при сомнительных результатах печеночных проб. Если концентрация АЛТ и АСТ в крови растет, это свидетельствует о массовом повреждении гепатоцитов. Поэтому увеличение уровня трансаминаз является поводом для скринингового обследования.
Расшифровка анализа
В норме результат на IgM и IgG отрицательный. Если иммунная система не контактировала с возбудителем гепатита, антитела к нему не синтезируются. Если результат положительный, в 70% случае это указывает на инфицирование.
Расшифровка результатов ИФА при гепатите С:
Данные анализа | Интерпретация |
отрицательный | гепатит С отсутствует |
ранний период заражения (менее 5 недель)
серонегативный результат
период выздоровления
Наличие в крови IgM еще не свидетельствует о 100% заражении. В 15-30% случаев иммунная система справляется с вирусом самостоятельно в течение 1-3 месяцев.
Критерии острой фазы гепатита С:
- внешние симптомы болезни;
- повышение уровня АЛТ;
- выявление anti-HCV.
Если при динамическом наблюдении отмечается рост антител, это указывает на острое течение гепатита. Если IgM циркулируют в крови более 2 месяцев и постепенно их концентрация уменьшается, это свидетельствует о переходе болезни в вялотекущую форму.
Точность результатов ИФА зависит от правильности подготовки к сдаче крови, соблюдения лаборантом техники выполнения анализа. При наличии в крови ревматоидного фактора риск ложноположительного результата на anti-HCV IgM увеличивается в несколько раз.
Что делать при положительном результате
ИФА и ПЦР – обязательные анализы, которые выполняются при скрининговом обследовании. При сомнительных результатах серологического теста проводится анализ на генетический материал флавивируса – Real-time ПЦР. Если в плазме обнаруживается РНК возбудителя, диагноз подтверждается.
При подтверждении факта заражения гепатитом выполняются:
- Количественная ПЦР. В 1 мл крови определяют число копий ВГС, так как от вирусной нагрузки зависит прогноз терапии и дозировка препаратов.
- Печеночные пробы. Увеличение содержания АЛТ указывает на повреждение печеночных клеток, а общего билирубина и щелочной фосфатазы – на нарушение оттока желчи из протоков.
- УЗИ печени. На фоне воспаления печень увеличивается, а в железистой ткани наблюдаются структурные изменения, связанные с фиброзом, жировым гепатозом, циррозом и т.д.
Схема противовирусной терапии (ПВТ) составляется только после уточнения генотипа, уровня виремии и стадии инфекционного процесса.
Какие лекарства назначаются при гепатите С:
- ингибиторы белков ВГС (Пибрентасвир, Ледипасвир, Софосбувир, Даклатасвир) – нарушают биосинтез вирусной РНК и сборку дочерних вирионов;
- гепатопротекторы (Гепабене, Карсил, Фосфоглив) – стимулируют регенерацию и функции гепатоцитов;
- ферменты (Панкреатин, Панзинорм, Креазим) – ускоряют переваривание пищи, предотвращают метеоризм;
- желчегонные средства (Фламин, Хофитол, Одестон) – стимулируют отведение желчи в кишечник, снижают риск холестаза;
- сорбенты (Сорбекс, Диосмектит, Мультисорб) – очищают плазму крови от токсинов и продуктов обмена веществ.
Продолжительность безынтерфероновой терапии колеблется от 8 до 24 недель. Вне зависимости от штамма HCV ее результативность превышает 96%.
Во время и после лечения нужно сдавать повторные анализы. Уменьшение концентрации IgM при отсутствующей вирусной РНК HCV свидетельствуют о выздоровлении. Чтобы ускорить восстановление печени, следует соблюдать стол №5 по Певзнеру в течение 6-12 месяцев.
Читайте также: