Тест системы для диагностики энтеровирусов

Выявление вирусов рода Enterovirus (Echovirus, Сoxsackievirus, Poliovirus), в ходе которого с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) определяется генетический материал (РНК) вируса в образце биоматериала.

Энтеровирусы, энтеровирусная инфекция [полимеразная цепная реакция].

Синонимы английские

EV, RNA [polymerase chain reaction, PCR].

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

Исключить прием слабительных препаратов, введение ректальных свечей, масел, ограничить (по согласованию с врачом) прием медикаментов, влияющих на перистальтику кишечника (белладонна, пилокарпин и др.), и препаратов, влияющих на окраску кала (железо, висмут, сернокислый барий), в течение 72 часов до сбора кала.

Общая информация об исследовании

Enterovirus – это группа РНК-содержащих вирусов, характеризующихся нуклеокапсидом в форме икосаэдра и отсутствием оболочки. Они относятся к семейству Picornaviridae, в которое также входят возбудитель вирусного гепатита А и риновирус.

Род Enterovirus объединяет несколько десятков различных вирусов, являющихся возбудителями целого спектра заболеваний человека: полиомиелита (Poliovirus), миокардита и перикардита (Сoxsackievirus В), вирусной пузырчатки полости рта и конечностей, герпетической ангины, асептического менингита и энцефалита (Сoxsackievirus A, Echovirus), а также более редких болезней. Для всех вирусов рода Enterovirus характерен схожий патогенез: попадание возбудителя в желудочно-кишечный тракт (фекально-оральный путь передачи), репликация в эпителиальных клетках слизистой оболочки ЖКТ и гематогенное распространение с поражением различных органов и тканей. Учитывая эти особенности заражения, основными биологическими средами для выявления Enterovirus являются отделяемое носоглотки, кал и ликвор. Как правило, острая инфекция Enterovirus протекает бессимптомно или в доброкачественной форме, а клиническая картина заболевания развивается лишь спустя некоторое время после первичного заражения. Эту особенность следует учитывать при выборе вида биоматериала, направляемого на анализ.

Для выявления возбудителя при подозрении на Enterovirus-ассоциированную инфекцию применяют серологические тесты, выделение вируса в культуре клеток и молекулярную диагностику.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод молекулярной диагностики, позволяющий выявлять в биологическом материале (например, в ликворе) фрагменты генетического материала (РНК) возбудителя инфекции. Она характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью, а также позволяет получить результат в более короткие сроки по сравнению с большинством других анализов, что делает ее незаменимым инструментом для своевременной диагностики Enterovirus-ассоциированных инфекций.

ПЦР является "золотым стандартом" исследования ликвора для диагностики Enterovirus-ассоциированного менингоэнцефалита. Чувствительность такого анализа составляет 95-97 %, специфичность – 97-100 %. Благодаря этим преимуществам ПЦР заменила другой прямой метод идентификации возбудителя – выделение вируса в культуре клеток эмбриона. При этом исследование ликвора, полученного в первые 2 дня развития симптоматики менингоэнцефалита, характеризуется меньшей чувствительностью. Следует отметить, что вероятность обнаружить вирус при анализе нестерильных биологических сред (отделяемого носоглотки, кала) меньше, что необходимо учитывать при отрицательном результате анализа у пациента с клиническими признаками Enterovirus-ассоциированной инфекции. Большая частота ложноотрицательных реакций связана с полной элиминацией вируса из клеток ЖКТ к моменту развития симптомов заболевания (период репликации вируса в эпителии глотки составляет от 2 дней до 2 недель, в эпителии кишки – до 3 месяцев). Также ниже и специфичность метода при исследовании нестерильных сред, что связано с возможным "здоровым носительством" Enterovirus, сопутствующим клинически выраженному заболеванию, но не являющимся ее причиной.

ПЦР основана на непосредственном выявлении РНК вируса и может быть применена для выявления Enterovirus на раннем этапе болезни, что отличает ее от серологических (непрямых) методов, требующих около 2-4 недель для оценки динамики уровня выявляемых специфических антител. Однако по этой же причине ПЦР не позволяет различить острую и хроническую энтеровирусную инфекцию.

Благодаря тому, что в ПЦР выявляется общий для всех Enterovirus фрагмент РНК, она позволяет определить наличие любого представителя этого рода. Современные серологические методы разработаны только для 11 из более чем 70 вирусов рода Enterovirus. Однако по этой же причине с помощью ПЦР нельзя различить вирусы рода Enterovirus между собой, что имеет определенное значение в дифференциальной диагностике Enterovirus 71 – и Сoxsackievirus type A 16 – ассоциированного поражения нервной системы.

Диагностиказаболеваний, вызванных вирусами рода Enterovirus, представляет определенные трудности и требует проведения дополнительных лабораторных, а также инструментальных исследований.

Для чего используется исследование?

Для диагностики Enterovirus-ассоциированных инфекций:

менингита;
герпетической ангины;
вирусной пузырчатки полости рта и конечностей;
миоперикардита;
полиомиелита.

Когда назначается исследование?

менингита (головная боль, раздражительность, лихорадка, фотофобия, тошнота и не приносящая облегчения рвота, ригидность затылочных мышц);
герпетической ангины (острое начало заболевания, лихорадка с температурой 39-40 ºС, головная боль, тошнота, рвота, болезненная шейная лимфаденопатия, везикулезная сыпь на слизистой оболочке миндалин, мягкого и твердого неба, боль при глотании);
вирусной пузырчатки полости рта и конечностей у детей (лихорадка, кашель, везикулезная сыпь на коже кистей, стоп и на слизистой оболочке рта);
миоперикардита (одышка, загрудинная боль, усиливающаяся на вдохе и ослабевающая при наклоне вперед, а также периферические отеки и нарушения ритма сердца);
полиомиелита (лихорадка, головная боль, тошнота, боль в животе, парез или паралич конечностей или группы мышц, нарушения глотания, пронации и др.).

Что означают результаты?

Референсные значения: отрицательно.

Enterovirus-ассоциированная инфекция;
носительство Enterovirus.

отсутствие Enterovirus в исследуемом биоматериале.

Что может влиять на результат?

Применение рибавирина и плеконарила может приводить к получению ложноотрицательного результата.
Применение противовирусного иммуноглобулина не влияет на результат исследования.
Анализ ликвора в первые 2 дня менингоэнцефалита, а также исследование отделяемого носоглотки и кала характеризуются большей частотой ложноотрицательных результатов.

Кто назначает исследование?

Инфекционист, невролог, педиатр, стоматолог, врач общей практики.

Литература

Sawyer MH. Enterovirus infections: diagnosis and treatment. Semin Pediatr Infect Dis. 2002 Jan;13(1):40-7. Review.
Rhoades RE, Tabor-Godwin JM, Tsueng G, Feuer R. Enterovirus infections of the central nervous system. Virology. 2011 Mar 15;411(2):288-305. Epub 2011 Jan 20.
Ooi MH, Wong SC, Lewthwaite P, Cardosa MJ, Solomon T. Clinical features, diagnosis, and management of enterovirus 71. Lancet Neurol. 2010 Nov;9(11):1097-105.
Smalling TW, Sefers SE, Li H, Tang YW. Molecular approaches to detecting herpes simplex virus and enteroviruses in the central nervous system. J Clin Microbiol. 2002 Jul;40(7):2317-22.
Hsiung GD, Wang JR. Enterovirus infections with special reference to enterovirus 71. J Microbiol Immunol Infect. 2000 Mar;33(1):1-8.

Тест система, получившая регистрационное удостоверение № РЗН 2020/9677, способна выявлять РНК нового коронавируса.
Как это работает? На чем основана эта диагностика?

Достижение получено 24.08.2018

Новая тест-система для диагностики нашумевшего везде коронавируса основана на ПЦР. Расшифровывается это, как полимеразная цепная реакция. По сути, метод диагностики совершенно не нов. ПЦР широко используется для определения наличия ДНК или РНК. Нужно только знать искомую последовательность нуклеотидов. Так что вся новизна заключается именно в расшифровке (хотя бы частичной) генома коронавируса и построении специфических праймеров.

Как это работает?
ПЦР — это многократное повторение циклов, в ходе которых количество ДНК или РНК растёт. Для этого используеют фермент ДНК-полимеразу. Определять РНК несколько сложнее, так как в этой молекуле всего одна цепь. Поэтому на матрице РНК сперва синтезируют ДНК с помощью ревертазы, или обратной транскриптазы, получая молекулу, готовую к классическому ПЦР.
Далее в среду добавляют нуклеотиды, буферный раствор, нужные ферменты и, главное, праймеры. Это очень важная часть — полимераза, которая синтезирует ДНК имеет такую особенность, что не может начать с чистого листа. ей необходим старт, затравка — и это наши праймеры, коротенькие цепочки, которые присоединяются к определенному место на ДНК. Соотвественно с помощью специфических праймеров легко синтезировать множество копий определённого участка.

С помощью ПЦР можно не только определить наличие вирусной РНК в клетке, но и узнать степень заражения. Метод даёт возможность и количественной оценки.

В России недавно разработана тест системе на определение коронавируса. В Америке также разработана накая же система, но результат её можно получить в течении суток. В России в городе Челябинске стали осваивать тест систему на определение коронавируса. Результат исследования можно получить в течении четырёх или шести часов, что быстрее, чем в Америке. Тест система будет предоставлена во все регионы России. Для исследования у человека берут слюну, кровь и другие биологические жидкости. Для определения коронавируса используется метод ПЦР, который наиболее точно может определить чужеродную ДНК, которая встраивается в цепочку ДНК человека. Биологические жидкости на исследование тест системой берут у всех людей, которые прибыли или будут прибывать из Китая,для выявления заражённых или потенциально заражённых.

Кроме того, на сегодняшний день известно, что региональные организации Роспотребнадзора полностью обеспечены этими диагностическими системами тестирования.
Данная тест-система для диагностики заражения коронавирусом COVID-19 способна выявлять рибонуклеиновую кислоту (РНК) нового типа коронавирусной инфекции, вспышка которой и возникла в китайском городе Ухань в конце декабря 2019 года. Система тестирования, разработанная новосибирскими специалистами, работает по методу полимеразной цепной реакции (ПЦР). Отмечается, что ПЦР обладает такими преимуществами, как:

Во-первых, высокая чувствительность, благодаря которой можно обнаружить от 50 до 500 вирусных частиц. Во-вторых, короткий срок получения результата исследований — от 4 до 8 часов.

Суть метода анализа полимеразно-цепной реакции заключается в том, что благодаря ему возможно обнаруживать различные бактерии и вирусы достаточно быстро, путем определения фрагментов таковых бактерий и вирусов в биоматериале от больного. Принцип действия ПЦР – это многократный синтез копий генетического материала вирусов или бактерий в условиях лаборатории. Метод анализа полимеразно-цепной реакции основан на идентификации возбудителя по его ДНК или РНК, при этом не важно, какой возбудитель: живой или нежизнеспособный. Анализ ПЦР проводится следующим образом. Отбирают в пробирки биоматериал, из которого необходимо выделить вирус(бактерии). Таковым материалом для анализа может служить не только кровь, но и слюна, клетки эпителия.

Для того, чтобы запустить реакцию, вначале проводят денатурацию ДНК: две нити разделяют путем нагревания. Затем к денатурированной ДНК добавляют праймер и фермент ДНК-полимеразу. Праймер служит начальной точкой для сборки новой цепочки ДНК, а ДНК-полимераза собственно этот процесс и обеспечивает. Вновь синтезированная ДНК будет полностью идентична первоначальной. Затем опять проводят денатурацию и опять повторяют синтез ДНК. Так продолжается в течение 2 часов. За это время получают миллионы вновь синтезированных копий. Естественно, что огромное количество копий легче идентифицировать чем один-единственный фрагмент. По количеству синтезированных копий делают расчет количества первоначального числа возбудителя в образце. Идентифицируют возбудителя на третьем этапе ПЦР. При помощи электрофореза в геле. Этот процесс идет несколько часов. Поэтому длится анализ ПЦР обычно около суток. Существует также возможность оценивать количество и идентифицировать ДНК возбудителя непосредственно во время синтеза новых копий.

Среди энтеровирусов (семейство Picornaviridae) на сегодняшний день насчитывается более 100 серотипов. Энтеровирусная инфекция широко распространена во всех регионах мира. У человека энтеровирусная инфекция может протекать бессимптомно или сопровождаться широким спектром клинических проявлений: от легкого недомогания или диарейного синдрома до развития тяжелых заболеваний, таких как серозный менингит, паралич, миокардит, энтеровирусный сепсис новорожденных. Более 90% случаев заболевания серозным менингитом имеют энтеровирусную этиологию. Энтеровирусы одного серотипа могут быть связаны с различными клиническими проявлениями, но в то же время энтеровирусы разных серотипов могут вызывать схожую симптоматику заболевания. Наиболее подвержены заболеванию дети младшего возраста. Сезонный подъем заболеваемости в РФ – летне-осенний период. Циркуляция энтеровирусов может сопровождаться развитием вспышек заболевания. Диагностика энтеровирусной инфекции требует комплексной оценки клинической симптоматики заболевания, результатов лабораторных исследований и эпидемиологических данных.

К энтеровирусам относится вирус полиомиелита (полиовирус), имеющий особое эпидемиологическое значение в связи с проводимой ВОЗ Программой глобальной ликвидации полиомиелита. Острый полиомиелит характеризуется разнообразием клинических форм – от абортивных до паралитических. Паралитические формы с развитием вялых и периферических парезов и/или параличей возникают при поражении вирусом серого вещества, расположенного в передних рогах спинного мозга и двигательных ядрах черепно-мозговых нервов. Благодаря интенсивной иммунизации против полиомиелита, циркуляция вирусов дикого типа прекращена в большинстве стран. В 2002 г. Европейский регион, включая РФ, сертифицирован ВОЗ как свободный от вирусов полиомиелита дикого типа. Однако в рамках Программы во всех странах осуществляется эпидемиологический надзор за паралитическим полиомиелитом, а также за клинически схожим синдромом острого вялого паралича (надзор за ПОЛИО/ОВП). В случае выявления больного с подозрением на ПОЛИО/ОВП медицинские работники организаций и частнопрактикующие медицинские работники обязаны руководствоваться действующей нормативно-методической документацией СП 3.1.2951-11.

Показания к обследованию

Наличие одного или нескольких клинических синдромов: очаговая неврологическая симптоматика, менингеальные симптомы, сепсис новорожденных небактериальной природы, ящуроподобный синдром (экзантема полости рта и конечностей), герпангина, афтозный стоматит, миокардит, геморрагический конъюнктивит, увеит, миалгия,
возникновение групповой заболеваемости в детском организованном коллективе при наличии таких синдромов, как респираторный, гастроэнтерит, экзантема и другие.

Материал для исследований

Стерильные типы материала: СМЖ (при наличии клинических показаний для проведения люмбальной пункции), отделяемое конъюнктивы, мазок отделяемого везикул, биоптаты органов;
нестерильные типы материала: мазок (смыв) из ротоглотки/носоглотки, мазок отделяемого язв при герпангине, образцы фекалий.

Этиологическая лабораторная диагностика включает выделение энтеровируса в культуре клеток с последующей идентификацией, выявление РНК вируса.

Сравнительная характеристика методов лабораторной диагностики. Выделение изолята вируса из биологического материала позволяет с наибольшей информативностью изучать его свойства. Для идентификации (определения серотипа) выделенного энтеровируса с целью изучения эпидемиологических аспектов инфекции используют иммунологический метод нейтрализации с помощью типоспецифических диагностических сывороток. Культуральные исследования, характеризующиеся высокой трудоемкостью, в настоящее время применяются преимущественно в научно-исследовательских целях, их применение затруднено ограниченным набором типоспецифических диагностических сывороток. Обнаружение РНК вируса методом ПЦР является более быстрым и доступным для практики подходом. Применение ПЦР также позволяет обнаружить РНК энтеровирусов, не размножающихся в культуре клеток.

Косвенные способы диагностики – оценка нарастания титров АТ в динамике заболевания не нашли широкого применения в диагностике энтеровирусной инфекции.

Показания к применению различных лабораторных исследований. Выявление РНК вируса методом ПЦР предпочтительно при обследовании пациентов для лабораторной диагностики энтеровирусных заболеваний.

Выделение вируса в культуре клеток показано при реализации программ эпидемиологического мониторинга циркулирующих изолятов энтеровирусов. В последние годы получает все более широкое распространение методов генетического типирования энтеровирусов. Такие исследования проводятся в ограниченном числе референтных лабораторий и применяются в основном для решения задач эпидемиологического мониторинга.

Особенности интерпретации результатов лабораторных исследований. Обнаружение энтеровирусов или их РНК в стерильных типах биологического материала (СМЖ, отделяемое везикул) имеет высокую диагностическую значимость. Выявление энтеровирусов или их РНК в нестерильных типах биологического материала (фекалии, респираторные мазки) часто не имеет этиологической связи с диагностируемым заболеванием, в связи с высоким уровнем их бессимптомного носительства в популяции.

Недопустимо подтверждение или исключение диагноза энтеровирусной инфекции, сопровождающейся любой неврологической симптоматикой, на основании результатов исследования нестерильных типов клинического материала. Для установления энтеровирусной инфекции с менингеальной симптоматикой должны учитываться только результаты исследования СМЖ. К сожалению, в действующей нормативно- методической документации СП 3.1.2950-11 данный основополагающий принцип интерпретации отражения не нашел. Рекомендации по интерпретации результатов лабораторных исследований изложенные в МУ 3.1.1.2363-08 по этой причине являются более приемлемыми для клинической практики.

При наличии специфической для некоторых форм энтеровирусной инфекции симптоматики (ящуроподобное заболевание, острый геморрагический конъюктивит, увеит и др.) интерпретация результатов исследования нестерильных типов клинического материала должна проводиться с учетом эпидемиологических и клинических данных.

Выявление энтеровирусов или их РНК в образцах фекалий и материале из рото/ носоглотки у пациентов со спорадической заболеваемостью не может служить основанием для подтверждения этиологии не только серозных менингитов, но и заболеваний верхних дыхательных путей, диарейных инфекций и лихорадочных заболеваний неясной этиологии, вследствие высокой частоты транзиторного носительства энтеровирусов в популяции.

Выявление энтеровирусов или их РНК в нестерильных типах клинического материала может служить подтверждением энтеровирусной инфекции при проведении исследований в ходе вспышки и при наличии у пациента характерной для нее клинической картины заболевания, а также в отсутствие вспышки, но при соответствии идентифицированного вируса специфичной клинической картине.

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, пользовательских данных (сведения о местоположении; тип и версия ОС; тип и версия Браузера; тип устройства и разрешение его экрана; источник откуда пришел на сайт пользователь; с какого сайта или по какой рекламе; язык ОС и Браузера; какие страницы открывает и на какие кнопки нажимает пользователь; ip-адрес) в целях функционирования сайта, проведения ретаргетинга и проведения статистических исследований и обзоров. Если вы не хотите, чтобы ваши данные обрабатывались, покиньте сайт.

! Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, пользовательских данных (сведения о местоположении; тип и версия ОС; тип и версия Браузера; тип устройства и разрешение его экрана; источник откуда пришел на сайт пользователь; с какого сайта или по какой рекламе; язык ОС и Браузера; какие страницы открывает и на какие кнопки нажимает пользователь; ip-адрес) в целях функционирования сайта, проведения ретаргетинга и проведения статистических исследований и обзоров. Если вы не хотите, чтобы ваши данные обрабатывались, покиньте сайт.

Методы лабораторной вирусологической диагностики энтеровирусных инфекций

Безопасность работы в лаборатории, выполняющей диагностические исследования энтеровирусных инфекций

Выполнение диагностических исследований энтеровирусных инфекций проводится в лабораториях, организациях, структурных подразделениях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение и лицензию на выполнение работ с микроорганизмами III - IV групп патогенности в соответствии с СП 1.2.731-99. "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами".

Клинические материалы для диагностических исследований энтеровирусных инфекций, могут быть потенциально инфицированы диким полиовирусом при работе с ними соблюдают правила нормативных документов:

- СП 3.1.2260-07 Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования материалов, инфицированных или потенциально инфицированных диким полиовирусом;

- СП 1.3.1325-03. Безопасность работы с материалами, инфицированными или потенциально инфицированными диким полиовирусом.

Основные рекомендации по работе лабораторий, выполняющих диагностические исследования энтеровирусных инфекций, содержатся в "Руководстве по лабораторным исследованиям полиомиелита. 4-е издание, ВОЗ, Женева 2005 г.", "Рекомендациях по эпидемиологическому надзору за энтеровирусами для поддержки программы ликвидации полиомиелита. ВОЗ, Женева 2005 г.".

Правила забора и транспортирования материала от больных для проведения лабораторных исследований

Сбор клинического материала и его упаковку осуществляет медицинский работник лечебно-профилактического учреждения. Забор производят в стерильные одноразовые флаконы, пробирки, контейнеры, стерильными инструментами.

Упаковка, условия хранения и транспортирования материала для проведения лабораторной диагностики энтеровирусной инфекции должны соответствовать требованиям СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности" и СП 1.3.1325-03 "Безопасность работы с материалами, инфицированными или потенциально инфицированными диким полиовирусом".

Пробы для выделения вируса берут с соблюдением предосторожностей для исключения контаминации одной пробы материалом другой этого же больного или материалом пробы другого обследуемого. Для отбора проб используют стерильную пластиковую посуду.

Образцы фекалий. Используют пробы фекалий массой (объемом) 1-3 г (1-3 мл). Фекалии забирают из предварительно продезинфицированного горшка или подкладного судна. Пробу в количестве 1 грамма (примерно) отдельным наконечником с аэрозольным барьером или одноразовыми лопатками переносят в специальный стерильный флакон. Две пробы фекалий для выделения вируса отбирают в течение 7 дней после начала болезни, но не позднее 14 дней, с интервалом 24-48 часов.

Мазки из ротоглотки. Мазки берут сухими стерильными зондами с ватными тампонами вращательными движениями с поверхности миндалин, небных дужек и задней стенки ротоглотки после предварительного полоскания полости рта водой.

После взятия материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную одноразовую пробирку с 500 мкл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида или раствора фосфатного буфера. Конец зонда отламывают или отрезают с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть крышку пробирки. Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают.

Смывы из носо/ротоглотки. Сбор материала производят в положении больного сидя с отклоненной назад головой. Для получения смыва из полости носа в оба носовых хода поочередно с помощью одноразового шприца вводят по 3-5 мл теплого стерильного 0,9% раствора натрия хлорида. Промывную жидкость из обоих носовых ходов собирают через воронку в одну стерильную пробирку. Не допускается повторное использование воронки без предварительного обеззараживания автоклавированием. Перед сбором материала необходимо предварительное полоскание полости рта водой. После этого проводят тщательное полоскание ротоглотки (в течение 10-15 сек) 8-10 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Жидкость собирают через воронку в стерильную пробирку. Не допускается повторное использование воронки без предварительного обеззараживания автоклавированием.

Спинномозговая жидкость. Забор СМЖ проводится в первые дни болезни при наличии клинических показаний в асептических условиях с использованием одноразовых пункционных игл. Для исследования отбирают 1 мл СМЖ.

Кровь. Первую пробу крови (5 мл) для серологической диагностики берут как можно раньше после начала болезни, вторую - на 3-4-й неделе, в стадии реконвалесценции.

Содержимое везикул. Для взятия материала везикулы участок кожи протирают спиртом. Пузырек прокалывают иглой или вскрывают скальпелем, собирают вытекающую жидкость на ватный тампон, которым также протирают везикулу. Для повышения информативности исследования необходимо собирать одним тампоном материал не менее чем с трех везикул. Тампон помещают в 1 мл транспортной среды.

В случае летального исхода забирают секционный материал - ткани головного, спинного и продолговатого мозга и варолиева моста, содержимое кишечника и ткань кишечной стенки. При необходимости исследуют другие материалы (ткань сердечной мышцы, печени, легких, и пр.). Ткани берут как можно раньше после смерти в заранее намеченном порядке для избежания их контаминации содержимым желудка и кишечника. Для иссечения тканей используют набор стерильных инструментов для каждой пробы. Объем пробы (кусочка) из тканей центральной нервной системы должен составлять примерно 1 ; из толстой кишки иссекается сегмент длиной 3-5 см, содержащий фекальные массы. Каждую пробу помещают в отдельный стерильный флакон с транспортировочной средой.

Пробы немедленно отправляют в лабораторию. Если отправка проб в лабораторию задерживается, их помещают в холодильник при температуре +4° - +8°С. Если время до отправки превышает 24 часа пробы замораживают и соблюдают эти условия во время транспортировки. Сыворотки без добавления консервантов хранят при 4° или в замороженном виде.

Транспортировку осуществляют в строгом соответствии с СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности".

При транспортировке материалов в лабораторию соблюдают принцип "тройной упаковки":

1) первичная емкость - маркированный контейнер/пробирка/флакон с пробой, надежно закрытая крышкой, герметизированной лабораторной пленкой или парафином;

2) вторичная емкость - прочный водонепроницаемый, непротекающий контейнер (или полиэтиленовый пакет) с поглощающим материалом в достаточном количестве для сорбции всей жидкости в случае повреждения упаковки. Во вторичную емкость помещают контейнер/пробирку/флакон с пробой. Образцы от одного пациента упаковываются отдельно. Также во вторичную емкость помещают направление на исследование, вложенное в полиэтиленовый пакет, где указано ФИО, возраст и адрес проживания больного, дата начала заболевания, дата отбора материала, предварительный клинический диагноз, дата последней иммунизации против полиомиелита.

3) внешняя упаковка - прочный термоизолирующий контейнер или термос. Для обеспечения температурных условий, в термоконтейнеры помещают охлаждающие элементы или пакеты со льдом. На внешней поверхности термоконтейнера укрепляют этикетку с указанием адреса, телефона, факса, электронной почты отправителя, адреса, телефона, факса, электронной почты получателя, условий транспортировки и знак биологической опасности.

Перед отправкой материалов отправитель должен проинформировать получателя о планируемой отправке и ее сроках. Недопустимо отправлять материалы без предварительной договоренности с получателем.

Выделение энтеровирусов и выявление геномных последовательностей энтеровирусов

Универсальной культуры клеток (или культуральной системы), пригодной для выделения всех энтеровирусов, не существует. Ряд штаммов энтеровирусов могут быть выделены только in vivo с использованием чувствительных лабораторных животных. Обобщенные сведения о чувствительности наиболее распространенных в лабораториях перевиваемых культур клеток к различным энтеровирусам представлены в таблице 1.

Таблица 1. Чувствительность перевиваемых культур клеток к различным энтеровирусам

Проявление цитопатогенного эффекта на культуре клеток

Анализ на энтеровирусную инфекцию является одним из распространенных лабораторных методов в силу частого заражения этим возбудителем. Для уточнения диагноза используются различные способы диагностики.

Основные методы диагностики

Чтобы подтвердить диагноз энтеровирусной инфекции, применяют методы лабораторной диагностики: специфические вирусологические методики.

Инфекцию может вызвать содержащий рнк энтеровирус или семейство аденовирусов, которые поражают как слизистую оболочку кишечника, так и ткани верхних дыхательных путей, глаз. По этой причине материалом для исследования является не только кал, но и смывы с носоглотки и конъюнктивы.

Если подозревается энтеровирусная инфекция, диагностика проводится в первые дни от начала заболевания, когда концентрация вирусов является наибольшей.

Чтобы дифференцировать инфекцию применяются такие серологические методы:

определение иммуноглобулинов к вирусу;
выделение аденовирусов в кале;
ПЦР-диагностика;
иммунофлуоресцентный метод.

Особенностью при инфицировании аденовирусной инфекцией является длительное выделение возбудителя и вирусоносительство после исчезновения симптомов болезни. По этой причине через 2-3 недели после заболевания обследование необходимо повторить, что важно для профилактики повторного заражения в коллективе. Инфицированию больше подвержены дети в возрасте до 14 лет.

Определение антител (иммуноглобулинов) к аденовирусам проводится методом иммуноферментного анализа (ИФА). Такая диагностика основана на способности организма вырабатывать защитные белки (антитела, иммуноглобулины) в ответ на заражение. С помощью специально подобранных реактивов можно определить наличие антител к определенному типу возбудителя. Кроме диагностики аденовирусной инфекции в целом, можно определить серотип возбудителя.

Для сдачи анализа в стерильную емкость набирается венозная кровь. Забор материала необходимо проводить натощак, а интервал после приема пищи должен быть не меньше 8 часов. За 24 часа до исследования нельзя принимать алкоголь. Для профилактики искажений результата не стоит проводить анализ после физиотерапевтических процедур, флюорографии и других рентгенологических исследований.

Позитивный результат подтверждается наличием иммуноглобулинов класса IgG. Эти антитела образуются в крови человека разу после заражения, а в периоде острой фазы болезни концентрация их резко повышается.

Метод парных сывороток – это диагностический способ определить острую фазу энтеровирусной инфекции в течение первых 2-х недель от заражения. Для этого исследуется динамика нарастания концентрации антител с интервалом от 10 дней до 2 недель. В случае значительного роста подтверждается наличие свежей инфекции. Чувствительность такого метода составляет 90%.

Кроме того, рост IgG отмечается при реактивации латентной инфекции. По мере выздоровления концентрация антител в крови падает, но они циркулируют еще продолжительно время, указывая на перенесенную инфекцию.

Стойкого иммунитета к энтеровирусной инфекции нет, а при повторном заражении отмечается повторный стремительный рост специфических IgG.

Энтеровирусы и аденовирусы вызывают кишечные формы заболевания или по мере развития инфекции она распространяется на слизистую оболочку кишечника, вызывая характерные симптомы.

Из-за недостаточного выполнения норм личной гигиены инфекцией чаще заражаются маленькие дети, у которых распространенным путем передачи является фекально-оральный.

К высокой температуре, явлениям катара верхних дыхательных путей и конъюнктивита присоединяется учащенное испражнение. Больного беспокоит диарея, водянистый светлый кал, боли в животе.

Такие симптомы являются показанием для лабораторной диагностики энтеровируса. Исследование необходимо проводить не позже 3 – 5 дня после появления симптомов. Через неделю болезни концентрация энтеровируса в кале уменьшается, что может снижать качество диагностики.

Тем не менее после выздоровления переболевший является источником инфекции, так как отмечается вирусоносительство, а возбудитель продолжает выделяться с калом.

Анализ также проводится для выделения конкретного возбудителя – для человека патогенными считаются несколько серотипов вируса.

Перед сдачей анализа необходимо помочиться, чтобы исключить попадание мочи в исследуемый материал. Для диагностики необходим свежий стул не более 15 г. Его набирают в специальный контейнер. Анализ должен пройти лабораторную диагностику не позже чем через 3 часа после забора материала.

Перед сбором кала нельзя применять любые препараты, влияющие на работу кишечника (слабительные или закрепляющие), а также делать клизмы. Прием дополнительных препаратов накануне забора материала, примеси мочи или других биологических жидкостей могут повлиять на конечный результат, сделав его недостоверным.

Результатом диагностики является положительный или отрицательный ответ. В первом случае врач может подтвердить диагноз и приступить к целенаправленному лечению болезни. В случае негативного результата, но при продолжающихся симптомах необходимо повторное проведение исследования.

Диагностика энтеровирусной инфекции современной методикой цепной полимеразной реакции является одним из наиболее достоверных и быстрых способов.

Этот тест основан на обнаружении вирусной ДНК в крови человека или мазке из зева. С его помощью возможна как диагностика острых форм болезни, так и определение вирусоносительства.

Анализ на энтеровирус методом ПЦР является “золотым стандартом” вирусологической диагностики. Этим способом проводится дифференциальная диагностика энтеровирусной инфекции.

Больной не нуждается в специальной подготовке, однако перед забором материала необходимо следовать некоторым правилам:

исследование рекомендовано проводить натощак и с интервалом не менее 8 часов после еды;
желательно не принимать какие-либо препараты за сутки до сдачи крови;
отказ от приема алкоголя за день до исследования и курения не менее чем за час до забора крови;
отказ от физических и психических перенапряжений накануне диагностики;

Нежелательно осуществлять забор крови после физиотерапевтического лечения или инструментальных исследований. В случае проведения биопсии следует сделать паузу на несколько дней.

Если доктор назначил проведение повторного лабораторного исследования, желательно делать это в одинаковых условиях: в той же лаборатории, в одно и то же время.

Метод иммунофлюоресценции основан на реакции со специальными реагентами, которые помечены красителем. Он применяется в рамках ранней диагностики энтеровирусной инфекции. Для исследования проводят соскоб со слизистой носа.

При определении энтеровирусов в организме человека во время микроскопии мазок подсвечивают ультрафиолетовыми лучами. Этот метод является способом экспресс-диагностики инфекции.

Специальные реактивы содержат антитела против энтеровирусов. При связывании антигенов и антител образовавшиеся комплексы становятся хорошо видимыми в ультрафиолетовом свете.

Такой тест имеет три разновидности:

Для проведения прямого способа диагностики к материалу анализа добавляют люминесцентный реактив. Образовавшиеся комплексы рассматривают через флуоресцентный микроскоп. При том анализе определяют наличие вирусных антигенов.

Тест при непрямой реакции определяет наличие антител в собранном материале. Реагентом выступает специальный антиген, который взаимодействует с антителами, выработанными в организме человека.

При конкурентном способе исследуют наличие вирусных антигенов. Отличие способа состоит в добавлении двух реагентов: антител и специальных меченых антигенов, которые конкурируют в реакции связывания.

Заключение

Точное диагностирование энтеровирусной инфекции необходимо для дифференциального диагноза и правильного назначения терапии. Современные методы позволяют сделать это быстро и качественно.

Читайте также: