Титрование вирусов что это

Согласно Львову, "организм - некая независимая единица интегрированных и взаимосвязанных структур и функций". У простейших, то есть у одноклеточных именно клетка является независимой единицей, иными словами, организмом. И клеточные организмы - митохондрии, хромосомы и хлоропласты - это не организмы, ибо они не являются независимыми. Получается, что если следовать определению, данным Львовым, вирусы не являются организмами, так как не обладают независимостью: для выращивания и репликации генетического материала нужна живая клетка.

В то же время, у многоклеточных видов независимо от того, животные или растения, отдельные линии клеток не могут эволюционировать независимо друг от друга; следовательно, их клетки не являются организмами. Для того чтобы изменение было эволюционно значимым, оно должно быть передано новому поколению индивидуумов. В соответствии с этим рассуждением организм представляет собой элементарную единицу некоторого непрерывного ряда со своей индивидуальной эволюционной историей

Вирус обретает относительно независимую эволюционную историю благодаря его способности к адаптации в направлении, ведущим к приобретению им способности передаваться от хозяина к хозяину. Он может пережить клетку или организм, в которых паразитирует; фактически вирус часто "эксплуатирует" клетку. Один вирус может встречаться в разных видах, родах и типах и также один и тот же вирус может передаваться от растений насекомым и размножаться в клетках тех и других. Вирус, обладающий соответствующей приспособляемостью, может использовать разнообразные эволюционные ниши. Таким образом, вирус, конечно, обладает большей независимостью, чем любая клеточная органелла. То есть, в эволюционном плане вирус в большей степени организм, чем хромосома или даже клетка многоклеточного животного, хотя функционально он значительно менее независим, чем любая такая клетка.

И в то же время, можно рассматривать данную проблему с точки зрения другого определения: материал является живым если, будучи изолированным, он сохраняет свою специфическую конфигурацию так, что эта конфигурация может быть реинтегрирована, то есть вновь включена в цикл, в котором участвует генетическое вещество: это отождествляет жизнь с наличием независимого специфического самореплицирующегося способа организации. Специфическая последовательность оснований нуклеиновой кислоты того или иного гена может копироваться; ген - это некая часть запасов информации, которой располагает живой организм. В качестве теста на живое данное выше определение предлагает воспроизведение в различных клеточных линиях и в ряде поколей организмов. Вирус, согласно этому тесту, живой точно так же, как и любой другой фрагмент генетического материала, что его можно извлечь из клетки, вновь ввести в живую клетку и что при этом он будет копироваться в ней и станет хотя бы на некоторое время часть ее наследственного аппарата. При этом передача вирусного генома составляет основной смысл существования этих форм - результат их специализации в процессе отбора. Поэтому специализированность вирусов как переносчиков нуклеиновых кислот дает возможность считать вирусы "более живыми", чем какие либо фрагменты генетического материала, и "более организмами", чем любые клеточные органеллы, включая хромосомы и гены.

Каковы же те основные положения, сформулированные Робертом Кохом (1843-1910), которых должен придерживаться микробиолог при каждом обнаружении неизвестного возбудителя ? Что может служить доказательством, что именно он является причиной данного инфекционного заболевания ? Вот эти три критерия:

Неоднократное получение чистой культуры возбудителя, взятого из организма больного.

Возникновение точно такого же или сходного заболевания (как по характеру течения, так и по вызываемым им патологическим изменениям) при инфицировании здорового организма культурой предполагаемого возбудителя.

Появление в организме человека или животного после их заражения данным возбудителем всегда одних и тех же специфических защитных веществ. При контакте иммунной сыворотки крови с возбудителем из культуры последний должен терять свои патогенные свойства.

Для современной вирусологии характерно бурное развитие и широкое применение самых различных методик - как биологических (включая генетические), так и физико-химических.. Они используются при установлении новых, до сих пор еще неизвестных вирусов, и при изучении биологических свойств и строения уже обнаруженных видов.

Фундаментальные теоретические исследования дают обычно важные сведения, которые используются в медицине, в области диагностики или при глубоком анализе процессов вирусной инфекции. Введение новых действенных методов вирусологии связано, как правило, с выдающимися открытиями.

Так например, метод выращивания вирусов в развивающемся курином эмбрионе, впервые примененный А. М. Вудрофом и Е. Дж. Гудпэсчуром в 1931 году, был с исключительным успехом использован при изучении вируса гриппа.

Прогресс физико-химических методов, в частности метода центрифугирования, привел в 1935 году к возможности кристалмуации вируса табачной мозаики (ВТМ) из сока больных растений, а в последствии и к установлению входящих в его состав белков. Этим был дан первый толчок к изучению строения и биохимии вирусов.

В 1939 году А. В. Арден и Г. Руска впервые применили для изучения вирусов электронный микроскоп. Введение этого аппарата в практику означало исторический перелом в вирусологических исследованиях, поскольку появилась возможность увидеть - хотя в те годы еще и недостаточно четко - отдельные частицы вируса, вирионы.

В 1941 году Г.Херст установил, что вирус гриппа при известных условиях вызывает агглютинацию (склеивание и выпадение в осадок) красных кровяных телец (эритроцитов). Этим была положена основа для изучения взаимоотношений между поверхностными структурами вируса и эритроцитов, а также для разработки одного из наиболее эффективных методов диагностики.

Коренной перелом и вирусологических исследованиях произошел в 1949 г., когда Дж. Эндерсу, Т. Уэллеру и Ф. Роббинсу удалось размножить вирус полиомиелита в клетках кожи и мышц человеческого зародыша. Они добились разрастания кусочков ткани на искусственной питательной среде. Клеточные (тканевые) культуры были инфицированы вирусом полиомиелита, который до этого изучали исключительно на обезьянах и лишь очень редко на особом виде крыс.

Вирус в человеческих клетках, выращенных вне материнского организма, хорошо размножался и вызывал характерные патологические изменения. Метод культуры клеток (длительное сохранение и выращивание в искусственных питательных средах клеток, выделенных из организма человека и животных) был впоследствии усовершенствован и упрощен многими исследователями и стал, наконец, одним из наиболее важных и результативных для культивирования вирусов. Благодаря этому более доступному и дешевому методу появилась возможность получать вирусы в относительно чистом виде, чего нельзя было достичь в суспензиях из органов погибших животных. Введение нового метода означало несомненный прогресс не только в диагностике вирусных заболеваний, но и в получении прививочных вакцин. Он дал также неплохие результаты и в биологических и биохимических исследованиях вирусов.

В 1956 году удалось показать, что носителем инфекционности вируса является содержащаяся в нем нуклеиновая кислота. А в 1957 году А.Айзекс и Дж. Линдеман открыли интерферон, который позволил объяснить многие биологические явления, наблюдаемые в отношениях между вирусом и клеткой - хозяином или организмом - хозяином.

С. Бреннер и Д. Хорн ввели в технику электронной микроскопии метод негативного контрастного окрашивания, сделавший возможным изучение тонкого строения вирусов, в частности их структурных элементов (субъединиц).

В 1964 году уже упоминавшийся нами ранее американский вирусолог Гайдузек с сотрудниками доказал инфекционный характер ряда хронических заболеваний центральной нервной системы человека и животных. Он изучал недавно обнаруженные своеобразные вирусы, лишь в некоторых чертах схожие с ранее известными.

В то же время американский генетик Барух Бламберг обнаруживает (в процессе генетических исследований белков крови) антиген сывороточного гепатита (австралийский антиген), вещество, идентифицируемое при помощи серологических тестов. Этому антигену суждено было сыграть большую роль в вирусологических исследованиях гепатита.

В последние годы одним из крупнейших успехов вирусологии можно считать раскрытие некоторых молекулярно-биологических механизмов превращения нормальных клеток в опухолевые. Не меньшие успехи были достигнуты и в области изучения строения вирусов и их генетики.

Наименьшее количество вируса, способное в данном опыте вызвать инфекцию, называется инфекционной единицей.

Для ее определения применяются обычно два метода. Первый основан на определении 50 %-ной летальной дозы, которая обозначается LD 50 (от лат. Letatis - смертельная, dosis - доза). Второй метод устанавливает число инфекционных единиц по числу бляшек, образовавшихся в культуре клеток.

Что, в сущности, представляет собой величина LD 50 и как она определяется? Исследуемый вирусный материал разводится в соответствии со снижающимися степенями концентрации, скажем кратными десяти: 1:10; 1:100; 1:1000 и т.д. Каждым из растворов с указанными концентрациями вируса инфицируют группу животных (десять индивидуумов) или культуру клеток в пробирках. Потом наблюдают гибель животных или изменения, происшедшие в культуре под влиянием вируса. Статистическим методом определяется степень концентрации, способная умертвить 50 % животных из числа зараженных исходным материалом. При использовании культуры клеток следует найти такую дозу вируса, которая производит губительное действие на 50 % инфицированных ею культур. В этом случае употребляется сокращение ЦПД 50 (цитопатическая доза). Иначе говоря, речь идет о такой дозе вируса, которая вызывает повреждение или гибель половины инфицированных ею культур.

Методом бляшек нельзя получить статистические данные, но можно установить фактическое число единиц вируса в материале, дающем бляшки в культуре клеток. В идеальном случае такая единица отвечает одной функционально полноценной частице.

Индуцируемая вирусом реакция может происходить по типу "все или ничего" (то есть наличие или отсутствие инфекции), а может быть выражена количественно, например продолжительностью времени, необходимого проявления инфекции, или числом поражений в слое чувствительных клеток. Количественное определение вирусной активности называется титрованием. Титр исходной вирусной суспензии выражается числом инфекционных единиц, приходящихся на единицу объема. Инфекционные нуклеиновые кислоты, независимо от того выделены ли они из фагов или из вирусов животных или растений, как правило, обладают значительно меньшим инфекционным титром, чем исходный вирус (то есть отношение числа содержащихся в препарате молекул нуклеиновой кислоты к числу инфекционных единиц значительно больше, чем соответствующие величины для вирионов, из которых эти нуклеиновые кислоты были выделены). Однако и при титровании свободной нуклеиновой кислоты и при титровании вирионов вероятность нахождения в пробе среднего числа частиц выражается одной формулой. Отсюда следует, что вирусную инфекцию может вызвать также и одна молекула вирусной нуклеиновой кислоты. Как правило, инфекционными являются только интактные вирусные ДНК и РНК. Исключение наблюдается при множественном заражении клеток молекулами нуклеиновой кислоты, содержащими неполным геном вируса.

Резюмируя сказанное, можно прийти к выводу, что титр вирусной суспензии, выраженный числом инфекционных единиц, содержащихся в единице объема, как правило, соответствует числу вирионов (или числу молекул вирусной нуклеиновой кислоты), способных при условиях данного опыта вызвать инфекцию.

Как правило, чувствительность вирионов данного вируса к действию тех или иных инактивирующих веществ определяется специфическими свойствами его белков, вследствие чего методы инактивации инфекционности, разработанные для данного конкретного вируса, эффективны лишь в отношении близкородственных ему вирусов. Исключение составляет чувствительность вирусов к рентгеновским лучам, которая зависит от типа нуклеиновой кислоты вирионов и ее количества. В основе этой закономерности лежит тот факт, что действие рентгеновских лучей приводит к разрыву молекул нуклеиновой кислоты, и даже одного такого разрыва часто бывает достаточно для утраты инфекционного вируса. Результаты экспериментов показывают, что мелкие вирусы инактивируются рентгеновскими лучами значительно эффективнее, так как для них характерна большая величина отношения содержания в вирионе нуклеиновой кислоты к содержанию в нем белка, чем для крупных вирионов, более богатых белком.

В целях определения вида данного вируса при изучении защитных процессов в организме больного человека или зараженного животного применяются серологические методы. Серология (от лат. Serum - сыворотка, жидкая составная часть крови) - это раздел иммунологии, изучающий реакции антигена специфическими защитными веществами, антителами, которые находятся в сыворотке крови. Антитела нейтрализуют действие вируса. Они связываются с определенными антигенными веществами, находящимися на поверхности вирусных частиц. В результате связывания молекул антител с поверхностной структурой вируса последний теряет свои патогенные свойства. Для установления уровня (количества) антител в сыворотке или определения типа данного вируса проводится реакция нейтрализации вируса . Ее можно проводить как на животных, так и на культуре клеток.

Минимальную концентрацию сыворотки, содержащей антитела, достаточную для того, чтобы нейтрализовать вирус, не дать ему проявить цитопатическое действие, называют титром сыворотки, нейтрализующей вирус. Эта концентрация может быть выявлена и с помощью метода бляшек.

Для обнаружения антител используется метод торможения гемагглютинации (склеивания эритроцитов под воздействием вируса) и метод связывания комплемента. Из методов, применяемых в вирусологии для различных исследовательских целей, можно еще упомянуть методы, при помощи которых вирусологический материал подготавливается для физических и химических анализов, которые облегчают изучение тонкого строения и состава вирусов. Эти анализы требуют большого количества совершенно чистого вируса. Очистка вируса - процесс, при котором из суспензии с вирусом устраняются все посторонние, загрязняющие ее частицы. В основном это кусочки и "обломки" клеток - хозяев. Одновременно с очисткой происходит обычно сгущение суспензии, повышение концентрации вируса. Так получается исходный материал для многих исследований.

Из отдельных методов очистки упомянем лишь наиболее эффективный - метод ультрацентрифугирования, который дает препараты вируса очень высокой концентрации.

Опишем вкратце процедуру получения и очистки вирусной суспензии. Процесс этот начинается с искусственного введения вируса в мозг подопытного животного. По прошествии нескольких дней вирус размножится в ткани мозга. При этом обнаружатся характерные нарушения функций нервной системы "хозяина", и у животного выявятся признаки заболевания. Когда симптомы достигнут наибольшего развития, зверька умерщвляют, а его мозг, в тканях которого содержатся большие количества вируса, извлекают в стерильных условиях из черепа животного. Затем из мозга готовится, скажем ,10 %-ная суспензия. Кроме вирионов она содержит еще и большое количество кусочков нервной ткани, остатки кровеносных сосудов, кровяные тельца и другие биологические компоненты. Кусочки ткани и другие крупные частицы устраняются первым центрифугированием со скоростью 5000-10000 оборотов в минуту. Оно продолжается около получаса. Жидкость над осадком (суперкатакт) осторожно сливают в специальные пробирки для центрифугирования, сделанные из пластмассы или нержавеющей стали, поскольку стекло не выдерживает давление, которое развивается при высокоскоростном центрифугировании. А осадок обезвреживают дезинфицирующими средствами. Слитый "супернатант" обрабатывается затем уже в ультрацентрифуге.

Для седиментации мельчайших вирусов необходимо многочасовое ультрацентрифугирование, причем полученный осадок часто бывает не больше булавочной головки. Но и после такой обработки мы имеем не совсем чистый вирусный материал, в нем еще содержатся чужеродные примеси. Для тонких анализов этот осадок надо несколько раз обработать различными реактивами и повторить ультрацентрифугирование. Только тогда можно получить концентрированную суспензию вируса высокой чистоты, которая требуется для точных и достоверных биохимических, кристаллографических анализов или для наблюдений в электронно-оптических приборах.

В распоряжении вирусологов вообще много различных технических приспособлений, как , например , центрифугирование по градиентам концентрации, когда вирионы разделяются по степеням концентрации или по форме. Другой прибор, представляющий в наше время стандартное оборудование почти каждой научно-исследовательской вирусологической лаборатории - электронный микроскоп. Это дорогостоящий, большой и сложный аппарат.

Для получения изображения вирусов существует много различных методов, и все они прошли свои этапы развития. Чтобы обнаружить вирионы в клетках, в настоящее время пользуются методом ультратонких срезов Фиксированный материал, залитый эпоксидной смолой, разрезается тончайшим стеклянным или алмазным ножом. При помощи точных ультрамикротомов одну клетку можно разрезать более чем на тысячу тонких срезов. Полученные таким образом срезы обрабатываются затем специальными химикалиями, что обеспечивает лучшую их видимость.

Для наблюдения тонкого строения отдельных вирионов применяется метод негативного контрастирования (окрашивания), внедрение которого значительно повысило качественный уровень электронного микроскопирования. Вирусные частицы при этом осторожно смешиваются с раствором фосфовольфрамовой кислоты, дающей осадок, не пропускающий электронные лучи. В результате вирионы предстают в виде своих совершенно точных отпечатков, по которым можно изучать самые тонкие детали их поверхностей. При методе позитивного окрашивания (или "металлизирования" препарата) применяются такие вещества, которые способны выборочно прилипать к поверхности вирионов (например, специфические антитела, меченные ферритином, содержащим в своей молекуле железо и потому хорошо различимые в электронном микроскопе).

Титрование вирусов гриппа в реакции гемагглютинации

Как и многие другие вирусы животных, вирусы гриппа агглютинируют эритроциты. В основе агллютинации лежит взаимодействие гемагглютинина, одного из поверхностных вирусных белков, с рецепторами, расположенными на поверхности эритроцитов. Поскольку каждая вирусная частица содержит не одну молекулу гемагглютинина, образующего шиловидные выступы, при достаточно высокой концентрации вируса формируются крупные агрегаты эритроцитов со структурой типа сети.

Образование таких агрегатов легко наблюдать в лунке или пробирке с U-образным дном; в этом случае нормальные эритроциты образуют компактный осадок на дне пробирки, а агглютинированные оседают равномерно. Эта реакция исключительно удобна для количественного определения вируса.

Для постановки гемагглютинации определенное количество эритроцитов смешивают в лунках планшета с равным объемом исследуемой суспензии вируса в разных разведениях. Планшет затем инкубируют 30--45 мин при комнатной температуре без перемешивания. По результатам реакции можно определить, при каком разведении вирусного препарата утрачивается гемагглютинирующая активность. Количество вируса, агглютинирующее 50% эритроцитов, определяется как 1 гемагглютинирующая единица.

Таким образом, зная, какое разведение вируса соответствует одной ГАЕ, можно вычислить титр вируса в ГАЕ/мл. Значение ГАЕ зависит от условий анализа, в частности от объема реакционной смеси и концентрации эритроцитов; кроме того, постановка реакции в разных лабораториях может иметь свои особенности. Ниже приведена методика, постоянно используемая в лаборатории авторов.

ГАЕ -- удобная единица для сравнения разных препаратов вируса, однако она не определяет ни общего количества вируса в препарате, ни количества инфекционных частиц. Тем не менее для любого конкретного штамма вируса соотношение между ГАЕ и другими единицами измерения количества вируса может быть определено эмпирически; затем, если вирус не претерпел генетических изменений, титр в ГАЕ можно использовать для расчета других параметров. Для большинства лабораторных штаммов вируса гриппа выполняется следующее приблизительное соотношение:

1 ГАЕ = 2-10 единиц инфекционности для куриных эмбрионов =2 10 БОЕ = 10 физических единиц.

В реакции можно использовать эритроциты различного происхождения, например человека или морской свинки, но чаще всего используют куриные эритроциты. 1%-ную суспензию готовят следующим образом.

• 1. Кровь фильтруют через два слоя муслина.
• 2. Фильтрат центрифугируют 5 мин в настольной центрифуге при 1500 об/мин.
• 3. Супернатант и верхний слой осадка, состоящий из лейкоцитов, удаляют с помощью пастеровской пипетки, присоединенной к водоструйному насосу. Клетки 3 раза промывают физиологическим раствором, суспензируя осадок и повторно осаждая эритроциты при 1500 об/мин.
• 4. Эритроциты ресуспендируют в физиологическом растворе и получают плотный осадок центрифугированием при 2500 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывают, а осадок эритроцитов суспендируют в 100-кратном объеме физиологического раствора. Суспензию тщательно перемешивают и хранят при 4°С.

• 1. В лунках планшета готовят последовательные двукратные разведения вирусной суспензии с неизвестным титром на физиологическом растворе; объем суспензии в каждой лунке должен быть равен 0,25 мл. В опыт включают также и контрольную лунку с физиологическим раствором.
• 2. 1%-ную суспензию эритроцитов интенсивно встряхивают и вносят в каждую лунку в количестве 0,25 мл. Смесь в лунках перемешивают, поворачивая планшет, и инкубируют планшет 45 мин без дальнейшего перемешивания на листе белой бумаги.

В предельном разведении, обладающем гемагглютинирующей активностью, наблюдается один из трех типов агглютинации, что можно использовать для приблизительного расчета титра вируса.

Более экономным методом определения титра является микровариант этой реакции, в котором используется по 0,05 мл суспензии вируса и эритроцитов; реакцию можно ставить в микропланшете для титрования. Следует, однако, иметь в виду, что в этом случае одна ГАЕ определяется как количество вируса в объеме 0,05 мл, агглютинирующее 50% эритроцитов в 0,05 мл 1%-ной суспензии.

Факторы, влияющие на результат реакции гемагглютинации.

Результаты реакции гемагглютинации могут искажаться лод действием ряда факторов.

• 1. Существенно, чтобы перед использованием кровь не хранилась слишком долго. Через 5--7 дней в ней начинается гемолиз, что делает исследование гемагглютинации сначала неточным, а затем вообще невозможным.
• 2. Поскольку при низкой концентрации эритроцитов получают завышенные значения титра вируса, суспензию эритроцитов перед использованием необходимо тщательно перемешать.
• 3. Учет результатов реакции не следует откладывать надолго. Помимо гемагглютинина на поверхности вирионов вируса гриппа локализован фермент нейраминидаза, отщепляющий *от олигосахаридов концевые остатки сиаловой кислоты. Поскольку гемагглютинин присоединяется к поверхности эритроцитов именно через остатки сиаловой кислоты, действие нейраминидазы нарушает связи между вирионами и клетками. Поэтому через некоторое время слой агглютинированных эритроцитов начинает разрушаться. Некоторые штаммы вируса гриппа имеют столь высокую нейраминидазную активность, что быстрое удаление клеточных рецепторов препятствует агглютинации при комнатной температуре. В этом случае рекомендуется ставить реакцию гемагглютинации при 4°С.
• 4. Результат реакции может быть искажен, если используемые планшеты недостаточно хорошо вымыты. Сразу же после окончания работы планшеты следует замочить на 1 ч в 4%-ном растворе NaOH, а затем тщательно промыть дистиллированной водой.
• 5. Вирусная суспензия может содержать вещества, специфически или неспецифически ингибирующие гемагглютинацию. Эта проблема особенно серьезна при титровании вируса в культуральной жидкости, поскольку входящая в состав питательных сред сыворотка крови содержит подобные ингибиторы. Многие из них могут быть инактивированы прогреванием сыворотки при 56 °С 30 мин; подробнее этот вопрос обсуждается в работе Хойла. В некоторых случаях, однако, возникает противоположная ситуация: некоторые препараты сывороток содержат факторы, вызывающие гемагглютинацию в отсутствие вируса. Поэтому необходимо одновременно с вирусом титровать образец среды от незараженных клеток.
• 6. Следует помнить, что и вирусы других семейств агглютинируют эритроциты и могут препятствовать проведению специфической реакции. Природу исследуемого вируса можно, разумеется, установить в реакции торможения гемагглютинации с использованием специфической антисыворотки против интересующего исследователя вируса.

Реакция торможения гемагтлютинации.

Способность вируса гриппа связывать и агглютинировать эритроциты можно использовать и для определения концентрации противовирусных антител в образцах сыворотки. Для этого проводят реакцию между последовательными разведениями сыворотки и известным количеством вируса, а затем добавляют суспензию эритроцитов; концентрацию антител определяют, исходя из последнего разведения сыворотки, еще способного тормозить гемагглютинацию.

• 1. Готовят последовательные двукратные разведения исследуемой сыворотки на физиологическом растворе. В зависимости от того, выполняется анализ в стандартных планшетах или в микропланшетах, объем каждого разведения должен составлять соответственно 0,25 или 0,05 мл.
• 2. В каждую лунку вносят по 4 ГАЕ стандартного вируса '. Антитела инкубируют с вирусом 30 мин при комнатной температуре.
• 3. В каждую лунку вносят нужное количество 1%-ной суспензии эритроцитов, перемешивают и продолжают инкубацию еще 30 мин.
• 4. Учитывают результаты и определяют концентрацию антител, исходя из последнего разведения сыворотки, еще способного тормозить гемагглютинацию.

Примечание. Следует включать в опыт соответствующие контроли, чтобы убедиться в правильности определения концентрации вируса, в том, что сыворотка сама по себе не вызывает гемагглютинации и что в отсутствие вируса эритроциты нормально оседают.

Ознакомление с методикой титрования вирусов.

Оборудование и материалы

Задачи на определение титра вируса в ЭД₅₀ по фактическим данным, выписанным на карточки (на каждого студента по одной карточке, всего не менее 10 вариантов задач); аллантоисная жидкость куриных эмбрионов, зараженных вирусом ньюкаслской болезни; 1- процентная суспензия отмытых эритроцитов кур; физиологический раствор (изотонический раствор NaCl); плексигласовые панели с лунками; градуированные пипетки на 1 мл; резиновые груши; сосуды с дезраствором; карандаши для записи по стеклу, калькуляторы, логарифмические таблицы, мультимедийное оборудование, презентации MS Office Power Point по теме занятия.

Методика проведения занятия и методические указания по теме.

В лабораторных работах с вирусами, биофабричном производстве и в ветеринарной практике постоянно возникает необходимость определения количества вирусов в том или ином материале. Без такого определения невозможны экспериментальное заражение вирусами живых лабораторных систем, производство живых и инактивированных противовирусных вакцин и диагностических препаратов, оценка активности живых противовирусных вакцин, получение иммунных сывороток и многие другие работы.

Количество вируса в каком-либо материале определяют по титру вируса в этом материале. Под титром вируса понимают выражение его концентрации в материале.

Титр вируса - это количество вируса, содержащееся в единице объема материала

Поскольку количество вируса невозможно выразить в обычно применяемых (объем, масса и т. и.) единицах, прибегают к измерению в единицах действия или единицах активности. Вирусы обладают инфекционным и гемагглютинирующим действием. Отсюда и единицы количества вирусов инфекционные и гемагглютинирующие.

Размерность этих единиц зивисит от соотношения полноценных и неполноценных вирионов в используемой суспензии, объекта, способа титрования и других факторов. В практике нашли применение три типа единиц количества вируса: 1-й - инфекционные единицы локальных повреждений, вызываемых вирусами и оцениваемых по единичному эффекту; 2-й - инфекционные единицы 50-процентного действия вирусов на чувствительные живые объекты, оцениваемые статистически; 3-й - гемагглютинирующие единицы.

Из локальных повреждений, вызываемых вирусами, наиболее известны бляшки в зараженных культурах клеток (островки мертвых клеток в слое живых) и оспины (некротические узелки) на ХАО куриных эмбрионов, зараженных оспенными и некоторыми другими вирусами. В случаях такого проявления инфекционной активности вирусов количество вируса может быть измерено в бляшкообразующих единицах (БОЕ) или оспообразующих единицах (ООЕ). Одна БОЕ равна дозе вируса, способной вызвать образование одной бляшки, а одна ООЕ - одной оспины.

Наиболее универсален метод определения титра вируса в единицах 50-процентного инфекционного действия. По этому методу за единицу количества вируса принимается такая его доза, которая способна вызывать инфекционный эффект у 50 % зараженных тест-объектов. Она обозначается как ЭД₅₀ - эффективная 50-процентная доза.

Число таких доз вируса в единице объема материала и будет выражать титр вируса в этом материале.

Таблица 6 - Виды единиц количества вирусов при определении _ по 50-процентному инфекционному действию_

Виды инфекционного действия вирусов

Единицы количества вирусов

50-процентная летальная доза

Клинические симптомы или патологоанатомические изменения

50-процентная эмбриональная летальная доза

В качестве тест-объектов в лабораториях обычно используют белых мышей, куриные эмбрионы и культуры клеток, у которых инфекционное действие вируса может проявляться гибелью, клиническими симптомами, патологоанатомическими изменениями и цитопа- тическим эффектом. Для каждого вируса подбирают чувствительный к нему тест-объект и форму учета его инфекционного действия, по которой оценивают эффект заражения. В зависимости от вида тест- объекта и формы проявления инфекционного действия ЭД50 принимает один из следующих видов, приведенных в таблице 6.

• 1 ЛД50 - это доза вируса, убивающая 50 % лабораторных животных (обычно белых мышей);
• 1 ИД₅₀ — доза вируса, вызывающая клинические симптомы или патологоанатомические изменения у 50 % зараженных лабораторных животных;
• 1 ЭЛД — доза вируса, убивающая 50 % куриных эмбрионов;
• 1 ЭИД₅о — доза вируса, вызывающая патологоанатомические изменения у 50 % зараженных куриных эмбрионов;
• 1 ЦПД50 — доза вируса, вызывающая цитопатический эффект у 50 % зараженных культур клеток (обычно пробирок с культурами клеток).

Количество ЭД₅₀ (ЛД₅₀, ИД ЭЛД₅₀, ЭИД₅₀ или ЦПД₅₀) вируса, содержащееся в единице объема вируссодержащего материала, и будет выражением титра (Т) вируса в этом материале. Например, Т=10 3,4 ЦПД₅о/0,1 мл означает, что в каждой 0,1 мл вируссодержащего материала содержится 10 3 ’ 48 доз вируса (т. е. более 1000, но менее 10 000, а именно 10 3 ’ 48 = 3020), каждая из которых способна вызвать цитопатический эффект в 50 % пробирок с культурой клеток.

Названные единицы 50-процентного инфекционного действия вируса (ЛД₅₀, ИД₅₀, ЭЛД₅₀, ЭИД₅₀, ЦПД₅₀) используются в случаях оценки инфекционного действия вируса со статистически оцениваемым эффектом, имеющим место, когда учет инфекционного действия вируса ведется по летальному действию, клиническим симптомам, патологоанатомическим изменениям или цитопатическому действию.

Титрование вирусов по 50-процентному инфекционному действию - наиболее универсальный прием, пригодный для титрования практически любого вируса, если подобрать чувствительную к нему живую систему (текст-объект). Однако этот метод титрования вирусов довольно трудоемкий, длительный и требует статистических расчетов.

Задача определения титра вируса в единицах 50-процентного инфекционного действия (ЛД₅₀, ИД₅₀, ЭЛД₅₀, ЭИД₅₀, ЦПД₅₀) сводится к тому, чтобы найти такое разведение испытуемого вируссодержащего материала, в объеме заражающей дозы которого содержалась бы одна ЭД50, а затем рассчитать, сколько таких единиц вируса содержится в таком же объеме вируссодержащего материала, что и будет показателем титра вируса в этом материале.

Чтобы решить эту задачу, сначала из исследуемого вируссодержащего материала готовят ряд последовательных 10-кратных разведений. 10-кратные разведения берут по двум причинам:

во-первых, как видно из графика зависимости инфекционного эффекта от дозы вируса (рис. 36), кривая этой зависимости вблизи точки, соответствующей ЭД₅о, на значительном отрезке приближается к прямой.

Рисунок 36 - График зависимости инфекционного эффекта от дозы вируса

Это означает, что в определенных пределах, центр которых в точке ЭД₅₀, между логарифмом дозы (разведения) вируса и инфекционным эффектом существует прямолинейная зависимость, т. е. величина инфекционного эффекта пропорциональна логарифму дозы вируса (или его разведения), в области малых и особенно больших доз эта зависимость нарушается;

во-вторых, при 10-кратном разведении облегчаются последующие расчеты.

Одинаковыми объемами каждого из 10-кратных разведений исследуемого вируссодержащего материала заражают равные группы чувствительных к данному вирусу живых тест-объектов (мышей, куриных эмбрионов или культур клеток). При этом в каждой группе должно быть не менее 4-6 тест-объектов, так как при меньшем количестве статистически рассчитываемая величина титра вируса будет иметь слишком большую погрешность (статистическая величина тем точнее, чем на большем количестве исходных данных она основана).

После заражения учитывают результат действия вируса (гибель, клинические симптомы, патологоанатомические изменения или ЦПЭ) на зараженные объекты и определяют, в каком разведении вирус проявил свое действие на 50 % чувствительных объектов. Разведение, дающее 50-процентный эффект, рассчитывают методом прямолинейной интерполяции. Когда такое разведение нашли, то считают, что в заражающем объеме вируса, разведенного в найденное (соответствующее 50-процентному эффекту) число раз, содержится 1 ЭД₅₀. В таком же объеме исходного (неразведенного) вируссодержащего материала таких доз (ЭД₅о) содержится больше во столько раз, во сколько был разведен материал, давший 1 ЭД50. Затем пересчитывают, сколько таких единиц 50-процентного инфекционного действия вируса содержится в единице объема (мл) вируссодержащего материала, что и будет выражением титра вируса в данном материале.

• 1 Рассчитать титр вируса в единицах 50-процентного инфекционного действия по предложенным фактическим данным.
• 20пределить титр вируса ньюкаслской болезни в аллантоисной жидкости в единицах гемагглютинирующего действия.

Самостоятельная работа студентов

• а) подготовка панелей, пипеток и материала;
• б) получение последовательных 2-кратных разведений вируса по 0,5 мл или по 0,2 мл;
• в) добавление 1-процентной суспензии эритроцитов;
• г) учет результатов и их интерпретация. Во время экспозиции переписывание в тетрадь (с доски или таблицы) схемы титрования антител к вирусу ньюкаслской болезни в РТГА.

Подведение итогов занятия Задание к следующему занятию Контрольные вопросы

• 1 Что такое титр вируса?
• 2 Каковы единицы измерения количества вируса?
• 3 Каков принцип определения титра вируса в БОЕ и ООЕ?
• 4 В чем принцип определения титра вируса в единицах 50- процентного инфекционного действия?
• 5 Какова методика расчета титра вируса в единицах 50- процентного инфекционного действия?
• 6 В чем принцип определения титра вируса в ГАЕ?
• 7 Каковы достоинства и недостатки разных методов титрования вирусов?