Вирус иммунодефицита крупного рогатого скота

Вирус инунодифицита крс

ВИРУС ИММУНОДЕФИЦИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА:
ХАРАКТЕРИСТИКА И РОЛЬ В ПАТОЛОГИИ

Городской научно-методический центр по диагностике и
профилактике болезней человека и животных

Вирус иммунодефицита крупного рогатого скота (BIV) впервые выделили от коровы с персистентным лимфоцитозом, лимфоидной гиперплазией, нейропатией, прогрессирующей слабостью и истощением в США в 1969 г. Этот изолят обозначили как R29 (M.J. Van Der Maaten et al., 1972). Он индуцировал образование синцития в культуре клеток, структурно подобен вирусу меди-висна овец и был назван как висна-вирус крупного рогатого скота. Авторы установили, что у зараженных BIV R29 телят возбудитель выделялся через 8 нед и в 2 случаях - спустя 12 нед после инфицирования. При этом у всего молодняка отмечали лимфопролиферативную реакцию, которая выражалась в значительном увеличении лимфатических узлов и умеренном лимфоцитозе. Эти исследо-вания показали 2 характерных признака, типичных для острых лентивирусных инфекций: выраженное влияние на иммунную систему и персистенцию возбудителя.

Интерес к этому вирусу возрос после выделения возбудителя иммунодефицита человека (HIV), так как возникла острая необходимость получения модели животного для его изучения. Молекулярное клонирование изолята вируса R29 и 2 клонов, происходящих от R29 (R29-127, R29-106), показало значительную структурную и генетическую гомологию между BIV и HIV (K.J. Garvey et al., 1990; М.А. Gonda et al., 1994).

Название иммунодефицитоподобный вирус крупного рогатого скота предложили М.А. Gonda etal. (1987). В настоящее время согласно рекомендациям Международного комитета по таксономии вирусов он носит название вирус иммунодефицита крупного рогатого скота (R.I.B. Francki et al., 1991). Данные секвенирова-ния и серологического анализа показали, что BIV принадлежит к семейству Retroviridae и роду Lentivirus, к которому помимо BIV и HIV относятся вирусы: инфекционной анемии лошадей (EIAV), меди-висна овец (MW), артрита-энцефалита коз (CAEV), иммунодефицита кошек (FIV) и иммунодефицита обезьян (SIV). С помощью клонирования определили нуклеоти-дную последовательность провируса (K.J. Garvey et al., 1990). Возбудитель реплицируется в клетках селезенки плода крупного рогатого скота, легких, тимуса, тестикул, почки и образует синцитий (М.А. Gonda et al., 1987). BIV может инфицировать диплоидные и анеоплоидные клетки собаки, хорька и овцы (A.M.P. Bou-illantetal., 1989).

G. Kertayadnya et al. (1993) и B.J. Chadwick et al. (1995) показали значи-тельное генетическое сходство между BIV и недавно открытым вирусом болезни Джембрана (JDV), относящегося к ретро-вирусам и вызывающего заболевание с острым летальным синдромом. Степень гомологии нуклеотидных последовательностей и набора аминокислот между BIV и JDV составляет 74 и 76 % соответственно, что обусловливает высокий уровень пере-крестной активности между данными возбудителями. Используя моноклональ-ные антитела, установили, что вирус иммунодефицита крупного рогатого скота содержит один уникальный эпитоп в кап-сидном белке (молекулярная масса 29 кДа), который отсутствует у возбудителя болезни Джембрана. Последующее эпитопное картирование и химический анализ показали, что он расположен в зоне 6,4 кДа N-концевой части капсидного белка (L Zheng et al., 2001). Моноклональ-ные антитела, полученные к этому эпитопу, позволяют дифференцировать эти 2 близкородственные лентивируса.

Изолят BIV R29 был многократно пассирован и легко адаптирован к росту на клеточной культуре тимуса собаки. Он стал широкодоступным, и многие ученые используют его в качестве референтного штамма BIV. При экспериментальном заражении им крупного рогатого скота он сохраняет антигенную и генетическую стабильность длительное время (S. Carpenter et al., 2000). Аттенуация BIV R29 и последующие многократные пассажи на клеточных культурах могут сглаживать клинические признаки у экспериментально зараженного им крупного рогатого скота. Клиническое проявление болезни в стадах с высокой инцидентностью серопозитивно-сти к BIV свидетельствует о том, что полевые изоляты вируса могут быть более патогенными, чем адаптированный к культуре клеток BIV R29. Телята, экспериментально инфицированные полевым изоля-том BIV FL112, проявляют более выраженный лейкоцитоз и высокий уровень репликации вируса in vivo по сравнению с таковыми, зараженными BIV R29 (D.L Suarez et al., 1993; S. Carpenter etal., 2000).

Первое сообщение о 2 новых изолятах вируса FL112 и FL491 сделали D.L. Suarez etal. (1993). Их выделили от BIV/BLVсеро-позитивных коров во Флориде, и они отличались от референтного штамма BIV R29 по репликации и степени формирования синцития в культуре клеток легких плода крупного рогатого скота. Оба изолята идентифицировали как BIV методами иммунофлюоресценции, иммуноблоттин-га, ПЦР, и они имели 92,6 - 93,6 % гомологии с нуклеотидной последовательностью BIV клона R29-127.

Серологические исследования крупного рогатого скота, проведенные в разных странах, показали, что BIV имеет довольно широкое распространение. Установлено, что серопозитивные животные в США составляют 4 % (J.V. Black, 1989), в Нидерландах - 1,4 (М. Horzinek et al., 1991), в Канаде - 5,5 (W.B. McNab et al., 1994), в Германии - 6,6 (A. Muluneh, 1994), во Франции - 4 % (В. Polack et al., 1996).

Кроме этих стран BIV зарегистрирован в Англии, Швеции, Италии, Корее, Коста-Рике, Венесуэле, Новой Зеландии, Австралии, Пакистане, Камбодже (у крупного рогатого скота и буйволов), Индонезии, Бразилии (S. Meas et al., 2002), Японии (Т. Usui et al., 2003), Турции (S. Meas et al., 2003), Замбии (S. Meas et al., 2004). Методами молекулярной биологии установлено, что изолят BIV, выделенный в Замбии, гомологичен американскому штамму BIV R29 на 98,0 - 100 % и на 97,0 -99,0 % изоляту из Японии. Бразильский изолят оказался на 98,0 - 100 % гомологичен штамму BIV R29 и на 97,0 - 99,0 % японскому изоляту. Серопозитивность у здорового крупного рогатого скота составляла 1 - 7 %, однако в отдельных стадах у животных с хроническими болезнями она достигала 30 - 50 %. С.А. Whetstone et al. (1990) установили, что из 64 % BlV-cepo-позитивных животных с лимфосаркомой, лимфоаденопатией и другими нарушениями 74 % были инфицированы BLV. По-видимому, отмеченные клинические признаки являлись следствием BLV- инфекции. T.G. Snider et al. (2003) отмечали у коров голштинской породы, естественно инфицированных вирусом иммунодефицита крупного рогатого скота, снижение массы тела, поражение центральной нервной и лимфоидной системы (лимфоидная фолликулярная гиперплазия и дисплазия лим-фатических узлов и другие изменения), множественные бактериальные инфек-ции. Однако все эти изменения нельзя связывать только с инфицированием BIV. Не установлена породная зависимость чувствительности к BIV крупного рогатого скота и буйволов, изоляты BIV от разных пород при анализе аминокислотных последовательностей в геноме не имели различий (S. Meas et al., 2001). Вместе с тем филогенетический анализ показал, что генотип американских и азиатских изолятов BIV несколько отличается.

Механизм передачи BIV не изучен, но, возможно, он подобен таковому у HIV, который передается по горизонтали и по вертикали. J.W. Nash etal. (1995) показали, что BIV, как и HIV, сохраняется в сперме при криоконсервации и существует воз-можность заражения коров от инфицированных быков-производителей при искусственном осеменении. Используя ПЦР, эти же авторы выявили BIV в лим-фоцитах крови и молока, предполагая возможность инфицирования телят секретами молочной железы. СМ. Gradil et al. (1999) при экспериментальном заражении 3 быков 18 - 24-месячного возраста клеточной суспензией, содержащей BIV FL112, обнаружили у них антитела через 17 дней после инфицирования, уровень которых достигал максимума спустя 37 -58 дней. Вирус выделили из мононуклеар-ных клеток периферической крови у 2 осо-бей через 9 дней после заражения и у 1 - спустя 23 дня. Методом ПЦР вирус обнаружили у этих 3 быков, начиная с 9-го и до 98-го дня после заражения.

Возможность вертикального пути передачи возбудителя иммунодефицита крупного рогатого скота изучали у естественно инфицированных коров с использованием ПЦР (С.А. Moody et al., 2002). Трансплацентарную передачу BIV установили у 6 из 22 телят (27 %), возможен и лактогенный путь передачи вируса. Вертикальный путь передачи BIV и BLV оценивали в стадах крупного рогатого скота, где серопозитивность составляла 17,0 и 36,1 % соответственно и 9,0 % коров были инфицированы обоими вирусами (S. Meas et al., 2002). После рождения всех телят отделяли от матерей до приема молозива и исследовали на наличие возбудителей с использованием ПЦР и образования синцития. Телята от BLV-инфицированных матерей не содержали вируса. После получения молозива и молока они также оставались отрицательными на наличие этого возбудителя. Другой молодняк, рожденный от BLV-положительных матерей, получал молозиво от BLV- отрицательных или пастеризованное молозиво от BLV-положительных коров. Весь он также оставался BLV-отрицательным, что свидетельствовало об отсутствии трансплацентарной передачи вируса. Телята от BIV- и BLV-положительных коров содержали BIV, что подтверждает трансплацентарную передачу вируса иммунодефицита крупного рогатого скота. После получения молозива новорожденные телята становились BLV-положительными. Эти данные показывают, что BIV может передаваться потомству внутриутробно, a BLV - через молозиво и молоко матерей одновременно инфицированных BIV и BLV

К. St. CyrCoats et al. (1994) установи-ли взаимосвязь между возрастом и процентом серопозитивности у молоч-ных коров в Миссисипи. Авторы обнаружили, что 29% коров исследованного молочного стада 3 - 4-летнего возраста были BIV-серопозитивными, причем количество таких животных с возрастом увеличивалось и достигало 50% в группе коров старше 5 лет, 60% - старше 6 лет и 70% - 7 - 10 лет. При этом у серопозитив-ных животных 3 - 4-летнего возраста общее количество лейкоцитов было в норме и уменьшалось с возрастом. Отмечали также повышение количества лим-фоцитов и снижение уровня нейтрофилов и частично моноцитов. На незначительное изменение числа моноцитов и их функциональных свойств в первые 2 года после экспериментального заражения BIV указывали А.Н. Rovid et al. (1995). Результаты их опытов поддерживают гипотезу о том, что BIV может изменять функцию моноцитов in vitro при его достаточной концентрации и совпадают с выводами М. Onuma et al. (1992), отмечавшими, что BIV, как и другие лентивирусы, может инфицировать макрофаги. Авторы установили тенденцию к угнетению фагоцитарной активности через 4-8 мес после введения антигена. Y. Geng et al. (1992) отмечали,что герпесвирус крупного рогатого скота 1-го типа (возбудитель инфекционного ринотрахеита) акти-вирует экспрессию BIV in vitro и может быть вирусным кофактором, способным усиливать репликацию BIV in vivo и, возможно, увеличивать его патогенность. Несмотря на то, что некоторые патологические изменения присутствуют у животных, инфицированных BIV, включая дис-функцию моноцитов, энцефалопатию и лимфоаденопатию, детальный патогенезу инфицированного крупного рогатого скота остается неясным. У серопозитив-ных животных наблюдают снижение массы тела, молочной продуктивности, развитие вторичных заболеваний, но нет прямых данных, что BIV вызывает эти симптомы у естественно инфицированных животных.

Во многих случаях они связаны с присутствием других факторов, включая инфицирование вирусом лейкоза крупного рогатого скота, который может вызывать лимфоидные опухоли и персистентный лимфоцитоз, при этом животные остаются гематологически и клинически здоровыми.

В 10 округах одного из штатов Японии из 390 здоровых коров 43 (11,0%) оказались BIV-положительными, 13(3,3%) BLV-положительными и только 1 (0,3%) была BIV- и BLV-положительной. При этом BIV-инфицирование коров установили в 9 из 10 округов с серопозитивностью 0 - 25%. В 2 стадах, где регистрировали энзоотический лейкоз крупного рогатого скота, двойное инфицирование выявили соот-ветственно у 4,5 и 1,8 % животных. Относительно высокий процент BIV-инфициро-вания (18,7%) установили у BLV-инфици-рованного крупного рогатого скота по сравнениию с 11,0% BIV-инфицирования при исследовании случайных проб, где 3,3% животных были BLV-положительны-ми (I Usui et al., 2003). Можно предположить, что BIV-серопозитивность увеличивается у BLV-инфицированного крупного рогатого скота. Однако для такого заключения необходимы широкомасштабные серологические и молекулярно-биологические исследования с детальными дли-тельными эпидемиологическими наблю-дениями.

Многие исследователи, определяя специфические антитела к BIV, изучали характер иммунного ответа и роль разных вирусных белков в его формировании. Так, с помощью иммуноблоттинга было установлено, что в процессе инфекции антитела синтезируются главным образом к 2 наиболее важным иммунодоминантным белкам BIV: основному белку нуклеокапсида с молекулярной массой 26 кДа (р26) и поверхностному гликопротеину с молекулярной массой 110 кДа (др110). У коров, экспериментально инфицированных BIV, антитела к р26 выявляли к 14-му дню после заражения, и их уровень достигал максимума через 6-8 недель. Антитела к др110 регистрировали значительно позднее, и их максимальный уровень фиксировали через много месяцев после заражения (С.А. Whetstone et al., 1990). Антисыворотка к BIV p26 перекрестно реагировала с р24 HIV-1, а антисыворотка к EIAV обладала перекрестной активностью с р24 и р26 BIV (M.A. Gonda et al., 1987; С.А. Whetstone et al., 1991). BIV- специфические антитела реагировали с рекомбинантным белком вируса с молекулярной массой 53 кДа (гр53). Изучая динамику антителообразования к пептидам трансмембранного гликопроте-ина BIV у телят, зараженных изолятом BIV FL112, специфические антитела обнаруживали через 4 нед после заражения, и максимального уровня они достигали между 10-й и 30-й неделями, сохраняясь у большинства особей в течение 50 нед наблюдения (L Scobie et al., 1999).

D.L Suarez et al. (1995) с помощью иммуноблоттинга и ПЦР показали, что в препаратах нативного BIV содержание р26 значительно выше, чем др110. Поэтому иммунный ответ на р26 значительно сильнее и продолжительнее (антитела в высоком титре обнаруживали в сыворотке крови гипериммунизированных коров через 302 дня после последнего введения антигена), чем на др110. Превышение количества нуклеокапсидных белков над таковым поверхностных гликопротеинов характерно для всех представителей лен-тивирусов, в том числе и для HIV.

В настоящее время разработали и широко используют ряд высокочувствительных и специфичных диагностических тестов, направленных на идентификацию BIV или на выявление антител к нему. К ним относятся: ПЦР, иммуноблоттинг, непрямые варианты ИФА и иммунофлюо-ресценции. В отличие от антигенов других представителей лентивирусов BIV-ан-тигены не взаимодействуют со специфическими антителами в реакции преципитации.

Чтобы установить потенциальную роль BIV в заболевании крупного рогатого скота, необходимы широкомасштабные и длительные (учитывая инкубационный период) исследования, число которых в настоящее время ограничено. Поэтому пока преждевременно считать BIV патогеном, хотя можно предположить, что ВIV, подобно HIV и другим лентивирусам, может вызывать заболевание у инфицированных животных. В то же время BIV может играть и незначительную роль в патологии крупного рогатого скота или быть сопутствующим фактором, усили-вающим клиническое проявление других болезней, например таких, как лейкоз. Кроме работ С.А. Whetstone et al., 1990 и Luther, pers.commun., 1993, в которых говорится о проявлении клинических признаков болезни у коров, инфицированных BIV совместно с BLV, в настоящее время нет подтверждения об инфекции, вызываемой BIV у естественно инфици-рованных животных. Экспериментальное заражение телят штаммом BIV R29 или его клонами вызывало незначительные изменения лейкоцитов, включая лимфопролиферацию и нейтропению, без развития клинических признаков заболевания в течение короткого промежутка времени (S. Carpenter etal., 1992; K.R Flaming et al., 1993). Эти же авторы при определении степени воздействия BIV на клетки иммунной системы in vivo с использованием различных тестов показали, что BIV не вызывает иммуносупрес-сию и гистопатологические изменения в организме. При экспериментальном заражении коров полевыми изолятами BIV, выделенными во Флориде, наблюдали только незначительный лимфоцитоз (D.L. Suarez et al., 1993). Аналогичные результаты получили J. Brownlie et al. (1994), которые отмечали, что, несмотря на то, что BIV присутствует в организме крупного рогатого скота более 3 лет, ни у одного животного, по их наблюдениям, не развивалось клинического синдрома после экспериментального заражения. Вместе с тем они считают, что нереально ожидать проявления пато-генного действия BIV до окончания инкубационного периода, который может составлять 3-5 лет. При исследовании 60 сероположительных и 60 серонегатив-ных коров по отношению к BIV S. Cavirani et al. (1998) не установили различий в количественной характеристике лейко-цитов в периферической крови. R. Walder et al. (2001) при заражении кроликов BIV изучали его тропизм к лимфоидным и нелимфоидным тканям, оценивая репликацию вируса, его дессиминацию и распределение в лимфоидных, нелимфоидных тканях и тканях, ассоциированных со слизистыми оболочками. Результаты исследований показали, что BIV, лентивирус с генетическим родством к HIV, вызывает клинические (анорексия, потеря веса, диарея, гипоалгезия, кривошея), иммунологические (дисфункция Т-и В-клеток) и гистопатологические (лимфаденопатия, спленомегалия) изменения, природа которых близка таковым, установленным при лентивирусных инфекциях у кошек (FIV), обезьян (SIV) и человека (HIV). Эти эксперименты свидетельствуют о том, что вирус иммунодефицита крупного рогатого скота индуцирует синдром спленомегалии и лимфаденопатии, который ассоциируется с нарушением функции иммунной системы и способностью вируса реплицироваться на слизистых поверхностях организма кроликов. Все это подчеркивает важность использования системы взаимодействия организма кролика с вирусом как хорошую мелкую модель для изучения ретровирусов, индуцирующих AIDS, и возможность ее использования для оценки профилактических и терапевтических антиретровирусных агентов применительно к HIV-1, а также изучения механизмов феномена лекарственной устойчивости.

В настоящее время нет оснований рассматривать BIV как потенциальный патоген для человека. Он не инфицирует С8166 клетки (наиболее чувствительные клетки для HIV-1, HIV-2, SIV) и не вызывает цитопатического действия. Попытки инфицировать вирусом первичные клеточные культуры человека оказались неу-дачными. При исследовании сывороток крови от HIV-инфицированных пациентов отсутствовала перекрестная активность антител к HIV с BIV-специфическими антигенами. Не обнаружены антитела и у сотрудников лабораторий, имеющих повреждения кожи при работе с BIV-матери-алом. Таким образом, можно сказать, что BIV не представляет опасности для здо-ровья человека.

Структура генома, антигенные и эво-люционные аспекты BIV хорошо охарактеризованы, подобно остальным представителям рода, и установлено, что BIV твердо занимает место в филогенетическом древе среди других лентивирусов (М.А. Gonda, 1992).

480 руб. | 150 грн. | 7,5 долл. ', MOUSEOFF, FGCOLOR, '#FFFFCC',BGCOLOR, '#393939');" onMouseOut="return nd();"> Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

240 руб. | 75 грн. | 3,75 долл. ', MOUSEOFF, FGCOLOR, '#FFFFCC',BGCOLOR, '#393939');" onMouseOut="return nd();"> Автореферат - 240 руб., доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

Колотвин Вячеслав Васильевич. Вирус иммунодефицита крупного рогатого скота: индикация инфекции и распространенность в хозяйствах Российской Федерации : индикация инфекции и распространенность в хозяйствах Российской Федерации : дис. . канд. биол. наук : 03.00.23, 16.00.03 Москва, 2007 114 с. РГБ ОД, 61:07-3/618

Содержание к диссертации

Обзор литературы 9

1.1 Краткая историческая справка 9

1.2 Классификационное положение ВБИ 11

1.3 Особенности строения и жизненного цикла ретровируса 12

1.4 Морфология и физико-химические свойства ВБИ 24

1.5 Организация генома и репликация ВБИ 26

1.6 Структурные белки ВБИ 28

1.7 Культивирование ВБИ 29

1.8 Выявление ВБИ полимеразной цепной реакцией 30

1.9 Эпизоотология ВБИ 32

1.10 Клинические симптомы и патогенез ВБИ - инфекции 34

1.11 Пути передачи ВБИ 36

1.12 Антигенная активность ВБИ 36

Собственные исследования 39

2 Материалы и методы 39

2.1 Образцы цельной крови КРС 39

2.2 Образцы мышечной ткани КРС 40

2.4 Получение первичной культуры клеток (FBL) 41

2.5 Забор цельной крови КРС и выделение ДНК 42

2.6 Подбор праймеров к геному провируса ВБИ 47

2.7 Постановка ПЦР 49

2.8 Регистрация результатов ПЦР 51

2.9 Секвенирование продуктов ПЦР 52

Результаты исследований 53

1 Подбор ДНК-мишени и конструирование праймеров для идентификации ДНК ВБИ методом ПЦР 53

2 Сравнительный анализ методов выделения ДНК из цельной крови КРС 55

3 Оптимизация процесса амплификации 56

4 Получение инфекционного вируса иммунодефицита КРС 59

5 Апробация чувствительности и специфичности сконструированной тест-системы ПЦР 61

6 Выявление распространенности ВБИ КРС в стадах Московского региона 63

7 Выявление распространенности ВБИ КРС в стадах Ставропольского края 65

8 Результаты секвенирования продуктов ПЦР 67

9 Результаты исследования мясного сырья КРС с помощью праймеров gagl/gag2 68 Обсуждение результатов исследования 70

Практические предложения 79

Список литературы 80

Приложение 1 (Методические рекомендации по диагностике инфекции, вызванной вирусом иммунодефицита КРС с помощью ПЦР) 100

Введение к работе

Вирус иммунодефицита КРС относится к семейству Retroviridae и роду Lentivirus, который включает также вирусы иммунодефицита человека, кошек, обезьян, вирус инфекционной анемии лошадей, вирусы артрита -энцефалита коз и мэди-висна овец (Van Regenmortel et al 2000). Особое внимание к вирусу бычьего иммунодефицита вызвано его филогенетической близостью к вирусу иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1), что позволяет использовать ВБИ в качестве удобной модели для изучения иммунодефицитных состояний животных и человека (Gonda et al 1987).

Впервые ВБИ был выделен из крови коровы с повышенным лимфоцитозом, прогрессирующей слабостью и истощением (Van der Maaten et al 1972). При экспериментальном заражении телят у них появлялись противовирусные антитела и развивалась гиперплазия лимфатических узлов. Вирус бычьего иммунодефицита, встречается во многих странах мира и часто сопутствует другой ретровирусной инфекцией, вызываемой вирусом бычьего лейкоза (ВБЛ) (Carpenter et al 1992, Meas et al 2003, Usui et al 2003, Snider et al 2003).

Эпизоотологическая обстановка по ВБЛ-инфекции в нашей стране хорошо изучена, разработаны методы диагностики и внедрены эффективные системы противолейкозных мероприятий (Гулюкин и др. 2005, Бурба, Шишков и др. 1985, 1992.). Однако вирус бычьего иммунодефицита никогда не служил объектом исследования, а отсутствие диагностических систем не позволяло оценить степень распространения ВБИ среди крупного рогатого скота на территории Российской Федерации (Федоров, Верховский 1996).

Целью наших исследований была разработка диагностической тест-системы ПЦР и изучение распространения ВБИ в некоторых хозяйствах крупного рогатого скота на территории РФ.

- получить инфекционный вирус бычьего иммунодефицита;

создать видоспецифичные праймеры для выявления ДНК провируса ВБИ методом ПЦР;

оптимизировать процесс амплификации по температурному и временному профилю реакции;

- изучить специфичность и чувствительность разработанной тест- системы;

исследовать пробы крови крупного рогатого скота из различных хозяйств РФ на содержание провирусной ДНК ВБИ;

исследовать пробы мяса на содержание провирусной ДНК ВБИ.

Разработана ПЦР-тест-система для идентификации провирусной ДНК вируса бычьего иммунодефицита в крови крупного рогатого скота. Подобраны видоспецифичные праймеры для идентификации ДНК провируса вируса бычьего иммунодефицита. Получена клеточная линия легкого эмбриона быка (FBL), пригодная для размножения инфекционного ВБИ. Получен инфекционный ВБИ, соответствующий референтному штамму R-29. Проведена оценка чувствительности и специфичности тест-системы. Проведено исследование крови крупного рогатого скота из нескольких животноводческих хозяйств на содержание провирусной ДНК. Впервые на территории Российской Федерации выявлены животные, инфицированные ВБИ. Проведена сравнительная оценка распространенности вирусов бычьего иммунодефицита и бычьего лейкоза в стадах Московской области и Ставропольского края. Показано, что варианты вируса иммунодефицита, циркулирующего в хозяйствах нашей страны, отличаются от стандартного штамма вируса R-29 по гену рої. Проведено исследование партий импортного говяжьего тримминга, полученных из стран Восточной Европы, Евросоюза, Южной Америки и показана возможность выявления ДНК-провируса ВБИ в образцах мяса КРС.

Результаты научных исследований были использованы при разработке методических рекомендаций по диагностике инфекции, вызванной ВБИ с помощью полимеразной цепной реакции (Утверждены академиком-секретарем отделения ветеринарной медицины РАСХН А.М.Смирновым 07.12.2006 г.). Разработан диагностический набор для выявления провирусной ДНК ВБИ методом полимеразной цепной реакции.

Публикации по диссертационной работе и апробация результатов исследования

По материалам диссертации опубликовано 6 работ. Результаты работы доложены: на молодежной международной школе-конференции молодых ученых "Биотехнология будущего" Симпозиума "ЕС-Россия: Перспективы сотрудничества в области биотехнологии в 7-ой Рамочной программе" (Санкт-Петербург, 2006); на международной юбилейной научно-практической конференции, посвященной 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России (Курск, 2006); на международной конференции "Живые системы и биологическая безопасность населения" (Москва, 2005 г.). Результаты работы доложены и обсуждены на заседании секции инфекционной патологии животных отделения ветеринарной медицины РАСХН 1 ноября 2006 года.

Особенности строения и жизненного цикла ретровируса

При копировании содержащейся в вирионе 70S РНК затравкой для синтеза ДНК служат клеточные тРНК, прочно связанные с вирусной РНК (Van Regenmortel 2000). Затравка (тРНК) присоединена к геномной 35S-PHK на расстоянии примерно 135 нуклеотидов от ее 5 -конца в регионе PBS. тРНК-затравка связывается специфично и с большой степенью сродства не только с 35S-PHK, но и с обратной транскриптазой. Поэтому обратная транскриптаза — это в высшей степени специализированная ДНК-полимераза, назначение которой состоит в инициации синтеза ДНК при ее связывании со специфической затравкой, которая в свою очередь связана со специфическим участком РНК-матрицы (Wooley, Bircher, Smith 1998). Конечным продуктом реакции, катализируемой обратной транскриптазой in vitro, является полная ДНК-копия вирионной 35S-PHK, дополненной по концам длинными прямыми повторами (LTR), отсутствующими в вирионной РНК.

Процесс обратной транскрипции начинается с З -конца 35S-PHK, к которому в области pbs присоединена тРНК, служащая затравкой для начала работы реверсной траскриптазы (Nagy, Bujarski 2000).

Конечная ДНК выделенная из вирусного генома содержит длинные терминальные повторы, составленные из последовательностей с 3 и 5 концов вирусной РНК - фланкирующих R-LTR-последовательности (Van Regenmortel et al, 2000) По информационному содержанию ДНК-вариант генома ретровируса отличается от РНК-варианта только тем, что ДНК содержит не короткие концевые повторы, а длинные концевые повторы LTR (Pallansch, Lackman-Smith, Gonda 1992). LTR-последовательности (long terminal repeats) включают в себя последовательности STR, являющиеся одним из вариантов минисателлитных последовательностей. Это тримерные и тетрамерные короткие тандемные повторы в геноме животных, которые стабильно наследуются и обладают высоким уровнем полиморфизма. Подобно другим повторам, STR обычно встречаются в не кодирующих частях генов. Обнаружена группа структурных генов, несущих тримерные повторы в регуляторных и даже в транслируемых частях генов.

Возникновение LTR очень важно для экспрессии вирусных генов. Они содержат вирусные регуляторные транскрипционные элементы: промотор, энхансер, и другие. Например, некоторые вирусы содержат элементы, определяющие зависимость вирусной транскрипции от наличия определенных гормонов. LTR и являются теми регуляторными сигналами, которые вирус использует для эксплуатации клеточной транскрипционной машины в своих целях. Находясь в составе геномной ДНК, вирусные гены транскрибируются под контролем LTR (Bieniasz, Grdina, Bogerd et al 1999).

Забор цельной крови КРС и выделение ДНК

В пробирки объемом 2 мл вносили 0,5 мл стабилизированной и гомогенизированной встряхиванием крови и добавляли 1,5 мл деионизованной воды. Гемолиз эритроцитов проводили при комнатной температуре в течение 20 минут. Пробы центрифугировали при 10000 об/мин 10 минут. Супернатант сливали и к осадку добавляли в пробирку 1 мл физиологического раствора. Раствор гомогенизировали путем встряхивания пробирок на аппарате вортекс ВП2 до полного суспензирования осадка в физиологическом растворе. Пробы центрифугировали при 10000 об/мин 10 минут. Растворение осадка в физиологическом растворе с последующим центрифугированием повторяли трижды. К сухому осадку добавляли по 0,3 мл буфера. Освобождение ядерной ДНК от остатков ядер и других мембран проводили с помощью детергентов и протеолитического фермента протеиназа К при температуре +37С в течение 1,5 часов. Пробу ДНК смешивали с равным объемом фенола. Содержимое перемешивали до образования эмульсии. Пробы центрифугировали 3 мин при 16000 об/мин при комнатной температуре. Верхний водный слой переносили в чистую пробирку. В каждую пробу добавляли 5М раствор NaCl до концентрации 100 мМ. Добавляли в каждую пробу по 3 мкл тРНК (10 мг/мл). В каждую пробу вносили двойной объем этанола 96 % . Пробы инкубировали при низкой температуре (-20С) в течение 30 - 60 мин для осаждения ДНК. Пробы центрифугировали при 10000 об/мин 6 минут. Супернатант сливали, осадок промывали этанолом 70%. Осадок высушивали при комнатной температуре, растворяли в 15-50 мкл деионизованной воды. Растворение ДНК проводили при комнатной температуре в течение 1-3 часов. Раствор ДНК хранили при температуре +4 С (в случае использования в течение 1-3 дней) или - 20 С (для длительного хранения).

Подбор праймеров к геному провируса ВБИ Из представленных в базах данных EMBL, GenBank и DDBJ была создана подбаза, содержащая все известные данные о нуклеотидных последовательностях генома и отдельных генов ВБИ. Следующим шагом было множественное выравнивание участков генома выбранных изолятов с помощью пакета прикладных программ LaserGene MegAlign_v6. Оценку вариабельности выбранных последовательностей ДНК и поиск консервативных участков для конструирования видоспецифичных праймеров осуществляли в режиме online с помощыо системы ClastalW Multi Sequence Alignment. При анализе генома ВБИ были обнаружены высококонсервативные участки в генах gag и рої, на основании которых были подобраны специфические праймеры. Праймеры, синтезированные на синтезаторе ASM - 102 ("Биоссет", Новосибирск) и очищенные посредством электрофореза в ПААГ, были получены от фирмы "Синтол" (Россия). Термодинамический анализ праймеров и ампликонов был произведен с помощыо программы Oligo.

Подбор ДНК-мишени и конструирование праймеров для идентификации ДНК ВБИ методом ПЦР

В настоящее время для диагностики лентивирусных инфекций применяют серологические методы и метод полимеразной цепной реакции. Выбор методики обнаружения ВБИ зависит от возможностей лаборатории и задач, стоящих перед исследователями. Одним из наиболее распространенных методов серологической диагностики ВБИ является Вестерн - блот (Whetstone et al 1990; Carpenter et al 1992; Jacobs et al 1992; Meas et al 1998; Usui et al 2003). Метод Вестерн - блота позволяет выявлять антитела сразу к нескольким антигенам ВБИ (gplOO, р32, р26, р19, р16 и р13). Метод иммуноферментного анализа для диагностики ВБИ (Isaacson JA et al. 1998) и индикация ВБИ на основе реакции иммунофлюоресценции (Orr et al 2003) используются существенно реже, что объясняется отсутствием стандартных реагентов для этих методик. При создании серологических тест-систем необходимо обладать вирусным антигеном, который можно получить из культуры клеток, зараженных инфекционным ВБИ или трансфицированной плазмидой, содержащей полный геном ВБИ. Антиген может быть получен также путем экспрессии вирусных генов в бактериях с помощью генно - инженерных подходов. При инициации исследования по распространению ВБИ - инфекции возникает необходимость в создании чувствительного и специфичного метода обнаружения ВБИ, позволяющего выявить непосредственно вирус (а не антитела) в крови животного или в культуре клеток. Наиболее универсальным методом обнаружения вирусов в биологических объектах на данный момент является полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяющая идентифицировать провирусную ДНК вируса. Кроме того, несомненным преимуществом ПЦР является возможность обнаружения провируса ВБИ в разнообразных физиологических жидкостях животных (кровь, сперма, молоко, мышечная ткань и т.д.) и культуре клеток инфицированных ВБИ. С помощью ПЦР возможна диагностика инфекции на ранних стадиях развития, до возникновения антительного ответа.

Благодаря своим очевидным преимуществам ПЦР используется практически всеми исследователями, занимающимися диагностикой ВБИ вне зависимости от использования других методов диагностики и источников исследуемого материала. Так, ПЦР используется для подтверждения инфекционного статуса животного, полученного при использовании серологических методов обнаружения ВБИ (Meas et al 1998; Meas et al 2000; Usui et al 2003; Meas et al 2003; Meas et al 2004); при исследовании возможности вертикальной передачи ВБИ (Meas S. Et al 2002); при установлении нуклеотидных последовательностей различных генотипов ВБИ, полученных из разных стран (Carpenter et al 2000; Patil et al 2003); при исследовании тропизма ВБИ к различным клеткам и органам КРС (Wu et al 2003), для установления способности ВБИ преодолевать межвидовые барьеры и инфицировать клетки других млекопитающих (Pifat et al 1992).

Ключевым моментом при создании тест - системы ЦПР является подбор олигонуклеотидных зондов (праймеров), функция которых состоит в специфическом образовании водородных связей с ДНК-мишенью. Подбор праймеров, как правило, осуществляется с использованием мировых баз данных EMBL, GenBank и DDBJ, содержащих все известные данные о нуклеотидных последовательностях генома и отдельных генов ВБИ. На основании этой информации разными исследователями подбирались различные участки генома ВБИ, чтобы в последствие использовать их в качестве ДНК - мишени для праймеров. Как правило, исследователи находили несколько консервативных последовательностей в разных генах ВБИ (env, gag, рої) и впоследствии опробовали чувствительность и специфичность каждой подобранной пары праймеров (Patil et al 2003; Gonzalez et al 2000; Limanskaya et al 2005). Согласно публикациям, наиболее консервативые последовательности находили в разных участках генома ВБИ. Так, в ряде случаев наиболее удачными оказались праймеры: к гену pol (Meas et al 2004; Limanskaya et al 2005), к гену env (Carpenter et al 2000) и к гену gag (Patil et al 2003). В некоторых случаях также применялся двухраундный (гнездовой) ПЦР, позволяющий повысить чувствительность реакции (Gonzalez G. Et al 2001; Meas S. Et al 2004).