Вируса гриппа in vitro
С декабря 1997 года высокопатогенные вирусы птичьего гриппа A H5N1 охватили популяции домашней птицы в азиатских странах и были переданы в африканские и европейские страны. Мы охарактеризовали 6 вирусов птичьего гриппа H5N1, выделенных у людей в 2004 году в Таиланде. Высокопатогенный (HP) штамм KAN353 показал более быструю репликацию и более высокую вирулентность в эмбриональных яйцах по сравнению с другими штаммами, особенно по сравнению с низко патогенным (LP) штаммом SP83. HP KAN353 также показал сильную цитопатогенность по сравнению с SP83 в клетках почки собак Мадин-Дарби. Интересно, что LP SP83 индуцировал меньшие бляшки по сравнению с другими штаммами, особенно HP KAN353. PB2-аминокислота 627Е может способствовать низкой вирулентности, тогда как либо PB2-аминокислота 627 K, либо комбинация 627E / 701N, по-видимому, связана с высокой вирулентностью. Анализы in vitro, используемые в этом исследовании, могут служить основой для оценки патогенеза вирусов гриппа H5N1 in vivo.
Высокая растрескиваемость гликопротеина гемагглютинина (ГА) была необходима для летальной инфекции у птиц, предполагая, что белок НА также играет важную роль в фенотипе HP у людей. Поскольку HA опосредует связывание вируса с рецепторами, специфичными к сиаловой кислоте клетки-хозяина, и последующее слияние мембраны эндоцитозных вирусных частиц с эндосомной мембраной приводит к высвобождению vRNP в цитоплазму, сайт расщепления связан с патогенностью H5N1 [10] , Другие исследования показали, что 92 E белка NS1 имеют важное значение для отмены антивирусных эффектов фактора интерферона и фактора некроза опухоли альфа и могут иметь решающее значение для патогенности у свиней [14]. Недавнее исследование показало, что aa остаток 66 S PB1-F2 влияет на патогенность вируса H5N1 у мышей [15].
Так как штамм SP / 83/04 (SP83), выделенный в Таиланде в 2004 году, является LP для хорьков и мышей in vivo, а штамм KAN / 353/04 (KAN353), выделенный в Таиланде в том же году, показывает HP хорькам [16] , мы использовали эти вирусы для характеристики фенотипов in vitro, связанных с патогенностью у животных. Мы также использовали четыре вируса H5N1, изолированных в Таиланде в 2004 году от людей. Хотя для подтверждения сегментов, связанных с вирулентностью, необходимы обратная генетическая система и эксперименты на животных, сравнение фенотипа in vitro, описанного в этом исследовании, может служить основой для оценки патогенеза вирусов гриппа H5N1 in vivo.
Шесть вирусов гриппа H5N1, SP83, KAN353, Thai / 1623/04 (Thai1623), KK / 494/04 (KK494), PCBR / 2031/04 (PCBR2031) и SP / 528/04 (SP528), выделенные из человека в Таиланд в 2004 году были использованы в этом исследовании. Вирусы выделяли с клетками MDCK и выращивали один раз в 10-дневных эмбриональных куриных яйцах. Аллантоидная жидкость использовалась в качестве запаса вируса. Клетки MDCK поддерживали в MEM, дополненной 10% новорожденной телячьей сывороткой и антибиотиками при 37 ° C в 5% CO2. Все эксперименты проводились в лаборатории сдерживания уровня 3 в биобезопасности.
Чтобы измерить инфекционную активность вируса, мы провели анализ бляшек, как описано ранее [17]. Вкратце, клетки MDCK высевали на 6 × 105 / лунку в 6-луночные микропланшеты за один день до анализа. Конфлюэнтные клетки инфицировали серийным 10-кратным разведением образцов вируса и инкубировали в течение 1 часа при 37 ° C со встряхиванием каждые 15 мин. Клетки промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS) и покрывали 1% агарозой в среде 2 × MEM, содержащей 5 мкг / мл TPCK-трипсина (Sigma, Missouri, USA). После инкубации в течение 3 дней при 37 ° С агарозу удаляли и клетки фиксировали 10% формальдегидом и затем окрашивали 0,1% кристаллическим фиолетовым, чтобы визуализировать бляшки. Титр зараженности был выражен блоками формирования бляшек (PFU).
Десятидневные эмбриональные яйца инокулировали вирусами и инкубировали при 37 ° С. Мертвые яйца проверяли каждые 12 часов. PBS использовался как отрицательный контроль. Через 24 часа заражения аллантоидную жидкость использовали для титрования вируса методом бляшки.
Вирусовую РНК, экстрагированную комплектом вирусной РНК Mini QIAamp, использовали в одноступенчатой ПЦР обратной транскрипции (QIAGEN). Продукты ПЦР были клонированы в систему простого вектора pGEM-T (Promega, Мэдисон, США). Плазмиду экстрагировали комплектом GenElute ™ Plasmid Miniprep Kit (Sigma) и использовали для секвенирования с помощью набора циклов терминатора ABI BigDye с генетическим анализатором ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Аминокислотные последовательности анализировали с помощью BioEdit.
Шесть вирусов гриппа птиц H5N1, используемые в этом исследовании, показаны в таблице 1. Только один штамм, SP528, был выделен у пациента, который выздоравливал; другие 5 штаммов были у пациентов, которые в конечном итоге умерли. Из этих штаммов SP83 и KAN353 были исследованы ранее для их патогенности in vivo с использованием хорьков и мышей, и эксперименты показали, что SP83 имеет низкую вирулентность, тогда как KAN353, по-видимому, является вирусом HP [16]. Чтобы определить, можно ли оценить патогенность вирусов H5N1 в анализе in vitro, мы проверили доступность эмбриональных яиц. Каждый из 6 эмбриональных яиц инокулировали в 10 или 100 PFU / яйце / 100 мкл вирусов и инкубировали при 37 ° C. Через 36 часов все яйца, инфицированные 100 PFU / яйцом, умерли, указывая, что 100 PFU / яйцо вируса не было подходящим для анализа. Все яйца, зараженные KAN353 и Thai1623, погибли даже в 10 случаях PFU / яиц, в то время как два из шести яиц, зараженных SP83, умерли после 10 прививок PFU / яйцеклетки (таблица 2). Четыре яйца, зараженные SP83, не погибали до 72 часов после инфицирования (p.i.) (данные не показаны), что свидетельствует о том, что чувствительность эмбриональных яиц зависит от вирусной патогенности. Пять из шести яиц погибли, когда использовалось 10 PFU / яйцо штаммов KK494 и PCBR2031, а три из шести яиц погибли в случае SP528.
Вирусы, используемые в этом исследовании
Летальность эмбриональных яиц после заражения H5N1 36 часов p.i.
Чтобы подтвердить доступность эмбриональных яиц для оценки патогенеза, мы сравнили числа копий вирусного генома, используя аллантоидную жидкость, собранную 24 часа п.и. KAN353 и SP83 использовали для инокуляции яиц при 100 PFU / яйце. ПЦР в реальном времени указывала, что количество копий РНК было намного выше в инфицированных KAN353 яйцах, чем в зараженных SP83 яйцах (рис. 1А). Когда инфекционность этих вирусов измерялась с помощью анализа бляшек, мы обнаружили, что инфективность SP83 была значительно ниже по сравнению с инфекцией других штаммов, особенно KAN353 и Thai1623 (фиг.1B). Эти результаты показали, что по сравнению с SP83, KAN353 показал более высокую патогенность эмбриональных яиц и реплицируется быстрее и более широко в эмбриональных яйцах.
Л. Н. ШИШКИНА 1 , В. Е. НЕБОЛЬСИН 2 , А. С. КАБАНОВ 1 , М. О. СКАРНОВИЧ 1 , У. Б. ЭРДЫНЕЕВА 1 , Н. А. МАЗУРКОВА 1 , О. А. СЕРОВА 1 , Е. А. СТАВСКИЙ 1 , И. Г. ДРОЗДОВ 1
Ингавирин ® эффективно ингибирует размножение штаммов вируса гриппа A/California/04/2009 (H1N1)v, A/California/07/2009 (H1N1)v, A/Moscow/225/2009 (H1N1)v, A/Moscow/226/2009 (H1N1)v, а также штаммов A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) и A/Aichi/2/68 (H3N2) в культуре клеток MDCK. При внесении Ингавирина ® in vitro снижается гемагглютинирующая и цитопатическая активность этих штаммов вируса гриппа.
Ключевые слова: вирус гриппа A(H1N1/09)v, Ингавирин ® , противовирусная активность.
L. N. SHISHKINA, V. E. NEBOLSIN, A. S. KABANOV, M. O. SKARNOVICH, U. B. ERDYNEEVA, N. A. MAZURKOVA, O. A. SEROVA, E. A. STAVSKY, I. G. DROZDOV
State Research Centre of Virology and Biotechnology VECTOR, Koltsovo, Novosibirsk Region
JSC Valenta Pharm, Moscow
Ingavirin ® was shown to be efficient in inhibition of the influenza virus strains A/California/04/2009 (H1N1)v, A/California/07/2009 (H1N1)v, A/Moscow/225/2009 (H1N1)v and A/Moscow/226/2009 (H1N1)v, as well as the strains A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) and A/Aichi/2/68 (H3N2) in the MDCK cell culture. The hemagglutinin and cytopathic activity of the influenza virus strains decreased at entering Ingavirin ® in vitro.
Key words: influenza virus A(H1N1/09)v, Ingavirin ® , antiviral activity.
В лаборатории Центра контроля за инфекционными заболеваниями (CDC, США) 15 апреля 2009 года у 10-летнего ребенка с клиническими признаками респираторного заболевания (лихорадка, кашель, рвота) был выделен новый вариант вируса гриппа А субтипа H1N1 [1]. Было показано, что новый вариант возник в результате реассортации в геноме штаммов вируса гриппа свиней Евроазиатской линии и штаммов вируса гриппа свиней Североамериканской линии, которая возникла в конце 1990-х после тройной реассортации субтипов H1N1, H3N2 и H1N2 внутри классических свиных штаммов [2].
По данным ВОЗ, к началу ноября 2009 г. было зарегистрировано более 400000 лабораторно подтверждённых случаев заболевания пандемическим гриппом H1N1/09, из которых свыше 4740 случаев закончились смертельным исходом [3]. В январе-феврале 2010 г. активность пандемического гриппа H1N1/2009 в странах Европейского региона сохранялась, несмотря на тенденцию к снижению. Наиболее высокой она оставалась в таких странах, как Грузия, Польша, Сербия и Украина, а также в отдельных регионах РФ. При этом всего с апреля 2009 г. в Европе сообщалось о 4057 случаях смерти, связанных с лабораторно подтверждённым инфицированием вирусом пандемического гриппа A(H1N1/09) [4]. Международный опыт в области лечения пандемического гриппа H1N1/09 показывает, что плохие клинические результаты связаны с поздним обращением за медицинской помощью и задержкой начала противовирусной терапии [3, 5].
Наряду с пандемией гриппа A(H1N1/09) в январе 2010 г. появились сообщения о случаях заболевания, связанных с инфицированием вирусом гриппа птиц в Египте. Они подтверждены Центральными лабораториями общественного здравоохранения Египта, Национальным центром по гриппу в рамках Глобальной сети ВОЗ по эпиднадзору за гриппом (GISN) [6]. Из 97 лабораторно подтверждённых случаев заболевания птичьим гриппом A(H5N1), зарегистрированных в Египте, 27 закончились смертельным исходом. Во всех случаях имелся контакт с больными и мёртвыми домашними птицами [6].
Существует четыре противовирусных препарата, которые рекомендованы ВОЗ для лечения гриппа: амантадин и римантадин (ингибиторы вирусного белка М2), осельтамивир и занамивир (ингибиторы вирусной нейраминидазы). Недавние исследования показали, что вирус гриппа A(H1N1/09)v, который был выявлен у людей, устойчив к амантадину и римантадину, в то же время этот вирус восприимчив к осельтамивиру и занамивиру [7].
В связи с ежегодными эпидемиями гриппа, возможностью заражения людей вирусом гриппа животного происхождения и возникновением пандемии гриппа среди людей, остро встаёт вопрос о создании надёжных средств для его профилактики и лечения.
Целью настоящего исследования является изучение эффективности отечественного препарата Ингавирин ® in vitro в отношении штаммов пандемического вируса гриппа A(H1N1) 2009 г., а также штаммов вируса гриппа A(H5N1) и A(H3N2).
Клеточная культура. Для тестирования противовирусной активности препаратов использовали перевиваемую культуру клеток MDCK (клетки почки собаки). По 100 мкл суспензии клеток MDCK с концентрацией 1,0—1,5х10 5 кл/мл вносили в лунки 96-луночных планшетов. Планшеты с клетками помещали в термостат при температуре 37°C, 5% СО2 и 100% влажности на 1—2 сут до образования сплошного клеточного монослоя.
Инфицирование клеток MDCK вирусом гриппа. Готовили разведения исходных образцов вируса гриппа с 1-го по 7-е с десятикратным шагом с использованием среды MDCK StemAlpha (Франция), содержащей 2 мкг/мл трипсина TPCK (Sigma, СШA). По 50 мкл разведений вируса вносили в лунки с монослоем клеток MDCK (по 6 лунок на каждое разведение). Aдсорбцию вируса проводили в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем в каждую лунку с инфицированными клетками MDCK вносили исследуемые препараты в объёме 50 мкл и по 50 мкл питательной среды MDCK StemAlpha с 2 мкг/мл трипсина TPCK.
В контрольные лунки с инфицированными клетками вносили по 100 мкл питательной среды MDCK StemAlpha с 2 мкг/мл трипсина TPCK. Клетки инкубировали 4 сут при температуре 37°C в атмосфере 5% СО 2 в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия).
Через 4 сут в каждой лунке регистрировали ЦПД в монослое клеток с помощью инвертированного микроскопа и наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 0,5% эритроцитами кур. На основании этого определяли титры вируса в lgТЦД50/мл в контроле (ИД 50 in vitro без препарата) и в опыте (ИД 50 in vitro с препаратом) и высчитывали индекс нейтрализации (ИН) вируса под влиянием препарата: ИН = ИД50контроль — НД50опыт (lg).
Далее определяли, могут ли препараты оказывать влияние на репродукцию и инфекционную активность вируса гриппа. С этой целью собирали культуральную жидкость из одного или двух рядов лунок с клетками, инфицированными одним или двумя наибольшими разведениями вируса, т. е. его наименьшими дозами, при которых вирус был зарегистрирован по РГА в ≤100% лунок в контроле и в опыте ( в присутствии и без препарата). После этого оценивали продукцию вируса в объединённых пробах из лунок каждого ряда по гемагглютинирующей (титр в РГА) и инфекционной (титр в lg ТЦД 50/мл) активности, а также рассчитывали индекс подавления его продукции под влиянием препарата in vitro на основании разницы между титрами вируса в контрольных и опытных лунках.
Оценка противовирусной эффективности препаратов осуществлялась в соответствии с рекомендациями Фармакологического государственного комитета РФ [10]. Между контрольными и опытными образцами инфицированных клеток MDCK оценивали достоверность различий (P=0,05) по ИД 50 штаммов вируса гриппа in vitro и по показателям репродукции вируса гриппа.
Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку данных проводили общепринятыми методами для биологических исследований [9] с помощью метода Спирмана-Кербера с оценкой достоверности отличий (P=0,05) для 95% доверительного уровня (I 95).
Результаты и обсуждение
При внесении Ингавирина ® в клеточную культуру MDCK, инфицированную штаммами вируса гриппа, было показано, что инфекционность всех исследованных штаммов под его влиянием достоверно уменьшалась (табл. 1). Наблюдаемый диапазон индексов нейтрализации исследованных штаммов находился в пределах от 0,5 до 1,7. При этом наиболее высокий индекс нейтрализации достигался при инкубировании Ингавирина ® со штаммом вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) (табл. 1).
Таблица 1.
Инфекционность (50% инфицирующая доза — ИД50 в клетках MDCK) штаммов вируса гриппа A(H1N1)v in vitro в контроле и при инкубировании с Ингавирином ® через 4 сут после заражения
| Штаммы вируса гриппа | ИД50 штамма in vitro в контроле (в lgТЦД50/мл, ± I95) | ИД50 штамма in vitro при инкубировании с Ингавирином ® (в lgТЦД50/мл,±I95) | Индекс нейтрализации (в lg) |
| A/California/04/2009 (H1N1)v | 4,3±0,4 | 3,8±0,0* | 0,5* |
| A/California/07/2009 (H1N1)v | 5,0±0,5 | 3,8±0,5* | 1,2* |
| A/Moscow/225/09 (H1N1)v | 5,6±0,3 | 5,1±0,4* | 0,5* |
| A/Moscow/226/09 (H1N1)v | 5,8±0,6 | 5,1±0,4* | 0,7* |
| A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) | 7,3±0,7 | 6,1±0,4* | 1,2* |
| A/Aichi/2/68 (H3N2) | 7,6±0,7 | 5,9±0,3* | 1,7* |
После оценки ИН на основании результатов РГА определяли продукцию каждого штамма вируса гриппа в лунках с клетками, инфицированными наиболее низкими дозами вируса, при которых наблюдалась РГА в ≤100% лунок. Было обнаружено, что при инкубировании инфицированных клеток MDCK с Ингавирином ® продукция исследованных штаммов вируса гриппа достоверно уменьшалась и по показателям их титров в РГА и по показателям их инфекционности при титровании на клетках MDCK (табл. 2). Как следует из таблицы 2, индексы подавления продукции штаммов вируса гриппа под влиянием Ингавирина ® in vitro колебались в диапазоне от 0,7 до 3,2 lg. При этом наиболее высокое значение индекса подавления продукции вируса in vitro наблюдалось при инкубировании Ингавирина ® со штаммом вируса гриппа A/Chicken/Kurgan/ 05/2005 (H5N1) (табл. 2).
Таблица 2.
Показатели репродукции (титры) штаммов вируса гриппа А(H1N1)v в клетках MDCK в контроле и при инкубировании с Ингавирином ® через 4 сут после заражения
| Штаммы вируса гриппа | Доза заражения штамма вируса гриппа в lgТЦД50 /50 мкл | Репродукция штаммов вируса гриппа in vitro в контроле | Репродукция штаммов вируса гриппа in vitro при инкубировании с Ингавирином ® | |||
| Титры в РГА | Титры в РГА | Титры в lgТЦД50/мл, ±I95 | ||||
| A/California/04/2009 (H1N1)v | 2,0 | 1:32 | 4,0±0,6 | 1:16 | 1,5±0,0* | 2,5 |
| 1,0 | 1:32 | 4,0±0,6 | 1:8* | 1,5±0,0* | 2,5 | |
| A/California/07/2009 (H1N1)v | 1,7 | 1:512 | 7,5±0,0 | 1:256 | 6,5±0,8* | 1,0 |
| 0,7 | 1:256 | 6,5±0,0 | 1:64* | 5,3±0,8* | 1,2 | |
| A/Moscow/225/09 (H1N1)v | 1,3 | 1:32 | 2,5±0,0 | 1:32 | 2,5±0,0 | 0,0 |
| 0,3 | 1:32 | 2,5±0,0 | 1:16 | 1,5±0,0* | 1,0 | |
| A/Moscow/226/09 (H1N1)v | 2,5 | 1:16 | 3,0±0,6 | 1:16 | 2,3±0,5* | 0,7 |
| 1,5 | 1:16 | 2,5±0,0 | 1:4* | 1,8±0,5* | 0,7 | |
| A/Chicken/Kurgan/ 05/2005 (H5N1) | 2,0 | 1:256 | 6,0±0,6 | 1:64* | 2,8±0,5* | 3,2 |
| 1,0 | 1:256 | 6,0±0,6 | 1:64* | 2,8±0,5* | 3,2 | |
| A/Aichi/2/68 (H3N2) | 2,3 | 1:256 | 5,5±0,0 | 1:32* | 2,8±0,5* | 2,7 |
| 1,3 | 1:256 | 5,0±0,6 | 1:16* | 2,8±0,5* | 2,2 | |
Показано, что при внесении Ремантадина ® в клеточную культуру MDCK, инфицированную штаммами вируса гриппа, достоверно уменьшалась инфекционность только двух исследованных штаммов: A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) и A/Aichi/2/68 (H3N2) при достижении соответствующих индексов нейтрализации 2,2 и 2,0 (табл. 3). Как следует из таблицы 3, штаммы вируса гриппа A/California/04/2009 (H1N1)v, A/California/07/ 2009 (H1N1)v, A/Moscow/225/09 (H1N1)v и A/Moscow/226/09 (H1N1)v не изменяли своей инфекционности в клеточной культуре MDCK при инкубировании с Ремантадином ® .
Таблица 3.
Инфекционность (50% инфицирующая доза — ИД50 в клетках MDCK) штаммов вируса гриппа А(H1N1) in vitro в контроле и при инкубировании с Ремантадином ® через 4 сут после заражения
| Штаммы вируса гриппа | ИД50 штамма in vitro в контроле (в lgТЦД50/мл, ±I95) | ИД50 штамма in vitro при инкубировании с Ремантадином ® (в lgТЦД50/мл, ±I95) | Индекс нейтрализации (в lg) |
| A/California/04/2009 (H1N1)v | 4,3±0,4 | 4,1±0,4 | 0,2 |
| A/California/07/2009 (H1N1)v | 5,0±0,5 | 5,0±0,5 | 0,0 |
| A/Moscow/225/09 (H1N1)v | 5,6±0,3 | 5,6±0,3 | 0,0 |
| A/Moscow/226/09 (H1N1)v | 5,8±0,6 | 5,8±0,5 | 0,0 |
| A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) | 7,3±0,7 | 5,1±0,4* | 2,2* |
| A/Aichi/2/68 (H3N2) | 7,6±0,7 | 5,6±0,7* | 2,0* |
Определение продукции вируса гриппа в лунках с клетками, инфицированными наиболее низкими дозами штаммов вируса гриппа, при которых наблюдалась РГА в ≤100% лунок в контроле и в опыте, также показало отсутствие чувствительности к Ремантадину ® штаммов вируса гриппа A(H1N1)v (табл. 4). Так, для штаммов вируса гриппа A/California/04/2009 (H1N1)v, A/California/07/2009 (H1N1)v, A/Moscow/225/09 (H1N1)v и A/Moscow/226/09 (H1N1)v не было обнаружено снижения продукции при инкубировании инфицированных клеток MDCK с Ремантадином ® ни по титрам объединенных проб в РГА, ни по их инфекционности в культуре клеток MDCK (табл. 4). При этом наработка штаммов вируса гриппа A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) и A/Aichi/2/68 (H3N2) достоверно снижалась под воздействием Ремантадина ® (табл. 4). Как видно из табл. 4, при инкубировании инфицированных клеток MDCK с Ремантадином ® индексы подавления продукции штамма A/Chicken/Kurgan/ 05/2005 (H5N1) достигали значений 1,5 и 1,7 lg при соответствующих дозах заражения 3,0 и 2,0 lg ТЦД50/50 мкл, а индексы подавления продукции штамма A/Aichi/2/68 (H3N2) были равны 1,2 и 0,9 lg при дозах заражения 2,3 и 1,3 lg ТЦД50/50 мкл соответственно.
Таблица 4.
Показатели репродукции (титры) штаммов вируса гриппа A(H1N1)v в клетках MDCK в контроле и при инкубировании с Ремантадином ® через 4 сут после заражения
| Штаммы вируса гриппа | Доза заражения штамма вируса гриппа в lgТЦД50 50 мкл | Репродукция штаммов вируса гриппа in vitro при инкубировании с Ремантадином ® | Индекс подавления продукции вируса in vitro (в lg) | |||
| Титры в РГА | Титры в РГА | Титры в lgТЦД50/мл, ±I95 | ||||
| A/California/04/2009 (H1N1)v | 2,0 | 1:32 | 4,0±0,6 | 1:32 | 4,0±0,6 | 0,0 |
| 1,0 | 1:32 | 4,0±0,6 | 1:32 | 3,8±0,5 | 0,2 | |
| A/California/07/2009 (H1N1)v | 1,7 | 1:512 | 7,5±0,0 | 1:512 | 7,5±0,0 | 0,0 |
| 0,7 | 1:256 | 6,5±0,0 | 1:256 | 6,5±0,0 | 0,0 | |
| A/Moscow/225/09 (H1N1)v | 1,3 | 1:32 | 2,5±0,0 | 1:32 | 2,5±0,0 | 0,0 |
| 0,3 | 1:32 | 2,0±0,6 | 1:32 | 2,0±0,6 | 0,0 | |
| A/Moscow/226/09 (H1N1)v | 2,5 | 1:16 | 3,0±0,6 | 1:16 | 3,0±0,6 | 0,0 |
| 1,5 | 1:16 | 2,5±0,0 | 1:16 | 2,3±0,5 | 0,2 | |
| A/Chicken/Kurgan/ 05/2005 (H5N1) | 3,0 | 1:256 | 6,3±0,5 | 1:64* | 4,8±0,5* | 1,5 |
| 2,0 | 1:256 | 6,0±0,6 | 1:32* | 4,3±0,5* | 1,7 | |
| A/Aichi/2/68 (H3N2) | 2,3 | 1:256 | 5,5±0,0 | 1:64* | 4,3±0,5* | 1,2 |
| 1,3 | 1:256 | 5,0±0,6 | 1:32* | 4,1±0,4* | 0,9 | |
Полученные нами данные согласуются с ранее описанными результатами изучения противовирусной активности Ингавирина ® [11]. Так, авторами было обнаружено подавление гемагглютинирующей активности штаммов A/California/04/2009 (H1N1)v и A/California/07/ 2009 (H1N1)v под влиянием Ингавирина ® . Причем показатель эффективности Ингавирина ® по подавлению гемагглютинирующей активности этих штаммов был сопоставим с таковым в отношении штамма вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2). Изучение эффективности Ингавирина ® в культуре клеток MDCK по подавлению цитопатической активности штаммов вируса гриппа A/California/04/2009 (H1N1)v и A/California/07/ 2009 (H1N1)v также свидетельствовало о том, что Ингавирин ® эффективно ингибировал размножение вируса in vitro. При этом эффективность Ингавирина ® в культуре клеток MDCK в отношении подтипов вируса гриппа A(H1N1) по подавлению цитопатической активности была сопоставима с таковыми показателями в отношении штаммов вируса гриппа A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) и A/Aichi/2/68 (H3N2) [11].
Подавление гемагглютинирующей и цитопатической активности вируса гриппа А под влиянием Ингавирина ® в экспериментах in vitro может осуществляться благодаря противовирусному механизму действия препарата, который основан на подавлении репродукции вируса гриппа на этапе ядерной фазы, задержке миграции нового синтезированного нуклеопротеида вируса из цитоплазмы в ядро [12, 13].
Заключение
Таким образом, при изучении влияния Ингавирина ® и Ремантадина ® в культуре клеток MDCK на показатели гемагглютинирующей и цитопатической активности штаммов вируса гриппа A(H1N1/09)v была показана эффективность Ингавирина ® и отсутствие эффективности Ремантадина ® в отношении этих штаммов. В то же время Ингавирин ® и Ремантадин ® проявляли противовирусную эффективность в отношении используемых в работе референс-штаммов вируса гриппа A(H5N1) и A(H3N2).
Показано противовирусное действие интерферона альфа-2b человеческого рекомбинантного в отношении вируса гриппа птиц A (H7N9). При комбинации интерферона альфа-2b с альфа-токоферола-ацетатом и аскорбиновой кислотой его противовирусная активность увеличивае
The results demonstrate the presence of the antiviral effect of interferon alfa-2b recombinant human in relation to avian influenza A (H7N9). The combination of interferon alfa-2b with alpha-tocopherol acetate and ascorbic acid, its antiviral activity is 8 times increased.
Известно, что вирусы способны к фенотипической и генотипической изменчивости и постоянно формируют опасные для человеческой популяции варианты. Наибольшую проблему с точки зрения эпидемиологии представляет собой изменчивость вирусов гриппа [4]. Одним из механизмов формирования новых вариантов вируса гриппа является формирование реассоциатов в результате смешанного заражения. Наиболее частым источником образования новых вариантов вируса гриппа А являются водоплавающие и другие птицы [1, 4].
В настоящий момент Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) зафиксированы несколько вариантов вирусов гриппа птиц, способных инфицировать человека: штаммы вируса гриппа птиц А (H5N1) и A (H7N9) [1]. Впервые о заражении гриппом птиц A (H7N9) человека было сообщено 31 марта 2013 г. органами здравоохранения Китая, на сегодняшний день в ВОЗ поступили сообщения о 453 лабораторно подтвержденных случаях инфицирования людей вирусом птичьего гриппа A (H7N9), полученные от Национальной комиссии по здравоохранению и планированию семьи КНР, от Гонконгского Центра по охране здоровья и от Центров контроля заболеваний Тайбэя [1].
.jpg)
Несмотря на незначительное количество сообщений о заражении данным вирусом человека, вирус гриппа птиц A (H7N9) вызывает у врачей обеспокоенность в связи с тем, что у большинства пациентов заболевание протекало в тяжелой форме и в 175 случаях имело летальный исход [1]. Таким образом, своевременный поиск способов лечения данной инфекции является актуальной задачей.
Химиопрепараты против вируса гриппа представлены соединениями, оказывающими свое воздействие на разные стадии репликации вируса гриппа: препараты ремантадина блокируют белок М2 вируса гриппа. Препараты занамивир и осельтамивир действуют как ингибиторы нейраминидазы. В отношении препаратов группы ремантадина можно отметить их высокую токсичность и низкую эффективность, так как они активны только в отношении гриппа А, но не против гриппа В. Ингибиторы нейраминидазы являются эффективными препаратами, но, имея высокую стоимость, менее доступны для населения.
В организме человека основной системой, ответственной за борьбу с вирусными инфекциями, является система интерферона. В арсенале современной медицины имеются препараты рекомбинантного интерферона альфа-2b, широкий спектр противовирусной активности которых характеризован в многочисленных исследованиях как in vitro, так и in vivo [5].
По данным различных исследователей эффективность терапии интерфероном альфа-2b вирусных инфекций можно значительно повысить при помощи антиоксидантов [2, 3, 7, 8]. Впервые о синергизме интерферона альфа-2b и антиоксидантов в терапии вирусных инфекций сообщалось в работах В. В. Малиновской. По данным [7, 8] комбинация интерферона альфа-2b и антиоксидантов iv vitro и in vivo имеет выраженный синергидный эффект: в присутствии антиоксидантов специфическая противовирусная активность интерферона увеличивается в несколько раз, что позволяет не только повысить эффективность терапии, но и снизить возможность проявления побочных эффектов.
Целью настоящей работы явилось изучение противовирусной активности интерферона альфа-2b как противовирусного препарата в отношении вируса гриппа птиц A (H7N9) и оценка влияния антиоксидантов на течение экспериментальной инфекции in vitro.
Культура клеток
Линия клеток почки зеленой мартышки Vero клон Е6, получена из лаборатории культур тканей ФГБУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского. Культуру клеток выращивали в виде монослоя в 96-луночных планшетах при 37 °С в атмосфере 5% СО2 с использованием среды Игла МЕМ с добавлением антибиотиков (100 Ед/мл пенициллина и стрептомицина 50 МЕ/мл), глутамина 150 мкг/мл и 10% сыворотки крови эмбрионов коров (ростовая среда). В качестве поддерживающей использовали среду Игла с добавлением антибиотиков (100 Ед/мл пенициллина и стрептомицина 50 МЕ/мл), глутамина 150 мкг/мл и 2% инактивированной при 56 °С сыворотки крови эмбрионов коров.
Вирус
Штамм вируса гриппа птиц A/Anhui/2013 (H7N9) получен из лаборатории Государственной коллекции вирусов ФГБУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского. Для культивирования использовали алантоисную полость 9–10-дневных куриных эмбрионов.
Препараты
Цитотоксичность
Оценку цитотоксичности препаратов проводили по стандартной методике [6] путем инкубации 1-суточного монослоя клеточной культуры Vero клон Е6 с различными концентрациями препаратов в течение 72 часов в 96-луночных планшетах при 37 °С в атмосфере 5% СО2. После инкубации клетки отмывали раствором Хенкса, для подсчета количества клеток использовали автоматический счетчик клеток Cauntess, производства Invitrogen, США с применением 0,4% раствора трипанового синего. За ЦД50 (50% тканевая цитопатическая доза) испытуемого образца принимали максимальную концентрацию, способствующую выживанию не менее 50% клеток по сравнению с контролем. За МПК (максимально переносимая концентрация) испытуемого образца принимали максимальную концентрацию испытуемого образца, не вызывающую видимых изменений в жизнеспособности клеток.
Антивирусная активность
Антивирусную активность оценивали по уровню подавления цитопатического действия вируса различными разведениями препаратов и комбинаций на культуре клеток Vero клон Е6. Для работы использовали 1-суточный монослой культуры, выращенный в 96-луночных планшетах. Множественность инфицирования вируса гриппа птиц A/Anhui/2013 (H7N9) составила 0,1 ТЦД50 на клетку, продолжительность инкубации 48 часов при 37 °С в атмосфере 5% СО2. За ИК50 (50% ингибирующая концентрация) принимали концентрацию испытуемого образца, при которой клеточная культура оказалась полностью защищенной от цитопатического действия вируса в 50% лунок.
Изучение цитотоксического действия препаратов
Определенные максимальные переносимые концентрации препаратов, не оказывающие цитотоксического действия на культуру клеток Vero клон Е6, приведены в табл. 1.
Для работы на культуре клеток при определении антивирусной активности использовали концентрации препаратов меньше или равные МПК, указанные в табл. 1.
Изучение антивирусной активности препаратов
Определенные для препаратов ИК50 в отношении вируса гриппа птиц A/Anhui/2013 (H7N9) представлены в табл. 1. Для оценки возможной перспективы использования препарата в качестве химиотерапевтического средства в отношении вирусной инфекции использовали понятие ХТИ (химиотерапевтический индекс) — отношение максимально переносимой концентрации препарата к ИК50. Для эффективных противовирусных препаратов величина ХТИ должна быть более 3. Полученные данные в отношении антивирусной активности исследуемых препаратов показывают, что интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный может быть использован в качестве средства противовирусной терапии инфекции, вызываемой вирусом гриппа птиц A/Anhui/2013 (H7N9). Также показано, что антиоксидант Мексидол обладает слабовыраженной противовирусной активностью со значением ХТИ 4,0.
Изучение антивирусной активности комбинаций препаратов
Для изучения влияния антиоксидантов на антивирусную активность интерферона альфа-2b готовили растворы исследуемых препаратов с различной концентрацией как интерферона альфа-2b, так и антиоксидантов. Для оценки эффективности комбинации использовали понятие фракционного ингибирующего коэффициента (ФИК), значение которого вычисляли по формуле (ИД50 — 50% ингибирующая доза):
При значении ФИК 0,5 имеет место умеренный синергизм соединений, при значении ФИК, равном 1,0–1,5, имеет место аддитивный эффект комбинации, при значении ФИК более 2 имеет место антагонизм соединений [9]. Результаты оценки влияния антиоксидантов на антивирусную активность интерферона альфа-2b приведены в табл. 2.
Из представленных данных видно, что антиоксиданты оказывают стимулирующее действие на противовирусную активность интерферона альфа-2b: в присутствии разных концентраций антиоксидантов ИК50 интерферона альфа-2b снижается в 2 и более раза. Так, например, в присутствии аскорбиновой кислоты в концентрации 25 мкг/мл ИК50 интерферона альфа-2b снижается в 8 раз, при использовании концентрации 2,5 мкг/мл — в 2 раза. В присутствии аскорбата натрия в концентрации 25 мкг/мл ИК50 интерферона альфа-2b снижается в 8 раз, при использовании концентрации 2,5 мкг/мл — в 4 раза. При использовании альфа-токоферола ацетата в концентрации 25 мкг/мл и 2,5 мкг/мл ИК50 интерферона альфа-2b снижается в 8 раз. При совместном использовании с Мексидолом в концентрации 25 мкг/мл ИК50 интерферона альфа-2b снижается в 8 раз, при использовании в концентрации 2,5 мкг/мл — в 4 раза.
При анализе эффекта комбинированного применения антиоксидантов и интерферона альфа-2b путем расчета ФИК получены данные, демонстрирующие явно выраженный синергидный эффект для всех комбинаций, причем максимальный синергидный эффект наблюдали при комбинировании с альфа-токоферола ацетатом. Чуть менее выраженный синергидный эффект наблюдали при совместном применении интерферона альфа-2b и аскорбиновой кислоты, наименее выраженный синергизм наблюдали для комбинации интерферона альфа-2b и Мексидола.
Интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный является эффективным препаратом в отношении вируса гриппа птиц A/Anhui/2013 (H7N9), значение химиотерапевтического индекса препарата равно 16. Применение интерферона альфа-2b в комбинации с антиоксидантами повышает его эффективность в отношении вируса гриппа птиц A/Anhui/2013 (H7N9) в 8 раз, до величины химиотерапевтического индекса 128.
Литература
П. Г. Дерябин 1 , доктор медицинских наук, профессор, академик РАЕН
Г. А. Галегов, доктор медицинских наук, профессор
ФГБУ ФНИЦЭИМ им. Н. Ф. Гамалеи МЗ РФ, Москва
Читайте также: