Вирусологические методы исследования гриппа

ОРВИ и грипп имеют респираторные симптомы и общие. Их можно распознать по катаральным признакам со стороны дыхательных путей и общей симптоматике, характерной для большинства заболеваний.

Современные методы диагностики данной группы заболеваний

Различают несколько видов диагностики, которые различаются по особенностям проведения и методу выявления возбудителя. Это:

• экспресс-методы;
• серологическая диагностика;
• вирусологическая диагностика.

Первая группа - экспресс-методики. Это быстрый способ подтвердить или исключить наличие болезни. Используется метод флюоресценции и ПЦР. Рассмотрим их подробнее.

Изучение флюоресцирующих антител - МФА. Способ основан на определении антигенов к вирусу в эпителиальных клетках носовой слизистой, на конъюнктиве (если есть глазные поражения). Антитела при действии антигена реагируют специфическим свечением, которое легко заметить при микроскопическом исследовании. Этот параметр считается маркером диагностики и является основой для подтверждения результата. Способ имеет диагностическую ценность начиная с 3 и заканчивая 5 днем заболевания. Чувствителен к таким антигенам: вирус гриппа типа А, В, вирус парагриппа, аденовирусы и возбудитель РС-инфекции. Это удобный и быстрый метод, не требующий особых ресурсов, который часто применяется в ходе диагностики.

Метод полимеразно-цепной реакции базируется на основе обнаружения участков нуклеиновых кислот генетического материала вируса и определении их групповой принадлежности по этому критерию. Методика имеет высокую диагностическую ценность, является современным и качественным способом подтверждения заболевания. Считается “золотым стандартом” диагностики, так как не дает ложных результатов и является специфическим для определения конкретных патогенов, широко применяется в стационарных и амбулаторных условиях.

Вирусологические методики основаны на чистом выделении вирусных микроорганизмов и их конкретных штаммов, за чем следует их прикрепление к клеточным культурам в лабораторных условиях. Далее следует определение вида вируса с помощью ПЦР или других реакций. Метод требует значительных ресурсов, довольно длительный и трудоемкий. Его ценность заключается в получении эпидемиологических данных и основе для научных работ. То есть, детальное изучение вируса, частоты его распространения позволяет прогнозировать эпидемическую картину, создавать вакцины. Для исследования берется мазок из носа и носоглотки. Материал пригоден в течении 3-5 дня заболевания. С помощью вирусологических методов можно определить такие возбудители:

Серологические методы диагностики - это ретроспективное исследование, которое дает точные данные относительно стадии процесса, степени активности и типа возбудителя. Используется для эпидемиологических целей.

Для анализа используется сыворотка крови, в которой необходимо определить количество и виды антител. Используется известный антиген вируса. При возникновении реакции с материалом пациента формируются иммунные комплексы антиген-антитело, что подтверждает диагноз. Для диагностики также важен прирост титра антител, для чего используются парные сыворотки.

Результат имеет высокую точность и может определиться даже если все другие методы не дали результата, так как имеет высокую чувствительность. особенно важно использование метода для стертых форм с минимальными клиническими проявлениями. Сыворотки для анализа берутся в начале болезни, а также через 10-14 дней после её завершения. Используется метод для подтверждения наличия в организме таких возбудителей: вирусы гриппа А, В, возбудители парагриппа, аденовирусы и РС-вирусы.

Наличие вируса гриппа можно подтвердить с помощью РТГА - реакции торможения геммааглютинации. Метод основан на свойстве снижения гемагглютинирующих способностях вируса, если в крови есть антитела к нему. Для этого используется кровь с эритроцитами, антиген. Препараты крови берутся парными, в начале болезни, и в период выздоровления. Метод имеет высокую диагностическую ценность, точный и чувствительный.

Виды исследуемого материала и особенности сдачи

Для диагностики используются смывы из носа, мазки из носовых ходов, носоглотки, а также препараты крови.

Забор мазка и смыва проводит медицинский персонал. Он следит за тем, чтобы препараты строго соответствовали должной локализации. Забор проходит в чистых условиях, стерильными инструментами и в стерильную тару. До того, как взять мазки пациента просят высморкаться, чтобы очистить носовые ходы от слизи. Зонд вводится легко, на глубину 2-3 см. Проводится стандартное движение по нижней части носового хода и под раковиной носа. Необходимо, чтобы забор происходит в современной клинике, где есть возможность правильно хранить и транспортировать собранный материал в короткий срок до лаборатории.

Мазок из глотки берется по похожей методике, чтобы затронуть те участки слизистой, на которой скапливается возбудитель. Перед забором необходимо легко прополоскать рот, чтобы взятый материал был чистым. Желательно забирать материал на 3-й день после начал болезни.

Нормы и отклонения от них, расшифровка результатов

Экспресс-тест дает результаты сразу после диагностики, его расшифровка не вызывает трудностей, так как определяет наличие вируса или его отсутствие в организме.

Серологические реакции более сложные и могут расшифровываться по разному: наличие антител класса М говорит об острой стадии процесса, антитела G формируются при хроническом течении.

Сроки готовности результатов

Результаты исследования готовы на 1-2 день после сдачи. Экспресс-тест дает результат сразу. Серологические методы требуют больше затрат времени для сравнения титров антител. Более быстрые методы важны для диагностического процесса, а те, что более затратны - для эпидемиологического и научного исследования.

Скорость диагностики зависит от правильности сдачи препаратов, условий лаборатории, качества реактивов.

Вовремя сданный анализ позволяет точно и быстро определить диагноз. Это - залог правильного и эффективного лечения. Если болезнь запустить, она грозит осложнениями, которые особенно опасны, если у человека грипп. Это актуально для детей, пожилых людей, беременных женщин и лиц с дефицитом иммунной системы, ведь осложнения чаще всего проявляются у них.

Лаборатория АО "СЗЦДМ" предлагает услуги, обеспечивающие комплексное и преемственное лабораторное обследование пациента

Диагностика В медицинских центрах АО "СЗЦДМ" проводят качественные диагностические исследования всего организма

Лечение Наши медицинские центры ориентированы на обслуживание пациентов в амбулаторном режиме и объединены единым подходом к обследованию и лечению пациентов.

Реабилитация Реабилитация - это действия, направленные на всестороннюю помощь больному человеку или инвалиду для достижения им максимально возможной полноценности, в том числе и социальной или экономической.

Выезд на дом Внимание! Действует акция "Выезд на дом - 0 рублей"

Профосмотры АО "СЗЦДМ" проводит профилактические осмотры работников, которые включают в себя - комплексы лечебных и профилактических мероприятий, проводимых для выявления отклонений в состоянии здоровья, профилактики развития и распространения заболеваний.

Грипп – это острое инфекционное заболевание, протекающее с выраженной общей интоксикацией и поражением респираторного тракта, возбудителями которого являются РНК-содержащие вирусы семейства Ortho-myxoviridae (род Influenzavirus, типы А, В и С).

Возбудителями ОРВИ являются разнообразные многочисленные вирусы (более 200), вызывающие у людей катар верхних дыхательных путей с различной степенью интоксикации. Наиболее часто ОРВИ вы­зывают вирусы парагриппа, аденовирусы, реовирусы, коронавирусы, риновирусы, энтеровирусы,.

Лабораторная диагностика гриппа и ОРВИ состоит из экспресс-методов, выделения вируса, серологического исследования и метода генодиагностики (ПЦР) - схема 19.

Материалами для исследования при гриппе служат смывы из носоглотки, отде­ляемое слизистой оболочки носа, кро­вь, спинномозговая жидкость, трупный материал. При ОРВИ, вызванных вирусами парагриппа, РС вирусом, корона-, рео- и аденовирусами, исследуемым материалом являются носоглоточные смывы и отделяемое слизис­той оболочки задней стенки глотки, взятое ватным тампоном. Адено-, энтеро- и реовирусы удается обнаружить в крови, моче, фекалиях, трупном материале, а энтеровирусы в спин­номозговой жидкости.

Схема 19. Вирусологическая диагностика гриппа и ОРВИ

Экспресс-диагностиканаправлена навыявлениев исследуемом материале антигенов вирусов

Экспресс-диагностикагриппа и ОРВИ основана на выявлении антигенов вирусов с помощью прямой и непрямойРИФ. Положительная реакция характеризуется наличием в клетках эпителия скоплений антигена вируса с ярким зеленым свечением. Реже применяются РОНГА и ИФА.

Выделение вирусапри гриппе проводится на РКЭ или на культуре клеток (почек обезьян, фибробластов эмбриона человека или кур; в последние годы используется культура клеток легких собаки - MDSK, обладающая высокой чувствительностью к вирусу гриппа). Поскольку с 4 дня болезни содержание вируса гриппа в организме резко снижается, вирусологическое исследование необходимо выполнять в первые дни инфекции.

Исследуемый материал, обработанный антибиотиками, вводят по 0,2 мл 10—11-днев­ным куриным эмбрионам в полость амниона и аллантоиса. После инкубации эмбрионов в течение 3-4 дней при температуре 37 0 С, их вскрывают и аллантоисную жидкость отсасывают шприцем или пастеровской пипеткой, амниотическую — шприцем с короткой иглой. Индикацию вируса гриппа в указанных жидкостях проводят с помощью РГА с 1% взвесью куриных эритроцитов. Индикацию вируса в культуре клеток осуществляют по ЦПД, а также с помощью РИФ и РГадс с эритроцитами морской свинки.

При ОРВИ выделение вирусов обычно проводится на первично-трипсинизированных и перевиваемых культурах ткани различного происхождения. Наличие вируса в клетках культуры ткани определяют по его цитопатическому действию, которое у вируса парагриппа и РС вируса проявляется образованием синцития, а у аденовирусов и реовирусов - появлением зернистости и включений в цитоплазме.

Идентификацию вирусов гриппа и ОРВИ выполняют с помощью РТГА, РСК, РН, ИФА, РТГадс.

Серологический методзаключается в определении антител в парных сыворотках крови больных гриппом с помощью РСК, РТГА, ИФА, РРГ, РН. Нарастание титра антител в 4 и более раз подтверждает диагноз гриппа.

Генодиагностика.Для диагностики гриппа разработана ПЦР.

Самостоятельная работа студентов

Вирусологическая диагностика гриппа

1. Экспресс-диагностика - выявление антигена вируса гриппа в мазках-отпечатках со слизистой оболочки полости носа больного с подозрением на грипп (прямая РИФ, демонстрация).

2. Вирусологический метод :

· индикация вируса гриппа на культуре клеток с помощью реакции гемадсорбции (демонстрация);

· индикация вируса в аллантоисной жидкости РКЭ с помощью реакции гемагглютинации (самостоятельная работа);

· идентификация вируса с помощью РТГА, поставленной с аллантоисной жидкостью и гриппозными диагностическими сыворотками ( H1N1, H2N2, H3N2 - демонстрация).

Серологический метод.

· учет РТГА с парными сыворотками крови больного, опре­делить нарастание титра антител . (демонстрация);

· учет РП в геле - с целью определения антител к М-полипептиду вируса гриппа (демонстрация);

· учет реакции радиального гемолиза с сы­вороткой крови больного гриппом (демонстрация).

4. Экспресс-диагностика аденовирусной инфекции (выявление специфического антигена аденовирусов в клетках эпителия слизистой оболочки носоглот­ки с помощью прямой РИФ - демонстрация).

Вирусологи́ческие методы исследования

Методы изучения биологии вирусов и их идентификации. В вирусологии широко используются методы молекулярной биологии, с помощью которых удалось установить молекулярную структуру вирусных частиц, способы проникновения их в клетку и особенности репродукции вирусов, первичной структуры вирусных нуклеиновых кислот и белков. Развиваются методы определения последовательности составляющих элементов вирусных нуклеиновых кислот и аминокислот белка. Появляется возможность связать функции нуклеиновых кислот и кодируемых ими белков с последовательностью нуклеотидов и установить причины внутриклеточных процессов, играющих важную роль в патогенезе вирусной инфекции.

Вирусологические методы исследования основаны также на иммунологических процессах (взаимодействие антигена с антителами), биологических свойствах вируса (способность к гемагглютинации, гемолизу, ферментативная активность), особенностях взаимодействия вируса с клеткой-хозяином (характер цитопатического эффекта, образование внутриклеточных включений и т.д.).

В диагностике вирусных инфекций, при культивировании, выделении и идентификации вирусов, а также при получении вакцинных препаратов широко применяют метод культуры ткани и клеток. Используют первичные, вторичные, стабильные перевиваемые и диплоидные клеточные культуры. Первичные культуры получают при диспергировании ткани протеолитическими ферментами (трипсином, коллагеназой). Источником клеток могут быть ткани и органы (чаще почки) эмбрионов человека и животных. Суспензию клеток в питательной среде помещают в так называемые матрацы, бутыли или чашки Петри, где после прикрепления к поверхности сосуда клетки начинают размножаться. Для заражения вирусами используют обычно клеточный монослой. Питательную жидкость сливают, вносят вирусную суспензию в определенных разведениях и после контакта с клетками добавляют свежую питательную среду, обычно без сыворотки.

Клетки большинства первичных культур могут быть пересеяны, такая культура называется вторичной. При дальнейшем пассировании клеток формируется популяция фибробластоподобных клеток, способных к быстрому размножению, большая часть которых сохраняет исходный набор хромосом. Это так называемые диплоидные клетки. При серийном культивировании клеток получают стабильные перевиваемые клеточные культуры. При пассажах появляются быстро делящиеся однородные клетки с гетероплоидным набором хромосом. Стабильные линии клеток могут быть однослойными и суспензионными. Однослойные культуры растут в виде сплошного слоя на поверхности стекла, суспензионные — в виде суспензий в различных сосудах с использованием перемешивающих устройств. Существует более 400 линий клеток, полученных от 40 различных видов животных (в т.ч. от приматов, птиц, рептилий, амфибий, рыб, насекомых) и человека.

В искусственных питательных средах можно культивировать кусочки отдельных органов и тканей (органные культуры). Эти типы культур сохраняют структуру ткани, что особенно важно для выделения и пассирования вирусов, которые не репродуцируются в недифференцированных тканевых культурах (например, коронавирусы).

В зараженных клеточных культурах вирусы можно обнаружить по изменению морфологии клеток, цитопатическому действию, которое может иметь специфический характер, появлению включений, путем определения вирусных антигенов в клетке и в культуральной жидкости; установления биологических свойств вирусного потомства в культуральной жидкости и титрования вирусов в культуре ткани, куриных эмбрионах или на чувствительных животных; путем выявления отдельных вирусных нуклеиновых кислот в клетках методом молекулярной гибридизации или скоплений нуклеиновых кислот цитохимическим методом с помощью люминесцентной микроскопии.

Выделение вирусов является трудоемким и длительным процессом. Его осуществляют с целью определения циркулирующего среди населения типа или варианта вируса (например, для идентификации сероварианта вируса гриппа, дикого или вакцинного штамма вируса полиомиелита и т.д.); в случаях, когда это необходимо для проведения срочных эпидемиологических мероприятий; при появлении новых типов или вариантов вирусов; при необходимости подтверждения предварительного диагноза; для индикации вирусов в объектах окружающей среды. При выделении вирусов учитывают возможность их персистирования в организме человека, а также возникновения смешанной инфекции, вызванной двумя и более вирусами. Генетически однородная популяция вируса, полученная от одного вириона, называется вирусным клоном, а сам процесс получения его — клонированием.

Для выделения вирусов применяют заражение восприимчивых лабораторных животных, куриных эмбрионов, но чаще всего используют культуру ткани. Наличие вируса обычно определяют по специфической дегенерации клеток (цитопатический эффект), образованию симпластов и синцитиев, обнаружению внутриклеточных включений, а также специфического антигена, выявляемого с помощью методов иммунофлюоресценции, гемадсорбции, гемагглютинации (у гемагглютинирующих вирусов) и т.д. Эти признаки могут обнаруживаться лишь после 2—3 пассажей вируса.

Для выделения ряда вирусов, например вирусов гриппа, используют куриные эмбрионы, для выделения некоторых вирусов Коксаки и ряда арбовирусов — новорожденных мышей. Идентификацию выделенных вирусов проводят с помощью серологических реакций и других методов.

При работе с вирусами определяют их титр. Титрование вирусов проводят обычно в культуре ткани, определяя наибольшее разведение вируссодержащей жидкости, при котором происходит дегенерация ткани, образуются включения и вирусоспецифические антигены. Для титрования ряда вирусов можно использовать метод бляшек. Бляшки, или негативные колонии вирусов, представляют собой очаги разрушенных под действием вируса клеток однослойной культуры ткани под агаровым покрытием. Подсчет колоний позволяет провести количественный анализ инфекционной активности вирусов из расчета, что одна инфекционная частица вируса образует одну бляшку. Бляшки выявляют путем окрашивания культуры прижизненными красителями, обычно нейтральным красным; бляшки не адсорбируют краситель и поэтому видны как светлые пятна на фоне окрашенных живых клеток. Титр вируса выражают числом бляшкообразующих единиц в 1 мл.

Очистку и концентрацию вирусов обычно осуществляют путем дифференциального ультрацентрифугирования с последующим центрифугированием в градиентах концентраций или плотности. Для очистки вирусов применяют иммунологические методы, ионно-обменную хроматографию, иммуносорбенты и т.д.

Лабораторная диагностика вирусных инфекций включает обнаружение возбудителя или его компонентов в клиническом материале; выделение вируса из этого материала; серодиагностику. Выбор метода лабораторной диагностики в каждом отдельном случае зависит от характера заболевания, периода болезни и возможностей лаборатории. Современная диагностика вирусных инфекций основана на экспресс-методах, позволяющих получать ответ через несколько часов после взятия клинического материала в ранние сроки после заболевания, К ним относятся электронная и иммунная электронная микроскопия, а также иммунофлюоресценция, метод молекулярной гибридизации, выявление антител класса lgM и др.

Электронная микроскопия вирусов, окрашенных методом негативного контрастирования, позволяет дифференцировать вирусы и определять их концентрацию. Применение электронной микроскопии в диагностике вирусных инфекций ограничивается теми случаями, когда концентрация вирусных частиц в клиническом материале достаточно высокая (10 5 в 1 мл и выше). Недостатком метода является невозможность отличать вирусы, принадлежащие к одной таксономической группе. Этот недостаток устраняется путем использования иммунной электронной микроскопии. Метод основан на образовании иммунных комплексов при добавлении специфической сыворотки к вирусным частицам, при этом происходит одновременная концентрация вирусных частиц, позволяющая идентифицировать их. Метод применяют также для выявления антител. В целях экспресс-диагностики проводят электронно-микроскопическое исследование экстрактов тканей, фекалий, жидкости из везикул, секретов из носоглотки. Электронную микроскопию широко используют для изучения морфогенеза вируса, ее возможности расширяются при применении меченых антител.

Метод молекулярной гибридизации, основанный на выявлении вирусоспецифических нуклеиновых кислот, позволяет обнаружить единичные копии генов и по степени чувствительности не имеет себе равных. Реакция основана на гибридизации комплементарных нитей ДНК или РНК (зондов) и формировании двунитчатых структур. Наиболее дешевым зондом является клонированная рекомбинантная ДНК. Зонд метят радиоактивными предшественниками (обычно радиоактивным фосфором). Перспективно использование колориметрических реакций. Существует несколько вариантов молекулярной гибридизации: точечная, блот-гибридизация, сэндвич-гибридизация, гибридизация in situ и др.

Антитела класса lgM появляются раньше, чем антитела класса G (на 3—5-й день болезни) и исчезают через несколько недель, поэтому их обнаружение свидетельствует о только что перенесенной инфекции. Антитела класса lgM выявляют методом иммунофлюоресценции или с помощью иммуноферментного анализа, используя анти- μ-антисыворотки (сыворотки против тяжелых цепей lgM).

Серологические методы в вирусологии основаны на классических иммунологических реакциях (см. Иммунологические методы исследования): реакции связывания комплемента, торможения гемагглютинации, биологической нейтрализации, иммунодиффузии, непрямой гемагглютинации, радиального гемолиза, иммунофлюоресценции, иммуноферментного, радиоиммунного анализа. Разработаны микрометоды многих реакций, техника их непрерывно совершенствуются. Эти методы используют для идентификации вирусов с помощью набора известных сывороток и для серодиагностики с целью определения нарастания антител во второй сыворотке по сравнению с первой (первую сыворотку берут в первые дни после заболевания, вторую — через 2—3 нед.). Диагностическое значение имеет не менее чем четырехкратное нарастание антител во второй сыворотке. Если выявление антител класса lgM свидетельствует о недавно перенесенной инфекции, то антитела класса lgC сохраняются в течение нескольких лет, а иногда и пожизненно.

Для идентификации индивидуальных антигенов вирусов и антител к ним в сложных смесях без предварительной очистки белков используют иммуноблоттинг. Метод сочетает фракционирование белков с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующей иммуноиндикацией белков иммуноферментным методом. Разделение белков снижает требования к химической чистоте антигена и позволяет выявлять индивидуальные пары антиген — антитело. Такая задача актуальна, например, при серодиагностике ВИЧ-инфекции, где ложноположительные реакции иммуноферментного анализа обусловлены наличием антител к клеточным антигенам, которые присутствуют в результате недостаточной очистки вирусных белков. Идентификация антител в сыворотках больных к внутренним и наружным вирусным антигенам позволяет определять стадию заболевания, а при анализе популяций — изменчивость вирусных белков. Иммуноблоттинг при ВИЧ-инфекции применяют как подтверждающий тест для выявления индивидуальных вирусных антигенов и антител к ним. При анализе популяций метод используют для определения изменчивости вирусных белков. Большая ценность метода заключается в возможности анализа антигенов, синтезируемых с помощью технологии рекомбинантных ДНК, установлении их размеров и наличия антигенных детерминант.

Библиогр.: Букринская А.Г. Вирусология, М., 1986; Вирусология, Методы, под ред. Б. Мейхи, пер. с англ., М., 1988; Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, под ред. М.О. Биргера, М., 1982.

Известно более 200 разновидностей вирусов, избирательно поражающих респираторный тракт человека (возбудителей ОРВИ).

У большинства возбудителей ОРВИ первичное размножение вирусов происходит в слизистой оболочке дыхательной системы, поэтому клиническая картина сходная, заболевание протекает в виде ринита, ринофарингита, как правило, в легкой форме. У детей раннего возраста вирусы могут поражать нижние отделы респираторного тракта, и болезнь протекает в более тяжелой форме в виде бронхитов, бронхиолитов, пневмоний. Наиболее тяжело протекающей острой вирусной респираторной инфекцией является грипп, который часто принимает эпидемическое распространение, характеризуется явлениями общей интоксикации, лихорадкой, поражением дыхательного тракта, нервной и сердечно-сосудистой систем. Максимальное число тяжелых форм течения инфекции наблюдается в период пандемий, обусловленных новым вариантом вируса гриппа.

Лаборатория оуществляет диагностику с помощью экспресс-методов, вирусологических и серологических методов исследования. Быстрая (экспресс) диагностика гриппа и ОРВИ:

1)метод флюоресцирующих антител (МФА) - основан на выявлении вирусных антигенов в клетках эпителия носовых ходов, конъюнктивы (при явлениях конъюнктивита). Исследуемый материал: мазки из носа, конъюнктивы, взятые в первые 3 дня и не позднее 5 дня болезни. Определяемые возбудители: - вирусы сезонного гриппа типа А (H1N1) - вирусы сезонного гриппа типа А (H3N2) - вирусы гриппа типа В - вирусы парагриппа 1, 2, 3 типов - аденовирусы - респираторно-синцитиальный вирус;

2) метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)- основан на обнаружении в клинических пробах генетического материала вирусов (РНК или ДНК)- является наиболее современным, высокочувствительным методом.

Исследуемый материал: мазки из носа и зева, взятые в первые 3 дня и не позднее 5 дня болезни, секционный материал. Определяемые возбудители:

- вирусы пандемического высокопатогенного гриппа типа А (H1N1)

- вирусы гриппа типа А

- вирусы гриппа типа В - вирусы парагриппа 1, 2, 3,4 типов

- аденовирусы - респираторно-синцитиальный вирус;

Вирусологическая диагностика - выделение вируса на чувствительной клеточной культуре с последующей идентификацией в реакции нейтрализации или ПЦР.

Этот метод отличается трудоемкостью и длительностью и используется, главным образом, для эпидемиологических и научных целей (изучается изменчивость вирусов, что помогает прогнозировать эпидемические подъемы гриппа, отбираются актуальные штаммы, пригодные для изготовления вакцин) Исследуемый материал: мазки из носа и зева (в первые 3 дня и не позднее 5 дня болезни).

- вирусы гриппа типа А (разные серотипы)

- вирусы гриппа типа В Серологическая диагностика является ретроспективной. Она выявляет прирост титров антител к возбудителям заболевания в парных сыворотках крови, что позволяет установить точную этиологию даже при отрицательных результатах других методов лабораторной диагностики, а также при бессимптомном или атипичном течении гриппа, широко применяется и для эпидемиологических целей. Исследуемый материал: сыворотки крови, взятые в начале заболевания и через 10- 14 дней.

Возбудители к которым определяется прирост титров антител:

- вирусы сезонного гриппа типа А (H1N1)

- вирусы сезонного гриппа типа А (H3N2) - вирусы гриппа типа В

- вирусы парагриппа 1, 2, 3 типов

В период подьема заболевамости гриппом и ОРВИ (в октябре- декабре 2009г.) вирусологической лабораторией обследовано методом флюоресцирующих антител (МФА) 432 человека. У 27% заболевших был выявлен аденовирус, у 8,3% - вирус парагриппа 3 типа, у 8% - респираторно-синцитиальный вирус, у 2% - вирусы парагриппа 1, 2 типов, у 0,2% - вирус сезонного гриппа типа А (H1N1).

При обследовании методом ПЦР 565 больных с подозрением на высокопатогенный грипп типа А (H1N1) РНК вируса обнаружена у 213 человек (в 38% проб). По даннным серологического обследования 67 больных ( в октябре и ноябре) заболевания гриппозной этиологии составили 4,3 % (грипп А(H1N1) сезонный - 2 человека), парагрипп 3 типа — 4,5% ( 3 человека), парагрипп 2 типа — 1,5% ( 1человек).

Об актуальных изменениях в КС узнаете, став участником программы, разработанной совместно с ЗАО "Сбербанк-АСТ". Слушателям, успешно освоившим программу выдаются удостоверения установленного образца.

Программа разработана совместно с ЗАО "Сбербанк-АСТ". Слушателям, успешно освоившим программу, выдаются удостоверения установленного образца.

Методические указания МУК 4.2.2136-06 “Организация и проведение лабораторной диагностики заболеваний, вызванных высоковирулентными штаммами вируса гриппа птиц типа А (ВГПА), у людей” (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ 9 ноября 2006 г.)

В справке нет пункта 3!

Дата введения: с момента утверждения

ВГПА - вирус гриппа птиц типа А

Биобезопасность - биологическая безопасность

ЛПУ - лечебно-профилактические учреждения

МФА - метод иммунофлуоресцирующих антител

ОТ-ПЦР - метод обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции

1.1 В настоящих методических указаниях определены порядок сбора, упаковки, хранения, транспортирования и выполнения лабораторных исследований биологического материала от больных (и умерших) пациентов при лабораторной диагностики заболеваний, вызванных высоковирулентными штаммами вируса гриппа птиц типа А (ВГПА).

1.2 Методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, лечебно-профилактических и других организаций, независимо от организационно-правовой формы.

3.1 При эпизоотическом неблагополучии в России и за рубежом по ВГПА и при отсутствии лабораторно подтвержденных случаев заболевания людей на данной территории:

3.1.1 Забор материала от пациентов (или умерших) с подозрением на инфекцию ВГПА проводят в лечебно-профилактических учреждениях (ЛПУ).

Применяемые на этом этапе тест-системы должны обеспечивать первичную идентификацию возбудителя как вируса гриппа типа А и дифференциацию штаммов этого вируса по типу гемагглютинина (например Н5).

3.1.4 При получении положительных результатов подтверждающего тестирования референс-лаборатория проводит изоляцию вируса, изучение его свойств и депонирование.

Максимальное внимание должно уделяться случаям ВГПА с предположительной передачей от человека человеку. Регистрация подобных случаев требует незамедлительного проведения комплекса противоэпидемических мероприятий и изучения генетических особенностей изолята ВГПА.

3.2 При наличии лабораторно подтвержденных случаев заболевания людей ВГПА на данной территории:

3.2.1 Забор материала проводят в ЛПУ при подозрении на заболевание ВГПА.

3.2.3 Обязательное подтверждающее тестирование в референс-лаборатории не проводится. Направление материала в референс-лабораторию осуществляется в случаях возникновения противоречивых результатов при первичном тестировании.

4.3 Для исследования забирают следующие виды клинического материала:

- смывы из полости носа и ротоглотки (для ОТ-ПЦР-анализа);

- мазки из полости носа (для МФА и ОТ-ПЦР-анализа) и ротоглотки (для ОТ-ПЦР-анализа);

- носоглоточное отделяемое (для выделения вируса, ОТ-ПЦР-анализа).

- фекалии (для ОТ-ПЦР-анализа).

Перечисленные выше процедуры по забору клинического материала врачи осуществляют в противочумных костюмах IV типа (или длинном хирургическом халате, с завязками на спине, шапочках), дополненных ватно-марлевыми повязками или респираторами типа ШБ-1 (или РБ) “Лепесток-200”. На руки надевают резиновые перчатки.

Целесообразно также включать в исследование аспираты из трахеи, бронхоальвеолярный лаваж и биоптаты легких при возможности их забора. Данные процедуры осуществляет врачебный персонал, одетый в противочумный костюм I типа (или длинный хирургический халат, с завязками на спине, дополненный фартуком, бахилами, косынкой, очками, ватно-марлевой повязкой или респиратором типа ШБ-1 (или РБ) “Лепесток-200” и перчатками).

Выбор времени забора клинического материала очень важен, так как наиболее высокое содержание вируса в дыхательных органах человека регистрируется в течение первых четырех дней после появления признаков заболевания. Образцы должны быть собраны в течение 3 сут. после появления клинических признаков, указанных в п. 6.1.

Для постмортальной диагностики используют аутоптаты легких, трахеи и селезенки.

От одного больного должно забираться не менее трех видов клинического материала. Обязательно следует забирать мазки из полости носа и роторлотки и носоглоточное отделяемое. Каждый образец материала помещают в отдельную транспортную емкость.

4.4 Сбор материала производят в пробирки со стабилизирующей средой, приготовленной согласно приложению 4, и/или в пробирки с транспортной средой, предоставляемой (или рекомендуемой) фирмой-производителем тест-систем.

4.5 Отправку материала в лабораторию осуществляют в транспортной таре со стабилизирующей средой (приложение 4).

1) в транспортную емкость (плотно закрывающиеся пластмассовые пробирки или флаконы с завинчивающимися крышками); плотно закрытый верхний конец транспортной емкости вместе с крышкой герметизируют различными пластификаторами (парафин, парафильм и др.); емкость маркируют;

2) в полиэтиленовый пакет подходящего размера с ватой (или другим гигроскопичным материалом) в количестве достаточном для адсорбции всего образца в случае его утечки; полиэтиленовый пакет следует герметично заклеить или запаять;

5.1.1 Образцы от одного пациента могут быть упакованы в один полиэтиленовый пакет. Не допускается упаковывать образцы материалов от разных людей в один и тот же пакет.

5.1.2 В полиэтиленовый пакет вкладывают бланк направления с указанием: наименование направляющего учреждения, ФИО больного, возраст, место жительства, предварительный диагноз, эпидемиологический анамнез, вид материала, дата и время взятия материала.

5.2 Герметично закрытые полиэтиленовые пакеты помещают в термоизолирующий плотнозакрывающийся контейнер (термос), приспособленный для транспортирования биологических материалов.

5.2.1 В термоконтейнеры и термосы помещают охлаждающие элементы или пакеты со льдом. К наружной стенке термоконтейнера или термоса прикрепляют этикетку с указанием вида материала, условий транспортирования, названия пункта назначения. Сроки и условия транспортирования упакованных проб клинического материала указаны в приложении 2.

5.3 Транспортирование проб клинического материала в референс-лабораторию, вирусологические лаборатории и лаборатории учреждений противочумной системы Роспотребнадзора осуществляется нарочным(и), информированным о правилах доставки материала в соответствии с п. 3.4. СП 1.2.036-95.

6.1 При отсутствии лабораторно подтвержденных случаев заболевания людей на данной территории лабораторные исследования с целью диагностики ВГПА следует проводить у пациентов с респираторными заболеваниями тяжелого течения и неясной этиологии при наличии как минимум двух из перечисленных (следующего комплекса - убрать) симптомов:

- фебрильная лихорадка с температурой тела выше 380C;

- затрудненное дыхание или дыхательная недостаточность;

- водянистая диарея при отсутствии слизи и крови в фекалиях;

в комбинации хотя бы с одним из следующих эпидемиологических признаков в период 1-7 дней перед появлением симптомов :

- посещение мест регистрации заболевания ВГПА у птиц или людей;

- тесный контакт (в радиусе 1 метра) с лицом, являющимся подозрительным, вероятным или подтвержденным случаем ВГПА;

- контакт с погибшими или больными птицами, уход, убой, ощипывание, разделка тушек, подготовка к употреблению домашней или дикой птицы или контакт с их останкам или объектами окружающей среды, контаминированными их фекалиями на территории, где в течение последнего месяца были заподозрены или подтверждены случаи инфекции ВГПА у животных или людей;

- манипуляции с образцами клинического материала (от животных или людей), подозрительным на зараженность ВГПА в лаборатории или в иной обстановке;

- употребление сырых или недостаточно приготовленных продуктов из домашней птицы на территории, где в течение последнего месяца были заподозрены или подтверждены случаи инфекции ВГПА у животных или людей.

- Тесный контакт с подтвержденно инфицированным ВГПА животным, но не домашними или дикими птицами (например, кошка или свинья).

Данный случай расценивается как подозрительный случай ВГПА.

Вероятный случай ВГПА - лицо, умершее от необъясненного острого респираторного заболевания, которое расценивается как эпидемиологически связанное по времени, месту и экспозиции с вероятным или подтвержденным случаем ВГПА, а также лицо, отвечающее критериям для подозрительного случая, и одному из дополнительных критериев:

a. инфильтраты или признаки острой пневмонии на рентгенограмме грудной клетки плюс признаки дыхательной недостаточности (гипоксемия, выраженное тахипноэ) или

b. положительный результат лабораторного подтверждения инфекции, вызванной вирусом гриппа А, но недостаточное лабораторное подтверждение инфекции.

6.2 При наличии лабораторно подтвержденных случаев заболевания людей ВГПА на данной территории показанием к обследованию являются клинические симптомы, приведенные в п. 6.1. Дополнительные эпидемиологические признаки являются необязательными.

6.3 Исследование секционного материала от умерших на наличие вируса ВГПА проводят при:

- сходстве клинической картины заболевания, приведшего к летальному исходу, с описанной в п. 6.1 или невозможности исключения такой клинической картины в анамнезе и при наличии в анамнезе хотя бы одного из перечисленных в п.п. 6.1 дополнительных эпидемиологических признаков.

6.4 Исследования проводят с использованием диагностических тест-систем, разрешенных к применению в установленном порядке. Для выявления ВГПА методом ОТ-ПЦР предпочтение должно отдаваться диагностическим тест-системам, которые обеспечивают максимальную контаминационную безопасность исследований.

6.5 При проведении первичного тестирования на наличие вируса ВГПА должны исследоваться не менее 2 видов клинического материала (например: мазки из полости носа и из ротоглотки) с использованием как минимум двух методов - ОТ-ПЦР и МФА.

6.6 При получении отрицательных результатов исследования всех образцов выдается окончательный отрицательный ответ.

При отсутствии регистрации заболевания людей, вызванных ВГПА, на данной территории при получении хотя бы одного положительного результата при МФА исследовании или использовании ОТ-ПЦР выдается предварительный положительный ответ и образцы направляют для подтверждающего тестирования в референс-лабораторию.

В период регистрации заболевания людей, вызванных ВГПА на данной территории, обязательное подтверждающее тестирование не проводят, и при получении хотя бы одного положительного результата при вирусологическом исследовании или использовании ОТ-ПЦР выдается окончательный положительный ответ.

6.7 При подтверждении в референс-лаборатории положительного результата первичного тестирования, при исследовании хотя бы одного вида клинического материала выдается окончательный положительный ответ.

При получении в референс-лаборатории отрицательных результатов исследования двух видов клинического материала проводится повторное тестирование. При получении аналогичного результата выдается окончательный отрицательный ответ.

7.1 Первичное исследование материала от больного, подозрительного на зараженность вирусом ВПГА, проводят в лабораториях, имеющих разрешение на работу с ПБА III-IV групп патогенности.

Подтверждающее тестирование осуществляется в референс-лаборатории.

7.2 Проведение работ, не связанных с накоплением вируса, образованием аэрозолей инфицированного материала (окраска и просмотр мазков, постановка серологических реакций с необеззараженным, диагностическим материалом, серологические исследования с необеззараженным материалом) осуществляют в противочумном костюме IV типа, дополненном ватно-марлевой повязкой или респиратором типа ШБ-1 (или РБ) “Лепесток-200 и резиновыми перчатками. Работы проводят в боксе биологической безопасности II класса.

7.3 Проведение работ по заражению культур клеток или куриных эмбрионов, а также связанных с возможностью образования аэрозоля осуществляют в боксах безопасности III класса. Работы проводят в противочумном костюме IV типа, дополненном ватно-марлевой повязкой или респиратором типа ШБ-1 (или РБ) “Лепесток-200 и резиновыми перчатками.

7.4 Аптечка экстренной профилактики лабораторий, проводящих диагностику заболеваний, вызванных ВГПА, должна быть укомплектована в соответствии с СП 1.3.1285-03 и дополнена двумя из следующих противовирусных препаратов: Циклоферона и Амиксина, Ремантадина, Альгирема, Арбидола и Озельтамивира (Тамифлю).

7.5 Режимы обеззараживания различных объектов при лабораторной диагностике ВГПА (в соответствии с СП 1.3.1285-03).

7.5.1 Обеззараживание поверхностей помещения (пол, стены, двери), оборудования, рабочих столов и др. - двукратным протиранием с интервалом 15 мин 6% раствором перекиси водорода или 3% раствором хлорамина (экспозиция 120 мин), либо любым дезинфицирующим средством, обладающим вирулицидной активностью, с последующей обработкой УФ в течение 60 мин.

Запрещено одновременное использование 6% раствора перекиси водорода и 3% раствора хлорамина в пределах одной лаборатории в связи с опасностью взрывоподобного характера протекания химической реакции при смешении этих растворов.

7.5.2 Обеззараживание защитной одежды осуществляют:

а) кипячением в 2% растворе соды в течение 30 мин с момента закипания;

б) замачиванием на 30 мин при 50. С в 3% растворе перекиси водорода с 0,5% моющего средства.

7.5.3 Обеззараживание перчаток - замачиванием на 60 мин в 6% растворе перекиси водорода с 0,5% моющего средства или в 3% растворе хлорамина.

7.5.4 Обеззараживание лабораторной посуды, автоклавируемых дозаторов, наконечников, вируссодержащих жидкостей, агарозного геля, инструментария из металла проводится методом автоклавирования - давление 2,0 кГс/см2 (0,2 Мпа), температура 132+-2. С, время 45 мин.

7.5.5 Обеззараживание дозаторов - двукратным протиранием поверхностей дозатора с интервалом 15 мин 6% раствором перекиси водорода, с последующей обработкой в парах формалина в течение 60 мин.

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко

Рекомендуется использование следующей стабилизирующей среды для хранения и транспортировки материала от людей для дальнейших вирусологических исследований.

Среда готовится в стерильных условиях, автоклавирование не допускается, можно стерилизовать фильтрованием через нитроцеллюлозный стерильный фильтр в стерильную же посуду.

- среда для культур клеток N199, содержащая 0,5% BSA;

- пенициллин 2 х 10(6) ед./л, стрептомицин 200 мг/л, полимиксин В 2 х 10(6) ед./л, гентамицин 250 мг/л, нистатин 0,5 х 10(6) ед./л.

Методические указания МУК 4.2.2136-06 “Организация и проведение лабораторной диагностики заболеваний, вызванных высоковирулентными штаммами вируса гриппа птиц типа А (ВГПА), у людей” (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ 9 ноября 2006 г.)

Текст методические указания официально опубликован не был

2. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 9 ноября 2006 г.