Вирусы гриппа разрушают эритроциты

Агглютинация эритроцитов при вирусных инфекциях обнаруживается либо в результате прямого взаимодействия вируса с поверхностью эритроцитов (реакция гемагглютинации — РГА), либо вследствие взаимодействия с противовирусной иммунной сывороткой эритроцитов, предварительно сенсибилизированных вирусным антигеном (реакция непрямой или пассивной гемагглютинации — РНГА, РПГА). Агглютинация следует за адсорбцией вируса или его антигена на поверхности нативных или формалинизированных эритроцитов. РГА наступает непосредственно в смеси гемагглютинирующего вируса с эритроцитами. Стабильность агглютинации зависит от наличия или отсутствия в составе вириона рецептор-деструирующего энзима, быстро разрушающего при t° 37° вирусные рецепторы на поверхности эритроцитов, вследствие чего наступает элюция (освобождение) вируса и расклеивание эритроцитов. Медленная спонтанная элюция наступает на холоду. После элюции эритроциты не агглютинируются вирусами тех же серотипов, но агглютинируются сходными вирусами других серотипов, что позволило расположить миксо- и ЕСНО-вирусы в определенном порядке (рецепторный градиент). РГА может быть нейтрализована, если перед взаимодействием с эритроцитами к гемагглютинирующему вирусу добавить специфическую иммунную сыворотку (реакция торможения, задержка гемагглютинации — РТГА, РЗГА).

РГА и РТГА впервые были предложены для обнаружения вируса гриппа и титрования противогриппозных антител [Херст (G. К. Hirst)]. Вскоре появились сообщения о гемагглютинирующей активности вирусов осповакцины, эктромелии, ложной чумы кур, паротита, оспы, пневмонии мышей, кори, арбо-, адено- и парагриппозных, а также кишечных вирусов. Миксовирусы агглютинируют эритроциты многих видов животных и птиц, вирусы оспы и вакцины — эритроциты петухов, арбовирусы и вирус кори — эритроциты обезьян и гусей, большинство неполиомиелитных кишечных вирусов — эритроциты человека.

По способности агглютинировать эритроциты обезьян и крыс аденовирусы были разделены на три группы. Вирусный гемагглютинин (ГА) является специфическим антигеном. ГА у миксовирусов (v-антиген) и вирусов ECHO входит в состав вириона. У аденовирусов ГА обнаружен в свободном состоянии. У вируса осповакцины и арбовируса описаны как растворимый, так и связанный с вирионом ГА. Антигенные свойства ГА широко используют для серологической классификации вирусов. При помощи иммунной сыворотки в РТГА установлено 11 подтипов вируса гриппа типа А, патогенных для человека, животных и птиц, более 20 групп арбовирусов, патогенных для человека и животных. ГА разных вирусов обладают различной устойчивостью к прогреванию, действию формалина и других физических и химических факторов.

Выявление феномена гемагглютинации (см.) связано с подбором оптимальных условий культивирования вирусов и постановки реакции. Результаты РГА зависят от вида эритроцитов, рН среды, концентрации электролитов, температуры, времени инкубации смеси вируса с эритроцитами. Для оценки специфичности РТГА большое значение имеет устранение неспецифических ингибиторов гемагглютинации и неспецифических гемагглютининов, присутствующих в сыворотках человека и животных. Неспецифические ингибиторы удаляют, прогревая сыворотки при t° 56° в течение 30 мин. с последующей обработкой CO₂, KJO₄, каолином, или при помощи рецептор-деструирующего энзима, вырабатываемого холерным вибрионом. Неспецифические гемагглютинины удаляют путем абсорбции сывороток эритроцитов. Специфичность РТГА повышается при добавлении к смеси вируса с иммунной сывороткой кофактора (нативная нормальная сыворотка). ГА накапливается в аллантоисной жидкости при размножении вируса в курином эмбрионе или в жидкой фазе среды при выращивании в культуре ткани.

О размножении гемагглютинирующих вирусов в клетках однослойной культуры ткани можно судить по наличию реакции гемадсорбции (РГадс). Эта реакция основана на агглютинации эритроцитов вирусом, находящимся на поверхности клетки. РГадс становится положительной еще до появления ГА в жидкой фазе культуры и до развития цитопатических изменений в инфицированных клетках. Специфичность РГадс определяется ее торможением при помощи иммунных сывороток.

ВИРУСНЫЙ НЕКРОЗ ЭРИТРОЦИТОВ

ВИРУСНЫЙ НЕКРОЗ ЭРИТРОЦИТОВ (ВНЭ) — вирусная болезнь разных видов рыб, обитающих в северо-западной части Атлантики, а также в Ирландском и Северном морях и некоторых других регионах Мирового океана. Болезнь регистрируют и у чисто пресноводных рыб, таких, как радужная форель и американская палия. Болезнь характеризуется выраженной анемией, обусловленной дегенеративными процессами в эритроцитах.

Этиология. Вирусная этиология основана на обнаружении телец-включений и вирусных частиц в эритроцитах рыб. Вирионы возбудителя локализуются в эритроцитах. Они имеют форму икосаэдров и ориентировочно отнесены к группе иридовирусов. Размеры вирионов 140 — 360 нм. Выделить вирус в культурах клеток рыб, широко применяемых в ихтиовирусологии, не удается.

Эпизоотологические данные. Данная болезнь имеет весьма широкое распространение. Ею поражаются треска, атлантические сельди, бычки-подкаменники, американские угри, лососевые (кета, горбуша). Чавыча, кумжа, нерка, радужная форель и американская палия в естественных условиях не заболевают, но они могут быть носителями вируса и представлять потенциальную опасность для молоди на лососевых рыборазводных заводах. Энзоотии ВНЭ у рыб регистрируют во все сезоны года: болезнь проявляется при весьма широком диапазоне температур (6,5 — 19°С и выше).

Экстенсивность инфекции (ЭИ) у рыб в естественных водоемах и на рыборазводных заводах невелика (не превышает 15 — 17%). Отмечено, что среди заводской кеты и горбуши распространение инфекции тем больше, чем ближе к морю расположен сам завод. ЭИ при этом колеблется в пределах 0 — 17%. Интенсивность заражения (ИЗ) отдельных особей бывает очень велика, но в среднем она, как правило, низкая.

Восприимчивы к заражению вирусом все возрастные группы рыб. Так, наличие вируса отмечено не только у производителей, товарной рыбы н у подросшей молоди, но и у личинок с еще не рассосавшимся желточным метком, что не исключает герминативный путь заражения.

Болезнь, как правило, протекает хронически, смертность невысокая. Однако при осложнении бактериальной почечной болезнью или вибриозом гибель больных рыб значительно увеличивается.

Доказана возможность экспериментального воспроизведения ВНЭ путем внутрибрюшинного введения вируссодержащего материала, полученного or больной кеты, у молоди радужной форели, нерки, кижуча, чавычи, горбуши американской палии, атлантического лосося, кеты и кумжи. Кета и палия заражаются и через инфицированную воду.

Симптомы даже у сильно зараженных рыб не характерны. Отмечают лишь побледнение жабр.

Патологоанатомические изменения и патогенез. При вскрытии больных рыб отмечают бледность печени, сердца и пищеварительного тракта. У больных нарушается структура эритроцитов, понижаются свертываемость крови и уровень гематокрита до 2 — 4%.

Поселяясь и концентрируясь в эритроцитах, вирус ВНЭ разрушает их, в связи с чем происходит более активный гемопоэз в почках. Несмотря на это рыба становится менее устойчива к недостатку растворенного в воде кислорода и некоторым бактериальным и грибковым инфекциям, у нее понижается способность регулировать солевой обмен при содержании в морской воде. Рыба, пораженная вирусом ВНЭ, не обладает способностью противостоять действию неблагоприятных факторов среды.

Диагноз ставят на основании результатов микроскопического исследования мазков крови, при котором обнаруживают цитоплазматические включения в эритроцитах, а при электронно-микроскопическом исследовании здесь находят вирионы.

Лечение не разработано. В условиях рыборазводных заводов, видимо, возможно и целесообразно применять бактерицидные препараты для устранении сопутствующих бактериальных инфекций, которые осложняют течение ВНЭ

Профилактика и меры борьбы в естественных условиях еще не разработаны. Что же касается профилактики этой болезни среди молоди и возрастных рыб на рыборазводных заводах, то она основана на тщательном и своевременном проведении всего комплекса общих ветеринарно-санитарных, рыбоводно-биологических и зоогигиенических мероприятий, направленных на предотвращение заноса возбудителя болезни и на повышение естественной резистенности у рыб к возбудителю болезни и неблагоприятным факторам среды за счет создания в прудах и бассейнах для рыб комфортных условий.

Санитарная оценка. Возбудитель ВНЭ для человека и плотоядных животных не опасен. Рыбу из неблагополучных водоемов, если она не потеряла товарного вида и качества, допускают в пищу людям без ограничения. Больную рыбу, не имеющую товарного вида и не соответствующую товарному качеству, по усмотрению ветеринарного врача-ихтиопатолога направляют в корм сельскохозяйственным животным в проваренном виде или передают на специальные заводы для приготовления из нее рыбной муки.

ВЕСЕННЯЯ ВИРЕМИЯ КАРПОВ (ВВК) — вирусная болезнь некоторых видов прудовых рыб, характеризующаяся острым течением с проявлением отеков тела, ерошением чешуи, одно- или двусторонним пучеглазием, наличием точечных или очаговых кровоизлияний у основания грудных и брюшных плавников.

Этиология. Возбудитель — РНК-содержащий вирус пулевидной формы с размерами частиц 105 — 125x70 — 85 нм, относящийся к группе рабдовирусов. Вирус размножается в первично трипсинизированных культурах клеток гонад карпа и в перевиваемых линиях клеток рыб, широко используемых в ихтиопатологии. Репродукция вируса сопровождается четко выраженным цитопатогенным действием с полной деструкцией монослоя в течение 2 — 4 сут.

Размножается вирус в клеточной культуре при температуре от 19 — 22°С до 25°С, а при температуре 4°С репродукция его прекращается. Вирус не устойчив к эфиру и хлороформу, чувствителен к рН 3,0. Прогревание при 60°С приводит к полному инактивированию вируса в течение 30 мин. При 4°С он может сохраняться около года в среде при рН 7,4 — 7,6. В органах больных рыб, консервированных 50%-ным фосфатно-буферным раствором глицерина, вирус сохраняется не менее 6 мес.

Эпизоотологические данные. Весенняя виремия карпов впервые описана югославским исследователем Фияном Н. (1968), а в последующие годы зарегистрирована в Венгрии, Чехословакии, ФРГ и других европейских странах. В СССР эта болезнь появилась в середине 70-х годов под названием “весенняя вирусная болезнь рыб” (Рудиков, 1985). В дальнейшем ее, видимо, следует называть по первоначальному названию, а именно “весенняя виремия карпов”.

Болеют карпы, пестрый и белый толстолобик и белый амур. Клинически болезнь проявляется лишь у годовиков указанных видов рыб, культивируемых в прудовых рыбоводных хозяйствах.

Для ВВК характерна сезонность. Вспышки ее в естественных условиях отмечают лишь ранней весной при температуре в водоемах :10 — 14°С. Возникновение заболевания как раз совпадает с пересадкой годовиков прудовых рыб из зимовальных прудов в нагульные. Болезнь продолжается 1 — 1,5 мес, затем с повышением температуры воды в нагульных прудах до 18 — 20°С самопроизвольно прекращается.

Установлено, что проявление болезни у рыб связано со стрессовыми факторами. Влияние их отмечают как в течение зимовки рыбы в зимовальных прудах (пересадки, угнетенные условия, антипаразитарные обработки и др.), так и в первые дни после пересадки ее в нагульные пруды (травмирование при перевозке, наличие в воде пестицидов и других компонентов, входящих в поверхностные стоки, поступающие в пруды весной, дефицит растворенного в воде кислорода, повышенная окисляемость и др.). При таких неблагоприятных экологических и зоогигиенических условиях экстенсивность инфекции может достигать 20 — 40% и сопровождаться гибелью больных рыб. При устранении всех вышеуказанных стрессовых факторов болезнь не проявляется на протяжении многих лет даже в хозяйствах, ранее неблагополучных по ВВК. Следовательно, эта болезнь хотя и имеет специфического возбудителя — рабдовируса, проявляется она лишь при определенных экологических и зоогигиенических условиях.

Симптомы. Инкубационный период при естественной инфекции в условиях рыбоводных прудов в зависимости от температуры колеблется от 7 до 30 дней.

В начале болезни у карпов изменяется поведение: больные рыбы скапливаются на мелководных участках пруда, плавают по кругу или штопорообразно, отказываются от корма. С развитием патологического процесса у рыб проявляется диффузное или очаговое ерошение чешуи, вздутие брюшка, точечные кровоизлияния или пятнистые покраснения у оснований грудных и брюшных плавников, одно- или двустороннее пучеглазие. Иногда у карпов отмечают потемнение кожного покрова, сухость и шершавость кожи, анемию жабер. В отдельных случаях у больных устанавливают наличие серповидных кровоизлияний в глазное яблоко.

У растительноядных рыб признаки болезни почти такие же, как и у карпов, но выражены они слабее.

Патологоанатомические изменения и патогенез. При вскрытии у больных рыб отмечают распространенный отек тела, скопление в брюшной полости желтоватой, иногда с примесью крови жидкости, отек внутренних органов. Печень увеличена в объеме, неравномерно окрашена: бледная или пятнистая, иногда с точечными кровоизлияниями и беловатыми узелками. Почки набухшие, дряблые, редко с пятнистыми кровоизлияниями. Селезенка у большинства рыб увеличена U-образной формы, темно-вишневого цвета, у некоторых рыб под капсулой встречают сероватые бугорки или пятна. Кишечник обычно пустой, с явлениями катарального воспаления и редкими точечными кровоизлияниями на слизистой.

При гистологическом исследовании внутренних органов и кожи регистрируют тяжелые дегенеративно-некробиотические и воспалительные процессы. Особенно чувствительна к возбудителю болезни гемопоэтическая ткань. В целом заболевание имеет септический характер, однако обнаружить вирусные тельца-включения не удалось.

Отечественными и зарубежными учеными установлено, что вирус ВВК находится в крови, асцитной жидкости, мозге, жабрах, печени, селезенке, почках, мышцах, коже и слизи кишечника естественно больных карпов. Судя по всему, он проникает в кровь и разносится во все органы и ткани. Размножала в клетках, вирус вызывает их лизис и тяжелые морфологические изменения органов и тканей. Нарушение нормальных физиологических процессов и изменение порозности сосудов приводит к кровоизлияниям, гидропсическим явлениям, скоплению экссудата в брюшной полости, а также появлению периваскулярных клеточных инфильтратов (Грищенко, 1975).

Вирус, как показали исследования нашей лаборатории, влияет на гемопоэтическую ткань почек и селезенки, резко уменьшая количество клеточных элементов в ней, а также на клетки крови, в результате чего снижается количество эритроцитов и гемоглобина. Поражение центральной нервной системы (расширение сосудов, перицеллюлярные отеки и сморщивание нейронов) вызывает изменение поведения рыб, нарушение трофических процессов, приводящих к потемнению кожных покровов, истощению и другим патологическим процессам.

Вызываемые вирусом альтернативные изменения создают благоприятные условия для развития вторичной микрофлоры, а также возбудителей других бактериальных и грибных болезней.

Диагноз ставят на основании клинических, патологоанатомических и эпизоотологических данных, характеризующих вспышку заболевания, а также по результатам вирусологических исследований, при которых обязательно должен быть выделен вирус (патогенность последнего подтверждают биопробой). Чтобы определить ведущую роль патогенной микрофлоры при возможной смешанной инфекции, одновременно с вирусологическим проводят бактериологическое и микологическое исследования.

Лечение не разработано. В случае смешанного заболевания и установления ведущего возбудителя применяют соответствующие лечебные препараты.

Профилактика и меры борьбы основаны на тщательном и своевременном проведении всего комплекса общих ветеринарно-санитарных, рыбоводно-биотехнологических и зоогигиенических мероприятий, направленных на устранение действия стрессорных факторов, повышение общей резистентности рыб к возбудителям заразных болезней и неблагоприятным условиям среды, а также на создание в прудах оптимальных условий среды. При появлении болезни на рыбоводное хозяйство накладывают карантин и проводят в нем весь комплекс противоэпизоотических мероприятий, предусмотренных ветеринарным законодательством по ликвидации заразных болезней.

Санитарная оценка. Возбудитель ВВК для человека плотоядных животных опасности не представляет. Рыбу из неблагополучных водоемов, если она отвечает товарной кондиции, допускают в пищу людям без ограничений. Больную рыбу, потерявшую товарный вид, по усмотрению ветеринарного врача-ихтиопатолога направляют в корм сельскохозяйственным животным в проваренном виде.

ГЕМАГГЛЮТИНАЦИЯ (греч, haima кровь + лат. agglutinatio склеивание) — феномен склеивания эритроцитов. Гемагглютинация может быть прямой, т. е. происходить за счет непосредственного воздействия тех или иных агентов на эритроциты, и непрямой (пассивной), когда обработанные антигеном (или антителами) эритроциты агглютинируются соответственно иммунной сывороткой (или антигеном).

Прямую Гемагглютинацию могут вызывать антиэритроцитарные сыворотки, экстракты из тканей слюны, сыворотка человека и животных, а также некоторые бактерии (стафилококки, кишечная палочка, брюшнотифозные, паратифозные, дизентерийные микробы) и многие вирусы. Агглютинация эритроцитов нормальными сыворотками делится на изогемагглютинацию, если сыворотка и эритроциты принадлежат особям одного вида, и гетероагглютинацию, когда происходит склеивание чужеродных эритроцитов.

Способность к Г. сыворотка может приобретать при некоторых заболеваниях. Так, напр., сыворотка больных инфекционным мононуклеозом агглютинирует эритроциты барана (см. Пауля-Буннелля реакция).

Большое теоретическое и практическое значение имеет Г., вызываемая вирусами. Ее впервые описали в 1941 г. Херст (G. К. Hirst), Мак-Клилленд и Хейр (L. Mac Clelland, R. Hare). Они установили, что вирус гриппа агглютинирует эритроциты кур, на основании чего была разработана реакция гемагглютинации (РГА). Впоследствии гемагглютинирующие свойства были обнаружены у многих вирусов. С явлением Г. связана также гемадсорбция, т. е. способность клеток, инфицированных нек-рыми гемагглютинирующими вирусами, адсорбировать эритроциты на своей поверхности (см. Гемадсорбция). Способность вирусов вызывать Г. подавляется соответствующими противовирусными сыворотками, что используется в реакции торможения (погашения) гемагглютинации (РТГА).

РГА и РТГА широко используются как при теоретических исследованиях в области вирусологии, так и при диагностике вирусных инфекций для индикации, идентификации и классификации вирусов, а также для выявления противовирусных антител (антигемагглютининов) в сыворотке крови больных. Так, при выделении вирусов гриппа и паротита индикатором является агглютинация куриных эритроцитов аллантоисной и амниотической жидкостью зараженных куриных эмбрионов.

Для целей идентификации используется избирательная способность некоторых вирусов агглютинировать определенный вид эритроцитов. Вирус кори, напр., агглютинирует только эритроциты обезьян, а вирус энцефаломиокардита мышей — эритроциты барана.

У большинства вирусов гемагглютинин (субстрат, ответственный за Г.) является структурным компонентом вириона.

У вирусов, капсид которых одет наружной липопротеиновой оболочкой (вирусы гриппа, парагриппа, большинство арбовирусов), гемагглютинин находится в этой оболочке и структурно связан с так наз. ворсинками. По хим. природе Гемагглютинины этих вирусов являются глико- или липопротеидами. Так, гемагглютинин вируса гриппа представляет собой тетрамер, состоящий из двух пар гликопротеидов с общим мол. весом 150 000. Гемагглютинирующий гликопротеид оболочки арбовирусов группы В имеет мол. вес 50 000.

У вирусов, не имеющих внешней оболочки, гемагглютинин связан со структурами капсида. Так, у аденовирусов гемагглютинирующей активностью обладают фибриллы, выходящие из вершинных капсомеров.

Гемагглютинин оспенных вирусов является липопротеидом и представляет собой один из продуктов их репродукции, но, по-видимому, не включается в состав вириона, поскольку очищенные вирусные частицы Г. не вызывают.

Г. могут обусловливать как инфекционные вирусные частицы, так и инактивированные, поэтому Гемагглютинирующий титр вируса не отражает его инфекционной активности. В ряде случаев гемагглютинин может отделяться от вирусной частицы (напр., у аденовирусов). Некоторые вирусы (гриппа, кори, ECHO) могут в процессе своей репродукции формировать пустые, лишенные РНК вирионы, которые также обладают гемагглютинирующей активностью.

Механизм Г. изучался гл. обр. в опытах с вирусом гриппа. Его взаимодействие с эритроцитами проходит две фазы — адсорбцию и последующую элюцию (см.). Первый этап адсорбции вирусов на эритроцитах представляет собой физ. процесс и определяется разностью зарядов и межмолекулярным притяжением (силами Ван-дер-Ваальса). Вторым этапом является хим. взаимодействие вируса с рецепторами эритроцита.

Механизм самого процесса склеивания эритроцитов не совсем ясен. Может иметь значение изменение электростатического заряда эритроцитов после адсорбции на них вирусов.

Местом соединения вируса гриппа и некоторых парамиксовирусов с поверхностью эритроцитов являются рецепторы последнего, представляющие собой дисахарид 6-(N-ацетилнейраминил) альфа-D-N-ацетилгалактозамин. Под действием вирусного фермента нейраминидазы рецепторы эритроцитов расщепляются на N-ацетилгалактозамин и N-аце-тилнейраминовую к-ту.

При t° 37° через несколько часов происходит элюция вируса гриппа с эритроцитов. В гипертоническом р-ре хлорида натрия этот процесс протекает (быстрее. Вследствие разрушения рецепторов эритроциты теряют способность агглютинироваться повторно тем же вирусом, хотя могут склеиваться под действием ряда других вирусов.

Гликопротеидные рецепторы эритроцитов можно разрушить также перйодатом, трипсином и фильтратом холерных вибрионов, содержащим нейраминидазу.

Большинство других вирусов (оспенные, арбовирусы и др.) не разрушает рецепторов эритроцитов. Их элюция происходит не спонтанно, а при воздействии иммунной сыворотки, изменении электролитного состава среды, ее pH и др.

Г. зависит от свойств как вируса, так и эритроцитов (табл.).

ВИРУСЫ, СПОСОБНЫЕ ВЫЗЫВАТЬ АГГЛЮТИНАЦИЮ ЭРИТРОЦИТОВ НЕКОТОРЫХ ПОЗВОНОЧНЫХ

3, 7, 11, 14, 16, 20,

8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 22, 23, 24, 26, 27

Арбовирусы антигенных групп А, В, супергруппы Буньямвера

Ортомиксовирусы группа А, В, C

Человек, куры, морская свинка

Оспенные вирусы натуральной оспы, вакцины, оспы обезьян, эктромелии

Определенные особи кур

паротита, ньюкаслской болезни кур

Человек, куры, морская свинка

парагриппа НА-1, НА-2, НА-3

Человек, куры, морская свинка

Полиомавирусы полиомы мышей и вирус К

Рабдовирусы бешенства, везикулярного стоматита

Энтеровирусы ECHO 3, 6, 7, 11, 12, 15, 19, 20, 21, 24, 25, 29, 30, 33

Определенные особи кур

энцефаломиелита мышей GD VII

Гемагглютинирующая активность различна как у членов одной классификационной группы, так и у разных штаммов одного вируса и даже у отдельных клонов одного штамма. Напр., штаммовые различия выражены у энтеровирусов некоторых серотипов. В популяции вируса Коксаки А-21 были обнаружены как гемагглютинирующие частицы, так и лишенные этого свойства.

Для получения видимой Г. вирусная суспензия должна содержать не менее 105—106 вирусных частиц в 1 мл.

Гемагглютинирующую активность некоторых вирусов (напр., кори, паротита, краснухи) можно повысить путем обработки вирусной взвеси твином-80 и эфиром, вероятно, вследствие дезинтеграции наружной оболочки вируса.

Г. зависит также от среды культивирования вируса и от наличия ингибиторов, блокирующих этот процесс.

Напр., при культивировании вируса Коксаки А-21 в перевиваемых клетках злокачественного происхождения продуцируются только негемагглютинирующие частицы. Источником получения гемагглютинирующих антигенов арбовирусов является гл. обр. мозг зараженных мышей-сосунков, содержащих много ингибиторов Г. Поэтому для приготовления этих антигенов применяют экстракцию мозговой ткани боратно-солевым р-ром с pH 9,0, очистку фреоном, преципитацию ацетоном.

Разблокировки гемагглютинина с большой эффективностью можно добиться также путем дополнительной обработки взвеси твином-80 и эфиром, ультразвуком и трипсином в малой концентрации.

У некоторых вирусов способность вызывать Г. зависит от числа пассажей в том или ином субстрате. Здесь играет роль адаптация вируса к условиям культивирования и повышения активности его репродукции до уровня, когда концентрация вирусных частиц становится достаточной для появления Г. Иногда наблюдается обратная зависимость: с числом пассажей Гемагглютинирующая активность вируса уменьшается вплоть до полного исчезновения. Возможно, в основе этих явлений лежит селекция (во время пассажей) гемагглютинирующих или негемагглютинирующих частиц.

Из числа факторов, характеризующих эритроциты, особое значение имеет их видовая принадлежность.

Способность эритроцитов агглютинироваться тем или иным вирусом устанавливается эмпирически. Обычно вирусы, относящиеся к одной классификационной группе, агглютинируют одни и те же виды эритроцитов. Вместе с тем имеют значение и индивидуальные свойства донора.

Влияет на Г. также возраст и пол донора. Напр., вирус осповакцины более активно агглютинирует эритроциты взрослых кур, чем цыплят.

Для работы с арбовирусами предпочтительны эритроциты молодых птиц. Кроме того, рекомендуется использовать эритроциты гусаков, а не гусынь, поскольку гормональные сдвиги в период яйцекладки и высиживания яиц меняют свойства поверхности эритроцитов, в результате чего у них может появиться рефрактерность к действию вируса или склонность к спонтанной агглютинации.

Эритроциты некоторых видов животных (кроликов, крыс, мышей) нередко дают спонтанную агглютинацию, что необходимо учитывать при разработке стандартных условий Г. с каждым вирусом. Эритроциты птиц предпочтительнее эритроцитов млекопитающих, поскольку они быстро оседают, дают четкую картину и мало подвержены спонтанной агглютинации. При постановке РГА с нек-рыми вирусами, напр, вирусом гриппа, могут быть использованы как свежие эритроциты, так и консервированные с помощью 25% формалина.

Г. зависит от электролитного состава среды, концентрации водородных ионов и температуры. В среде без электролитов агглютинации эритроцитов вирусами не происходит.

Существует определенный оптимум электролитного состава среды; напр., адсорбция гемагглютининов вируса осповакцины на куриных эритроцитах является максимальной при 0,45—1,8% хлорида натрия.

Постановка РГА осуществляется при t° 4; 20—25 или 37°. Вирус гриппа, напр., лучше всего агглютинирует эритроциты при t° 4°, вирус осповакцины — при t° 37°, а для Г. арбовирусами температура не имеет значения.

Требования разных вирусов к концентрации водородных ионов также неодинаковы. Большинство из них вызывает Г. при pH 6,0—8,5. Поэтому в качестве среды чаще всего используют изотонический р-р хлорида натрия, к к-рому иногда прибавляют 0,014 М фосфатный буфер с pH 7,2 (при Г. с вирусами гриппа, кори, осповакцины и др.).

Арбовирусы, способность которых к Г. очень слабая, требуют строго определенной концентрации во дородны х ионов: отклонение от pH, оптимального для каждого вируса, допускается не более, чем на 0,3— 0,4 ед.

Поскольку Гемагглютинины этих вирусов стабильны лишь в щелочной среде (при pH 9,0), а оптимальной для постановки РГА является зона с pH 5,6—7,0, необходимую концентрацию водородных ионов создают в момент соединения антигена с эритроцитами, добавляя к щелочной взвеси вируса находящиеся в кислом буферном р-ре эритроциты.

Состав буферных р-ров может влиять на видовой спектр чувствительности эритроцитов. Если, напр., в среде обычного состава вирус краснухи агглютинирует эритроциты цыплят, голубей и гусей, то при использовании 0,025 М HEPES-бу-фера (N-2-hydroxyethylpiperazine — N12-ethanesulfouic acid) pH 6,2 с прибавлением 0,4 М NaCl, 0,001 М CaCl2, 1% альбумина сыворотки крупного рогатого скота и 0,00025% желатины он агглютинирует также эритроциты взрослых кур, человека (кровь 0 группы), обезьян, овец, свиней, кошек, кроликов, крыс, хомячков и мышей.

Для подтверждения специфичности вирусной Г., а также для выявления в сыворотках вирусных антигемагглютининов при серол, исследованиях служит РТГА. Специфичность ее не одинакова для разных групп вирусов. Для арбовирусов рода альфа- и флавивирусов РТГА, является группоспецифической, т. е. выявляет антигенные связи между членами данной группы. Это затрудняет оценку результатов серол, исследований при существовании в какой-либо местности нескольких вирусов одной группы. У адено- и реовирусов с помощью РТГА выявляются типоспецифические особенности, а у вирусов гриппа улавливаются даже тонкие различия между штаммами одного вида.

Для РТГА желательно использовать высокоактивные антигены. Антигены с низкой активностью нередко содержат много негемагглютинирующих вирусных частиц, которые могут соединяться с антителами и препятствовать их выявлению. При использовании в качестве источника гемагглютинина инфицированных клеточных культур из состава среды исключают сыворотку или предварительно удаляют из нее ингибиторы Г.

Блокирующие Г. сывороточные ингибиторы по хим. составу являются в основном бета-липопротеидами, а по размеру молекул близки к 198-антителам . Сыворотки, исследуемые в РТГА, освобождают от ингибиторов путем нагревания при t° 56 или 62° в течение 30 мин., обработки фильтратом холерных вибрионов или нейраминидазой, трипсином, адсорбции ингибиторов каолином, преципитации антител ацетоном, обработки хлоридом магния и гепарином, обработки сульфатным декстраном и хлоридом кальция, обработки риванолом. Эффективность отдельных методов в отношении удаления различных ингибиторов неодинакова. Первые три метода достаточны для удаления ингибиторов Г., вызываемой вирусами гриппа и парагриппа. Обработку сывороток каолином и ацетоном используют при работе с арбовирусами, риванолом, при изучении энтеровирусных инфекций. При выявлении антител к вирусу краснухи применяют обработку каолином, хлоридом магния и гепарином или сульфатом декстрана и хлоридом кальция.

Исследуемые в РТГА сыворотки освобождают также от агглютининов того вида эритроцитов, который используется при постановке-реакции. Это осуществляется путем адсорбции агглютининов концентрированной взвесью этих эритроцитов.

Техника постановки РГА и РТГА

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА или РПГА) имеет две основные разновидности: а) агглютинация эритроцитов, сенсибилизированных антигеном, иммунной сывороткой; б) агглютинация сенсибилизированных антителами эритроцитов в присутствии антигена. Различают две фазы реакции. Во время первой происходит изменение поверхностных свойств эритроцитов в результате адсорбции на них антигенов (или антител). Во второй фазе на сенсибилизированных эритроцитах адсорбируются антитела (или антигены) и происходит образование конгломератов.

Для диагностических целей с бактериальными антигенами РНГА была использована А. Т. Кравченко и М. И. Соколовым в 1946 г. В щелочной среде из бактериальных клеток извлекали полисахаридный антиген, адсорбировали на эритроцитах человека группы 0 и тотчас соединяли с диагностической сывороткой. Метод не требует выделения чистых культур бактерий, т. к. адсорбцию антигена можно проводить непосредственно из патол, материала. С помощью этой методики удавалось обнаружить такое количество антигена в 1 мл солевого р-ра, к-рое соответствует 50—100 млн. микробных тел, определяемых по оптическому стандарту.

РНГА по Кравченко и Соколову и ее модификации нашли применение в бактериологии, но возможности ее были ограничены тем, что на нативных эритроцитах можно адсорбировать лишь полисахаридные антигены, а не белки. Но в 1951 г. Бойден (S. V. Boyden) показал, что эритроциты, протравленные таниновой к-той, приобретают способность адсорбировать на своей поверхности и белки (см. Бойдена реакция).

В 1956 г. Рыцай (Т. Rycaj) модифицировал методику Бойдена: эритроциты сенсибилизируют антителами и используют для обнаружения различных антигенов. Для адсорбции на эритроцитах используют иммуноглобулин иммунных сывороток. РНГА по Рыцаю можно применять не только для индикации антигенов, но и для титрования сывороток, используя феномен гашения, или торможения, РНГА. В этом случае исследуемую сыворотку в соответствующих разведениях соединяют с антигеном, против к-рого предполагают обнаружить антитела, а потом добавляют сенсибилизированные эритроциты. При наличии антител антиген связывается ими и агглютинации не происходит. При исследовании сывороток как по оригинальной методике Бойдена, так и по Рыцаю из сыворотки предварительно следует удалить ингибиторы и гетерогемагглютинины.

Механизм РНГА изучен недостаточно; в связи с этим при подборе условий сенсибилизации эритроцитов разными антигенами и антителами, а также при выборе вида эритроцитов используется в основном эмпирический подход.

Адсорбционная активность нативных эритроцитов невелика, но ее удается повысить, обрабатывая эритроциты танином, акролеином, глутаровым альдегидом, бидиазотированными соединениями (агрегат-гемагглютинация).

Для создания стабильных препаратов ведутся разработки методов хим. присоединения антигена или антител к эритроцитам, в частности путем создания диазосвязей. С этой целью используют, напр., диазотированный бензидин, толулен-2,4-диизоцианат, растворимый в воде карбодимид, дифтородинитробензен. Описано использование борфторида 4,4-бис-дифенилдиазония для присоединения поликонденсированных антител к эритроцитам барана для индикации возбудителей клещевых риккетсиозов.

РНГА широко применяется в бактериологии. При чуме, холере, бруцеллезе и туляремии используют обе разновидности реакции, при скарлатине, дифтерии и дизентерии— только антигенный вариант, для обнаружения ботулинического токсина служат эритроциты, сенсибилизированные антителами.

В вирусол. исследованиях РНГА впервые была проведена с вирусами паротита и ньюкаслской болезни в 1946—1948 гг., затем после почти десятилетнего перерыва последовали сообщения о воспроизведении этой реакции с аденовирусами, вирусом герпеса, миксовирусами, вирусом осповакцины, арбовирусами, цитомегаловирусами, вирусом ящура, лейкозов кур и др. Оптимальные условия реакции для разных вирусов подбирают индивидуально.

Для выявления вируса клещевого энцефалита описана реакция в модификации Рыцая. Эритроциты, сенсибилизированные иммуноглобулином из сыворотки лошади, иммунной к клещевому энцефалиту, используют для индикации вирусов клещевого и шотландского энцефалита в культуре ВНК-21. Для этого вируссодержащую жидкость разводят в 1 % р-ре нормальной лошадиной сыворотки с коэффициентом 2. К 0,5 мл антигена каждого разведения добавляют 1—2 капли сенсибилизированных эритроцитов. Реакцию учитывают через 1—2 часа. Может быть применена РНГА для выявления вируса осповакцины и натуральной оспы как в лабораторных культурах, так и в патол, материале от больных (детрите и корках).

Библиография: Гайдамович С. Я. и Казале Дж. Сравнительное изучение гемагглютинирующих арбовирусных антигенов, приготовленных из тканевых культур и из мозга мышей, Вопр, вирусол., № 2, с. 238, 1968; Леви М. И. и Басова H. Н. Эритроцитарные диагностикумы и их применение в серологии, Пробл. особо-опасных инфекц., в. 2, с. 207, Саратов, 1970; Носков Ф. С. и др. Применение реакции непрямой гемагглютинации для лабораторной диагностики натуральной оспы, Вопр, вирусол., № 3, с. 347, 1972;

Рыцай Т. Обнаружение ботулинического токсина типа А в пищевых продуктах методом специфической гемагглютинации, Бюлл. Польск., акад. наук, т. 4, JsTs 9, с. 341, 1956.