Выделение вирусов на лабораторных животных

Основные методы культивирования вирусов:

1) биологический – заражение лабораторных животных. При заражении вирусом животное заболевает. Если болезнь не развивается, то патологические изменения можно обнаружить при вскрытии. У животных наблюдаются иммунологические сдвиги. Однако далеко не все вирусы можно культивировать в организме животных;

Выбор экспериментальных животных определяется целью работы и видовой чувствительностью к изучаемому вирусу. Для заражения используют обезьян, кроликов, морских свинок, хомячков, белых крыс и мышей.

Лабораторных животных заражают различными способами в зависимости от тропизма вируса к определенным тканям. Так, например, для культивирования нейротропных вирусов заражение производят преимущественно в мозг (вирусы бешенства, клещевого энцефалита и др.), культивирование респираторных вирусов осуществляется при интраназальном инфицировании животных (вирусы гриппа), дерматотропных (вирус оспы) – путем накожного и внутрикожного заражения. Наиболее часто используются накожное, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное и внутримозговое заражение.

Индикацию, т.е. обнаружение факта размножения вируса, устанавливают на основании развития типичных признаков заболевания, патоморфологических изменений органов и тканей животных или положительной реакции гемагглютинации (РГА). РГА основана на способности некоторых вирусов вызывать агглютинацию (склеивание) эритроцитов различных видов животных, птиц и человека за счет поверхностного вирусного белка – гемагглютинина.

В настоящее время использование животных для культивирования вирусов ограничено.

2) культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах. Большинство известных вирусов обладают способностью размножаться в курином эмбрионе (рис.56). Используют эмбрионы в возрасте от 8 до 14 дней в зависимости от вида вируса, способа заражения и задач исследования. Вирусы гриппа культивируются в 9–10-, осповакцины – в 12-, паротита – в 7-дневных куриных эмбрионах. Размножение вируса в куриных эмбрионах происходит в разных частях зародыша, что связано с особенностями тропизма вируса. Методику выращивания вируса в курином эмбрионе широко используют при промышленном культивировании.

Существует несколько способов заражения развивающегося куриного эмбриона: на хорионаллантоисную оболочку, в аллантоисную и амниотическую полости, желточный мешок, тело эмбриона.

Заражение на хорионаллантоисную оболочку применяется для выделения и культивирования вирусов, образующих на оболочках бляшки (вирусы вакцины, натуральной оспы, простого герпеса). Перед заражением яйца просвечивают с помощью овоскопа, карандашом очерчивают границу воздушного пространства и хорионаллантоисной оболочки. Поверхность яйца над воздушным пространством и в месте заражения протирают спиртом, прожигают, обрабатывают йодом и делают отверстие в полости воздушного мешка. На месте заражения скорлупу удаляют так, чтобы не повредить подскорлупную оболочку, которую затем прокалывают короткой стерильной иглой, чтобы не повредить хорионаллантоисную оболочку. Воздух из полости воздушного мешка отсасывают. Вирусный материал (0,05–0,2 мл) наносят на хорионаллантоисную оболочку туберкулиновым шприцем с короткой иглой или пастеровской пипеткой. Отверстие в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом или тем же выпиленным кусочком скорлупы и по краям заливают расплавленным парафином. Зараженные эмбрионы располагают на подставке горизонтально и инкубируют в термостате. Вскрытие эмбрионов производится не раньше 48 ч инкубации. На зараженной оболочке обнаруживаются беловатые непрозрачные пятна разной формы (бляшки).

Заражение в аллантоисную полость. Вирус, введенный в аллантоис, размножается в эндодермальных клетках, переходя затем в аллантоисную жидкость. Заражение осуществляют следующим способом: в скорлупе над воздушной камерой острием скальпеля или ножниц производят прокол, после чего через отверстие в вертикальном направлении вводят иглу со шприцем, которая проходит через хорионаллантоисную оболочку и попадает в аллантоисную полость, материал вводится в объеме 0,1 мл и отверстие заливают парафином.

Заражение в желточный мешок. С этой целью используют эмбрионы 5–10-дневного возраста. Наиболее употребительны два метода заражения. По первому материал вводится через воздушное пространство. В центре яйца делают отверстие, помещают его на подставку тупым концом вправо и через отверстие в вертикальном направлении вводят иглу, надетую на шприц, игла проходит через хорионаллантоисную оболочку, аллантоисную полость в желток. В желточный мешок можно ввести от 0,1 до 0,5 мл вируссодержащего материала. После заражения отверстие в скорлупе заливают парафином, и эмбрион помещают в термостат. По второму методу на границе воздушного пространства с той стороны, где лежит желток (стороны, противоположной от эмбриона), делают прокол скорлупы, через который вводят инфекционный материал. Направление иглы должно быть к центру яйца.

Индикацию вирусов в курином эмбрионе осуществляют на основании специфических поражений оболочек и тела эмбриона (оспины, кровоизлияния), а также в РГА.

В результате заражения могут происходить и появляться:

1) гибель эмбриона;

2) дефекты развития: на поверхности оболочек появляются образования – бляшки, представляющие собой скопления погибших клеток, содержащих вирионы;

3) накопление вирусов в аллантоисной жидкости (обнаруживают путем титрования);

4) размножение в культуре ткани (это основной метод культивирования вирусов).

В последующие за заражением дни ведут ежедневные наблюдения за животными, контролируя их клиническое состояние. В случае размножения вируса в чувствительных к нему клетках организма последние повреждаются или гибнут. При значительном количестве поврежденных вирусом клеток нарушается функционирование части или всего органа. Это проявляется соответствующими изменениями в состоянии и поведении животного. Так, при размножении вируса в клетках респираторного тракта наблюдаются кашель, хрипы, одышка, при размножении вируса в клетках мозга – судороги, парезы, параличи и т. д.

Видимые изменения в состоянии и функционировании организма называют клиническими признаками болезни, а появление их после экспериментального заражения считают косвенным доказательством размножения вируса. При этом учитывают не только сам факт и характер появившихся изменений, но и продолжительность инкубационного периода, которая характерна для определенной болезни. Инкубационный период зависит не только от свойств возбудителя, но и от дозы вируса, пути его проникновения в организм и состояния самого организма.

Клинические признаки, появившиеся у лабораторных животных, зараженных с целью биопробы (обнаружения вируса), указывают на то, что в исследуемом патматериале содержался вирус. Эти признаки большей частью носят неспецифический характер (например, угнетение, снижение аппетита, одышка и т. п.), и на этом этапе исследований еще нет возможности прийти к заключению, какой именно вид вируса вызвал заболевание. Для этого необходимо идентифицировать обнаруженный вирус с помощью серологических реакций. При этом неизвестным антигеном является выделенный вирус, содержащийся в материале, полученном при вскрытии использованного для биопробы животного. Нередко заболевание заканчивается гибелью, что также бывает через определенное время после заражения и служит одним из признаков размножения вируса в организме. На размножение вируса в организме указывают не только клинические признаки и гибель животного, но и видимые изменения самих органов и тканей, которые, как говорилось выше, возникают в связи с гибелью зараженных вирусом клеток. Патологоанатомические признаки выражаются изменением цвета, размера, формы и консистенции органов, а также в появлении образований, в норме не встречающихся.

Зараженное, но не проявившее признаков болезни животное убивают через интервал времени, равный двум инкубационным периодам, и берут при вскрытии патологический материал, предположительно содержащий размножившийся и накопившийся вирус.

По тому же принципу делают третий пассаж и в случае появления признаков заболевания приходят к заключению о присутствии вируса в исследуемом материале. Полученный от реагировавшего животного вируссодержащий материал считают выделенным вирусом.

При биопробе с целью обнаружения вируса на других лабораторных живых системах поступают по тому же принципу.

Вирусы же, для обнаружения и выделения которых используют естественно восприимчивых животных, не нуждаются в предварительной адаптации и проявляют себя в биопробе определенными признаками уже на первом пассаже.

Поперечные профили набережных и береговой полосы: На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим.

Общие условия выбора системы дренажа: Система дренажа выбирается в зависимости от характера защищаемого.

Механическое удерживание земляных масс: Механическое удерживание земляных масс на склоне обеспечивают контрфорсными сооружениями различных конструкций.

Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰).

Цатурова К.А. Физическая культура в России.

Выделение и накопление вирусов на биологических моделях

Выделение вирусов на лабораторных животных.

Чаще всего в вирусологии в качестве биомоделей используют белых мышей, белых крыс, морских свинок, кроликов, цыплят. Иногда используют также золотистых хомячков, утят и других животных. Условия использования лабораторных животных в качестве биомодели: Животные должны быть здоровы, получены из благополучного в отношении заразных болезней питомника, чувствительны к конкретному вирусу, стандартны (то есть одинаковы по полу, физиологическому состоянию, весу). Выбор лабораторных животных зависит от вида вируса.

Цель заражения лабораторных животных:

1. Изучение патогенеза болезни;

2. Выделение вируса из пат.материала;

3. Наработка иммунных и гипериммунных сывороток;

4. Наработка вакцин;

5. Поддержание вирусов в условиях лаборатории;

6. Титрация, с целью определения количества вируса в единице объема;

7. Лаб. Животные - биологическая модель для постановки реакции нейтрализации;

Различают много способов введения вируссодержащего материала в организм животных:

Выбор метода заражения лабораторных животных зависит от тропизма вируса. Так, при культивировании нейротропных вирусов животных заражают интрацеребрально (в головной мозг); респираторных - интраназально, интратрахеально; дерматропных – подкожно и внутрикожно.Заражение производят с соблюдением правил асептики и антисептики.

После заражения животных метят, помещают в изолированный бокс и ведут наблюдение в течение 10 суток. Гибель животного в первые сутки после заражения считается неспецифичной и в дальнейшем не учитывается. 3 признака указывают на результативность заражения: наличие клинических признаковгибель животного; патологоанатомические изменения в их органах и тканях.

Куриный эмбрион - это оплодотворенное куриное яйцо, в котором развивается зародыш (эмбрион). Культивирование вирусов на куриных и перепелиных эмбрионах в последнее время получило широкое распространение как один из наиболее простых и надежных методов культивирования и диагностики многих вирусов и некоторых бактерий - бруцеллы, риккетсии, вибрионы.

Многие вирусы человека и животных способны культивироваться в развивающихся куриных эмбрионах. Эмбриональная ткань, особенно оболочки эмбриона, богатые тканями зародышевого эпителия, является благоприятной средой для размножения многих вирусов. Вирусы, имеющие эпителиотропные свойства (оспа, ИЛТ и др.), успешно развиваются на хорионаллантоисной мембране, вызывая макроскопически видимые изменения. Различные представители миксовирусов (грипп, болезнь Ньюкасла, чума плотоядных и др.), вирусы инфекционного бронхита, гепатита утят, арбовирусы и др. хорошо размножаются в эмбрионе при введении материала в аллантоисную полость. Некоторые вирусы успешно культивируются в желточном мешке.

Преимущества использования куриных эмбрионов:

1.Экономически выгодно, кроме того яйца легко доступны;

2.У развивающихся куриных эмбрионов отсутствуют защитные механизмы, т.к. система иммунитета еще не развита;

3.Скорлупа яиц препятствует проникновению через неё бактерий и вирусов из окружающей среды;

4.Для культивирования и выделения вирусов на куриных эмбрионах требуется очень несложное оборудование - обычный термостат или инкубатор.

Условия использования КЭ в вирусологии:

1.Яйца получают из хозяйств заведомо благополучных по инфекционным заболеваниям;

2.Куриные эмбрионы лучше получать от белых пород кур (леггорн, русская белая), т. к. они более устойчивы к манипуляциям и не гибнут от маленьких травм. Кроме того, у них скорлупа белая и более прозрачная, чем у других пород, и легче просвечивается, что удобно для просмотра и наблюдения в процессе работы с ними;

3. Для инкубирования отбирают оплодотворенные яйца снесенные не более 10 суток тому назад;

4. Берут незагрязненные яйца, т. к. мыть их перед инкубированием нельзя, а грязные яйца хуже просвечиваются при просмотре (овоскопии) и при работе с ними можно инфицировать эмбрион в процессе манипулирования;

Инкубируют яйца в инкубаторе или в термостате с водяным нагревом и доступом воздуха, причем в процессе инкубации в термостате яйца 2-3 раза в сутки нужно переворачивать и для лучшего газообмена вынимать на 5-10 минут на воздух. Для поддержания определенной влажности в термостат ставят сосуд с водой для испарения, температура в термостате должна быть 38°.

Развитие зародыша происходит уже в первые сутки инкубирования, происходит закладка головного мозга, скелета. Строение куриного эмбриона в возрасте 7-9 дней ( см. тетрадь).

Для заражения наиболее часто используют эмбрионы 7-12 суточного возраста. Работу с куриными эмбрионами проводят в стерильной комнате-боксе со строжайшим соблюдением асептики .

1. Выделить вырус из патматериала;

2. Наработка вакцин;

3. Поддержание вируса в условиях лаборатории;

4. Титрация вирусов;

5. Биологическая модель для постановки реакции нейтрализации;

6. Изучение интерференции вирусов и наработка интерферона;

Заражение куриных эмбрионов:

Для заражения нужно отбирать жизнеспособные эмбрионы с хорошо выраженной подвижностью. Перед заражением все эмбрионы тщательно просматривают в затемненной комнате на овоскопе

Во время просвечивания эмбрионов перед заражением на скорлупе простым карандашом обрисовывают пугу (воздушную полость), ход крупных кровеносных сосудов и место предлежания эмбриона, т. е. участок на скорлупе, где ближе всего к ней лежит эмбрион. Отметка пуги, места предлежания эмбрирна и хода крупных кровеносных сосудов затем служат ориентиром при выборе места введения вируссодержащего материала в момент заражения.

Отобранные для заражения куриные эмбрионы переносят в бокс, где и проводят с ними работу. Перед заражением скорлупу по месту введения материала дважды обрабатывают йодированным спиртом и обжигают. Доза заражения составляет 0,1-0,2 см з .

В зависимости от вида вируса и цели заражения имеются различные методы введения вируссодержащего материала:

1) Заражение на хорионаллантоисную обалрчку, используют эмбрионы 7—12-суточного возраста при выделении и культивировании нейротропных, дерматропных н некоторых пантропных вирусов (оспа, энцефаломиелит, ИЛТ, ящур, бешенство, чума и др.). Существует 3 варианта заражения:

а)вскрывают пугу и срезают ее ножницами, отделяют
подскорлупную оболочку и наносят на хорионаллантоисную
оболочку (ХАО) материал. Отверстие в яйце затем закрывают
стерильным стеклянным колпачком и края колпачка
парафинируют;

б) выпиливают надфилем (напильничек) или зазубренным скаль­-
пелем в скорлупе треугольник с длиной сторон около 1 см на
границе пуги со стороны предлежания эмбриона, пинцетом
удаляют участок скорлупы и подскордупной оболочки и вводят
материал. Отверстие закрывают покровным стерильным
стеклом и края парафинируют, или заклеивают стерильным
лейкопластырем.

в)скальпелем удаляют небольшой участок скорлупы площадью
около 0,5 см по месту предлежания эмбриона, затем пинцетом
или иглой удаляют в этом участке подскорлупную оболочку и
вводят материал. Если материал плохо входит в полость яйца, можно с помощью резиновой груши через отверстие в скорлупе на пуге откачать воздух из пуги и в результате по месту введения материала образуется искусственная пуга и тогда материал легко вводится. Отверстие в скорлупе закрывают лейкопластырем или парафинируют.

2) Заражение в аллантоисную полость. Этот метод заражения
очень прост и применяется для выделения многих вирусов. Для
заражения берут 10-11-дневные эмбрионы. Имеется два варианта
заражения:

б) вводят материал иглой через прокол в скорлупе в месте
предлежания эмбриона на глубину 3-5 мм в бессосудистом
участке. Отверстие в скорлупе закрывают лейкопластырем или парафинируют.
3) Заражение в желточный мешок.

Для заражения используют 5-8-суточные эмбрионы.

Существует два варианта заражения:

а) иглу вводят со стороны пуги в желточный мешок под углом 45 о

к месту предлежания эмбриона под контролем овоскопа;

б) яйцо кладут на подставку также местом предлежания
эмбриона вниз и иглу вводят сверху вниз по направлению к
эмбриону на глубину около 1 см.

Место введения заклеивают лейкопластырем и парафинируют.

При этом методе заражения вирус может проникнуть

в различные клетки,находящиеся в контакте с амниотической

жидкостью, и размножаться в них. для удобства заражения

рекомендуется за 2-3 дня до проведения заражения эмбрионы

инкубировать пугой вверх. Тогда эмбрион и амнион смещаются вверх

и удобнее заражать. Имеется два варианта заражения:

а) вскрывают и срезают пугу, пинцетом удаляют подскорлупную
оболочку и захватывают амниона подтягивают амнион
пинцетом и вводят в амниотическую полость материал в дозе
0,1 мл. Отверстие в скорлупе затем закрывают стерильным
стеклянным колпачком и края парафинируют;

б) заражение с помощью длинной иглы через пугу в темной
комнате под контролем глаза, У иглы предварительно острие
загибают под прямым углом, чтобы получилась маленькая
площадка. Иглу вводят под контролем глаза через пугу до эмбриона,

под давлением затупленной иглы эмбрион в этом случае будет

смещаться, затем легким толчком прокалывают амнион и иглу

слегка оттягивают назад. При этом эмбрион должен смещаться за иглой вверх.

Затем вводят материал.

5) Заражение в тело эмбриона и заражение в головной мозг.
Используются 7-12-дневные эмбрионы, заражение проводят
введением материала в различные участки тела или непосредственно
в головной мозг. Для заражения вскрывают пугу и подтягивают
пинцетом эмбрион. При этих методах заражения может быть гибель
эмбрионов от травмы до 30 % и более от числа зараженных.

6) Заражение в крупные кровеносные сосуды
хорионаллантоисной оболочки. Этот метод заражения, как и
предыдущий, применяется очень редко. Материал вводят тонкой
иглой после удаления скорлупы по ходу кровеносного сосуда
непосредственно в сосуд по току крови.

После заражения куриные эмбрионы обязательно метят простым карандашом и ставят в термостат. За ними ежедневно наблюдают путем просмотра, наблюдение ведут до 7-8 дней в зависимости от вида вируса. В случае гибели эмбрионов их срочно удаляют из термостата и ставят в холодильник до момента вскрытия. Если эмбрион погиб в течение первых 14-18 часов, это может быть от травмы или токсичности патматериала. Поэтому, так же как и при заражении лабораторных животных, в сомнительных случаях рекомендуется, делать несколько пассажей и в опыт брать на каждый материал по несколько эмбрионов.

Куриные эмбрионы в вирусологии широко применяются не только для выделения вирусов, но и для накопления и получения антигенов, для приготовления живых и убитых вакцин, титрования вирусов, для постановки реакции нейтрализации вирусов, для аттенуирования (ослабления) вирусов, для изучения интерференции вирусов и получения интерферона.

Методы заражения куриных эмбрионов:

На ХАО В желточный мешок

Читайте также: C) Гидролиз АТФ не связан с выделением энергии I.) История возникновения и развития компьютерных вирусов. I.) История возникновения и развития компьютерных вирусов. III.) Признаки проявления вирусов. VI. ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС (ВЫДЕЛЕНИЕ СИНДРОМОВ ПО МАТЕРИАЛАМ ОБСЛЕДОВАНИЯ БОЛЬНОГО). Видовая классификация компьютерных вирусов Виды вирусов Виды компьютерных вирусов, и способы борьбы с ними Вирусов бояться – в Интернет не ходить Вирусы. Морфология и физиология вирусов

1. В аллантоисную полость В амнион.

2. В аллантоисную полость В желточный мешок

Дата добавления: 2014-12-15 ; просмотров: 47 | Нарушение авторских прав

Burnet (1940) обнаружил, что вирус 'гриппа может размножаться в «летках, выстилающих аллантоисную и амнио-тическую полости куриного эмбриона, что оказалось важным для изучения вирусов гриппа. Появилась возможность избежать неудобств, связанных с работой на лабораторных животных, а также возможность в больших количествах получить вирус гриппа в виде аллантоисной жидкости зараженных эмбрионов. Кроме того, стало 'возможным выделять вирус гриппа непосредственно «а эмбрионах, без предварительной адаптации его к хорькам или мышам, которая могла привести к случайному загрязнению вируса посторонними агентами. Открытие гемагглютинирующих свойств вирусных частиц (Hirst, 1941) также имело большое значение, поскольку обеспечило возможность обнаруживать вирус без необходимости демонстрировать его инфекционные свойства. Следующим шагом, 'Имевшим очевидное значение для изучения репликации вируса гриппа, было культивирование вируса в культурах клеток (Mogabgab et al., 1954). Разработка систем бляшек в однослойных клеточных культурах для определения инфекционное™ вируса в конечном счете обеспечила возможность получения чистых клонов вируса гриппа для экспериментов по генетике.

II. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ В ЛАБОРАТОРНЫХ УСЛОВИЯХ

А. КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК

Введение вирусов гриппа А или В в (Культуру клеток вызывает один из трех эффектов: 1) вирус размножается с различной эффективностью, образуя инфекционное потомство (продуктивная инфекция); 2) вирус проходит неполный цикл репродукции с образованием неполного (вируса на поверхности клеток или неинфекционных вирусных частиц в среде (абортивная инфекция); 3) вирусу не удается инфицировать кленку. Некоторые экспериментальные данные (позволяют полагать, что .можно установить состояние хронической инфекции, при (котором небольшие количества инфекционного вируса выделяются в среду на протяжении длительного времени (иереистентная инфекция).

1. Продуктивная инфекция

Репликативный цикл вирусов гриппа детально описан

в гл. 8. За введением вируса 1938; Haff et al., 1966; Marois et al., 1971). Поскольку это весьма близко напоминает реакцию на заражение у человека, возобновился интерес к удобной модели для изучения иммунитета и методов иммунизации. Potter et al. (1972a, b) и Potter (1973) в серии сообщений описали отсутствие защитного эффекта при внутримышечном введении водной инактивиро-ванной вакцины. Иммунизация с использованием адъюванта обеспечивает некоторую степень защиты и вызывает подъем уровня антигем-агглютининов в сыворотке, но иммунитет при этом не столь выражен, как после перенесенного заболевания. Это в общем соответствует данным, полученным на людях, и позволяет полагать, что отсутствие полного иммунитета при использовании убитой вакцины обусловлено ее неспособностью вызывать появление антител в секрете слизистой оболочки носа. Антитела в смывах из носа постоянно обнаруживаются при естественном заболевании (Haff, 1973).

Белые швейцарские линии мышей использовались как лабораторная (модель для изучения вирусов гриппа человека на протяжении 40 лет (Andrewes et al., 1934; Francis, 1934). Преимущества использования мышей очевидны: малые размеры и низкая стоимость допускают такие лабораторные исследования, которые были бы невозможны при использовании более крупных и дорогих животных, например хорьков.

В отличие от хорьков мыши не обладают высокой восприимчивостью к вирусу гриппа. Интраназалыное введение инфекционного материала от больных людей не вызывает выраженной картины заболевания у мышей, хотя вирус может размножаться в легких, бронхиолах, трахее и, в меньшей степени, тканях носовой полости (Hirst, 1947a; Lida, Bang, 1963; Mulder, Hers, 1972). Поскольку размножение вируса может быть засвидетельствовано лишь посредством титрования in ovo или in vitro, нельзя считать, что выделение (вируса путем заражения мышей имеет какие-либо преимущества.. Однако после адаптации, требующей шести или более пассажей легочного экстракта, вирусы гриппа типа А начинают вызывать ярко выраженные патологические изменения в легких, а также гибель животных уже через 48 ч после интра-назального заражения. Вирусы гриппа типа В труднее адаптировать к легким мыши. Эти выраженные патологические изменения, вызываемые вирусом трилпа А, .являются генетическим признаком, но которому идет отбор, причем этот признак независим от способности вируса размножаться в легких. Высокие титры вируса могут быть получены в легких при заражении неадаптированным штаммом, но размноже-

ние при этом не 'ведет к развитию патологических изменений и гибели (Hirst, 1947a).

Несколько иная картина наблюдается яри адаптации к мышам вируса, выращенного в курином эмбрионе. Первое интраназалыгое заражение обычно вызывает развитие (поражений в леших и гибель животного, в то время как несколько последующих пассажей не вызывают патологических изменений. Это явление можно объяснить токсичностью массивной дозы вируса, который (присутствует в аллантоисной жидкости в высокой концентрации. В организме мышей накапливается при этом очень мало вируса (Sugg, 1950). Специфические поражения легких и гибель мышей отмечаются лишь после 4—10 дополнительных пассажей легочной ткани.

Поражения легких, вызываемые вирусами гриппа у мышей, представляют собой настоящую вирусную пневмонию, похожую во (Многих отношениях на вирусную пневмонию у человека (Loosli, 1949; Mulder, Hers, 1972). Данные, полученные ранее с помощью световой микроскопии и указывавшие на специфическое поражение клеточного покрова альвеол, были подтверждены методом флюоресцирующих антител (Albrecht et al., 1963) и электронной микроскопией (Plum-raer, Stone, 1964). Хотя юсе клетки респираторного тракта чувствительны к 'вирусу, имеются данные о том, что у человека (см. гл. 13) клетки алывеол являются местом первоначального размножения вируса (Albrecht et al., 1963). Этот необычный восходящий путь респираторной инфекции, возможно, является скорее кажущимся, чем реальным. Когда животному под наркозом интраназально вводят вирус, он распределяется по всему респираторному тракту. Размножение вируса может -быть более быстрым в легких, чем в реснитчатом эпителии верхних дыхателыных путей.

При сублетальной инфекции вирус начинает исчезать из легких через 7 дней, что совпадает с появлением гуморальных антител. В процессе выздоровления эпителий альвеол замещается цилиндрическими и кубическими клетками .реснитчатого эпителия бронхиол. Наблюдается также метаплазия с появлением плоского эпителия (Baskerville et a]., 1974).

Поскольку воздушно-капельная передача инфекции от зараженных животных к незараженным происходит >в течение нескольких дней контакта, мыши .представляют собой прекрасную модель для изучения передачи вируса (Schulman, 1969). Мыши широко применялись также для изучения вакцин (Eddy, 1947; Kage et al., 1969), механизмов иммунитета (Schulman et al., 1968) и противовирусных препаратов (Da-vies et al., 1966; Suganuma, Ishida, 1973).

Вирусы гриппа типа А легко размножаются в легких хомяков при минимальных признаках заболевания (Friedewald, Hook, 1948). Те немногие штаммы вируса гриппа В, которые изучались в этом отношении, обладали лишь незначительной патогенностью, «о после адаптации могли вызывать поражения легких (Friedewald, Hook, 1948; Davenport, 1951; Kilbour-ne et al., 1951). В связи с низкой патогенностью вирусов гриппа для хомяков эти животные редко использовались для экспериментальных работ по гриппу. Однако недавно было обнаружено, что хомяки особенно удобны для оценки темпера-турочувствительных штаммов как пригодных для использования в качестве вакцины '(Mills, 'Chanock, 1971). Хомяк — одно из немногих лабораторных животных, имеющих температуру тела 37°С. Как и у хорьков, у хомяков не вырабатываются антитела при введении водной вакцины, если только не было предварительного заражения вирусом гриппа типа А (Potter et al., 1973).

Некоторые другие грызуны также использовались. Stuart-Harris (1937) сообщил, что вирус (гриппа может размножаться в ткани носовых раковин крыс и морских свинок, но не вызывает деструкции эпителия.

В. ПРИМАТЫ (ПОМИМО ЧЕЛОВЕКА)

Использование обезьян в качестве экспериментальной модели для изучения гриппа шло с переменным успехом. Еще в 1937 г. Mclntosh и Selbie пытались вызвать заболевание у макак резусов и зеленых мартышек вирусом H0N1, но безуспешно. Заражение макак резусов и циномольгус вирусом A/FM/1/47 .(.H1N1) дало такой же результат. Клинических проявлений болезни не наблюдалось, но были отмечены характерный некроз и десквамация эпителия (Verlinde, Makste-nieks, 1954).

Saslaw и Carlisle (1965) сообщили, что при заражении аэрозолем удается получить более четкие результаты; этот путь заражения они рассматривали как более естественный, чем интраназальный или интратрахеальный. Они смогли заразить обезьян макак (резусов и циномольгус вирусом типа A/PR8/34 (H0N1). Попытки заразить обезьян штаммами вируса H2N2 и вируса гриппа В были безуспешными. Berendt (1974) тоже использовал аэрозоли с малым размером частиц и сообщил, что у 6 макак резусов, зараженных вирусом типа А/Гонконг/68 (H3N2), наблюдалось выделение вируса во внешнюю среду и (появление антител. Явных клинических проявлений болезни не было. Все животные были иммунны к повторному заражению.

Кенийские павианы (Papio sp.) оказались чувствительными к заражению штаммом H3N2, подобным А/Гонконг/68 (Kalter et al., 1969). Вирус был обнаружен в смывах из глотки; кроме того, у зараженных животных и у животных, со-

державшихся в соседних клетках, появились антитела к вирусу. Клинически выраженного заболевания не было.

Г. ТЕЧЕНИЕ БОЛЕЗНИ В УСЛОВИЯХ ПОДАВЛЕНИЯ ИММУНИТЕТА

Воздействия на системы иммунитета у зараженных гриппом животных могут представлять интерес в аспекте повышения чувствительности к инфекции у экспериментальных животных и приобретения чувствительности у невосприимчивых хозяев. Однако сообщений о таких исследованиях немного и опубликованные данные противоречивы. Сообщалось (Singer et al., 1972), что у мышей, подвергнутых действию циклофосфамида, уменьшалась тяжесть заболевания, вызванного вирусом A/PR8. Наоборот, Virelizier и соавт. (1974) нашли, что мыши, получившие циклофосфамид, намного чувствительнее к летальному действию A/PR8, чем, нормальные линии: титр препарата вируса в LD50 был по крайней мере

в 100 раз выше у .мышей, обработанных циклофосфамидом'. Mayer и соавт. (1973) тоже обнаружили, что иммуносунпрес-сия, вызванная циклофосфамидом, усиливает нейровирулент-ность вируса A/NWS. Результаты этих двух работ позволяют полагать, что гуморальные антитела являются важным фактором в выздоровлении мышей при гриппозной инфекции. Мыши с удлиненной вилочковой железой были несколько чувствительнее к вирусу PR8, чем нормальные мыши (Virelizier et al., 1974). Исследование на курах с удаленной фабри-циевой сумкой показали (Portnoy et al., 1973), что у них повышалась чувствительность к заражению ВЧП; это рассматривалось как указание на роль гуморальных антител в выздоровлении от этой инфекции.

IV. ВЫДЕЛЕНИЕ ВИРУСА

Пробы для выделения вируса следует брать не позднее чем через 3 дня после начала заболевания. Вероятность выделения вируса быстро снижается после этого срока, но в некоторых случаях вирус можно выделить на 7-й и даже 10-й день болезни. Лучше всего вирус выделяется из носовых смывов. Однако мазки, взятые из глотки и носа, 'более удобны для врача и менее неприятны для больного. Пробы, предназначенные для выделения вируса, следует постоянно держать на холоде и как можно скорее использовать. Если нельзя инокулировать их в течение 48 ч после взятия, следует поместить пробы в закрытый сосуд и .хранить в сухом льду или в рефрижераторе при —70 °С. В летальных случаях при подозрении на гриппозную пневмонию следует пытаться выделить вирус из ткани легких, слизистой трахеи, а также крови. В этих случаях выделение вируса осуществлялось с переменным успехом (iDowdle, Coleman, 1974).

Вирусы гриппа А и В размножаются в куриных эмбрионах и у ряда лабораторных животных. Куриные эмбрионы и культуры клеток точек макак резусов и зеленой мартышки считаются наиболее чувствительными для выделения вируса. Вирус гриппа типа С выделяли только на куриных эмбрионах.

Для максимально успешного выделения вирусов следует заражать 10—11-дневные эмбрионы одновременно в полости амниона и аллантоиса. Эмбрионы инкубируют при 33 °С 3— 4 дня и пробы амниотической и аллантоисной жидкости проверяют на наличие вируса, добавляя эритроциты кур или морских свинок. Эритроциты морской свинки (или группы крови 0 человека) считаются более чувствительными, чем куриные, для обнаружения вирусов H0N1 и H1N1 на ранних пассажах в курином эмбрионе. Это не относится к вирусам,

Для выделения вируса гриппа типа С 7-дневные куриные эмбрионы заражают в полость амниона и инкубируют при 33°С 5 дней. В полости аллантоиса вирус плохо накапливается даже после (многочисленных пассажей на эмбрионах.

Клетки почек зеленых мартышек или макак резусов в мо-нослой'ной культуре в пробирках являются наиболее чувствительной культуральной системой для выделения вирусов гриппа А и В. Неопецифическое (подавление вирусов веществами, содержащимися в сыворотках в культуральной среде, является серьезной проблемой; монослой следует несколько раз промыть средой без сыворотки и использовать такую среду для поддержки культуры после заражения. Вирусы гриппа А хуже растут в культурах клеток, чем вирусы гриппа В. Цитопатический эффект проявляется в виде накопления вакуолизирующихся клеток, которые затем дегенерируют или отделяются от стекла. Цитопатический эффект проявляется в виде накопления вакуолизирующихся клеток, которые затем дегенерируют или отделяются от стекла. Цитопатический эффект слабовыражен, непатогнамоничен, может не выявляться при первых пасса'жах. Присутствие вируса обычно устанавливается гемадсорбцией эритроцитов морской свинки (Vogel, Shelokov, 1957) в течение 3—4 дней после заражения, задолго до развития выраженного цитопатического эффекта.

Большинство выделяемых штаммов вируса гриппа типа В может быть обнаружено гемадсорбцией или тем агглютинацией в течение 3—4 дней после заражения. Цитопатический эффект обычно тоже заметен. Клетки становятся зернистыми, набухают, округляются; позднее развиваются пикноз и фрагментация, слой клеток в конце концов разрушается. Развитие цитолатичесшго действия, и накопление (гемагглютининов могут быть ускорены для вирусов А и В, если поместить пробирки во вращающийся барабан, хотя вероятность выделения вируса от этого не увеличивается.

Следует одновременно культивировать незараженные культуры клеток в пробирках, чтобы исключить возможность случайной контаминации вирусами. Вирус парагриппа типа 2 (SV5), вызывающий гемадсорбцию, является нередким кон-

Трудно оценить количественно эффективность выделения вирусов гриппа А и В в культуре ткани и на эмбрионах. Обилие выделяемых штаммов обоих вирусов сильно варьирует по годам. Вообще говоря, культура клеток почек обезьян имеет преимущество при выделении вирусов В, но степень этого (преимущества варьирует. Вирус А еще более вариабелен и для него куриные эмбрионы чувствительнее клеточных культур. |По этой причине, а также в связи со значительной биологической (как и антигенной) изменчивостью вирусов гриппа не всегда можно сказать заранее, какой метод выделения окажется более эффективным. Заражение первичных культур почек макак резусов или зеленых мартышек одновременно с заражением куриных эмбрионов в полость аллан-. тоиса и амниона рекомендуется для выделения максимального количества штаммов вирусов гриппа А и 'В.

Albrecht P., Blaskovic D., Styk В ., Roller M. Acta virol. (Prague), 1963

Andrewes С . Н ., Laidlaw P. P., Smith W. Lancet, 1934, v. 2, p. 859. Barber W. H., Small P. A. Infect. Immunity, 1974, v. 9, p. 530. Basarab O., Smith H. Brit. J. exp. Path., 1969, v. 50, p. 612. Basarab 0., Smith H. Brit. J. exp. Path., 1970, v. 51, p. 1. Baskerville A., Thomas G., Wood M., Harris W. J. Brit. J. exp. Path., 1974,v. 55, p. 130.

Beare A. S., Keast K. A. J. gen. Virol., 1974, v. 22, p. 347

Becht И . J. gen. Virol, 1969, v. 4, p. 215.

Berendt R. F. Infec. Immunity, 1974,

Bernkoff H. Proc. Soc. exp. Biol., 1949, v. 72, p. 680. Boveridge W. I. В ., Burnet F. M. Med. res. Counc. (Gt. Brit.). Spec. Rep. Ser.,

J946, v. 256. Blaskovic P., Rhodes A. J., Labzoffsky N. A. Arch. ges. Virusforsch., 1972

Blaskovic P., Rhodes A. J., Labzoffsky N. A. Arch. ges. Virusforsch., 1972b,

Burnet F. M. Aust. J. exp. Biol. Med. Sci., 1940, v. 18, p. 353. Burnet F. M., Bull D. «.Aust. J. exp. Biol. Med. Sci., 1943, v. 21, p. 55. Came P. E., Pascale A., Shimonaski G. Arch. ges. Virusforsch., 1968, Bd 23