Заражение лабораторных животных вирусами
Подкожное заражение. Материал вводят в складку кожи, которую захватывают пальцами на спине, у корня хвоста (мышь), на животе (морские свинки, кролики). Прокалывают складку иглой, вводят иглу примерно наполовину, медленно впрыскивают материал. После этого отпускают складку кожи, накладывают на иглу кусочек ваты и быстро вынимают иглу. Во избежание выхода инъецированной жидкости иглу вынимают под углом 45º. Место введения обрабатывают спиртом.
Накожное заражение. На участок кожи, лишенный шерсти и продезинфицированный наносят царапину с помощью иглы или скарификатора. На царапину капают каплю заразного материала и втирают его в кожу шпателем или стеклянной палочкой.
Внутрикожное заражение. Накануне введения шерсть на боку или спине животного (кролики, морские свинки) подстригают, а затем выбривают. Тонкую иглу вводят острым углом в приподнятую складку кожи под эпидермис. Жидкость вводят в объеме 0,1-0,2 мл, при этом используют туберкулиновый шприц. В результате на месте введения поверхностный слой эпидермиса приподнимается в виде бугорка.
Внутримышечное заражение. Материал вводят длинной иглой глубоко в мышцу бедра, а у птиц – в мышцу груди.
Внутривенное заражение. Для этого способа заражения у кроликов используют краевую вену уха, у морских свинок – ушную и яремную, у кошек и собак – яремную и бедренную, у мышей и крыс – хвостовую вену, причем перед впрыскиванием хвост животных погружают в теплую воду, чтобы вызвать гиперемию. Место введения дезинфицируют, тщательно протирают ксилолом для набухания вены. Материал вводят тонкой иглой по направлению тока крови.
Внутрибрюшинное (интраперитонеальное) заражение. Животное держат вниз головой, чтобы внутренности брюшной полости опустились к диафрагме. При этом образуется свободное место для иглы. Укол делают в нижней трети живота, но не слишком низко. Это уменьшает опасность повреждения отдельных участков кишечника, мочевого пузыря и половых органов. Место инъекции дезинфицируют, берут складку кожи как при подкожном заражении, вводят в нее иглу, поворачивают под прямым углом и быстрым толчком прокалывают брюшную стенку. При таком способе заражения можно ввести большое количество заразного материала.
Заражение через пищеварительный тракт (пероральное). Наиболее простым способом является смешивание исследуемого материала или микробной взвеси с кормом, однако при этом нельзя учесть дозу инфекта. Более точные результаты получают при закапывании материала пипеткой через рот. При этом животное фиксируют в вертикальном положении, надавливанием пальцами на щеки или пинцетом открывают рот и медленно капают, давая проглотить каждую каплю. Для данного метода заражения используют также тонкий зонд, который вводят через нос. На наружный конец зонда надевают шприц. Это также позволяет дозировать вводимый материал. Мелких животных заражают при помощи шприца, на который надевают иглу с утолщением на конце в виде оливы.
Заражение через нос (интраназальное). Производят закапывание материала в нос пипеткой или иглой, надетой на шприц. Лучше такое заражение осуществлять под легким наркозом.
Внутричерепное (интрацеребральное) заражение. Мышей и крыс заражают как под наркозом так и без него. Заразный материал вводят на расстоянии 1-2 мм от точки пересечения средней линии черепа с линией, соединяющей наружные углы глаз. Место укола дезинфицируют. Для заражения используют туберкулиновый шприц с тонкой иглой. Кроликов и морских свинок заражают путем прокола тонкой кости в области надглазничной борозды. Испытуемый материал необходимо вводить медленно, чтобы не вызвать резкого повышения внутричерепного давления и предупредить обратный выход вводимого материала. У крупных животных производят трепанацию черепа.
Заражение через глаз (интроокулярное) можно проводить различными способами. Заражение через конъюктиву кролику или морской свинке проводят в задний угол глаза, капая одну каплю материала из пипетки.
При субконъюктивальном заражении тонкой иглой вводят 0,2-0,5 мл материала под конъюктиву. Образуется небольшой пузырек, который быстро рассасывается.
Заражение через прямую кишку (перректальное). Заражение производят путем введения заразного материала, суспендированного в физиологическом растворе, имеющем температуру тела, при помощи клизмы.
Основные методы культивирования вирусов:
1) биологический – заражение лабораторных животных. При заражении вирусом животное заболевает. Если болезнь не развивается, то патологические изменения можно обнаружить при вскрытии. У животных наблюдаются иммунологические сдвиги. Однако далеко не все вирусы можно культивировать в организме животных;
Выбор экспериментальных животных определяется целью работы и видовой чувствительностью к изучаемому вирусу. Для заражения используют обезьян, кроликов, морских свинок, хомячков, белых крыс и мышей.
Лабораторных животных заражают различными способами в зависимости от тропизма вируса к определенным тканям. Так, например, для культивирования нейротропных вирусов заражение производят преимущественно в мозг (вирусы бешенства, клещевого энцефалита и др.), культивирование респираторных вирусов осуществляется при интраназальном инфицировании животных (вирусы гриппа), дерматотропных (вирус оспы) – путем накожного и внутрикожного заражения. Наиболее часто используются накожное, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное и внутримозговое заражение.
Индикацию, т.е. обнаружение факта размножения вируса, устанавливают на основании развития типичных признаков заболевания, патоморфологических изменений органов и тканей животных или положительной реакции гемагглютинации (РГА). РГА основана на способности некоторых вирусов вызывать агглютинацию (склеивание) эритроцитов различных видов животных, птиц и человека за счет поверхностного вирусного белка – гемагглютинина.
В настоящее время использование животных для культивирования вирусов ограничено.
2) культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах. Большинство известных вирусов обладают способностью размножаться в курином эмбрионе (рис.56). Используют эмбрионы в возрасте от 8 до 14 дней в зависимости от вида вируса, способа заражения и задач исследования. Вирусы гриппа культивируются в 9–10-, осповакцины – в 12-, паротита – в 7-дневных куриных эмбрионах. Размножение вируса в куриных эмбрионах происходит в разных частях зародыша, что связано с особенностями тропизма вируса. Методику выращивания вируса в курином эмбрионе широко используют при промышленном культивировании.
Существует несколько способов заражения развивающегося куриного эмбриона: на хорионаллантоисную оболочку, в аллантоисную и амниотическую полости, желточный мешок, тело эмбриона.
Заражение на хорионаллантоисную оболочку применяется для выделения и культивирования вирусов, образующих на оболочках бляшки (вирусы вакцины, натуральной оспы, простого герпеса). Перед заражением яйца просвечивают с помощью овоскопа, карандашом очерчивают границу воздушного пространства и хорионаллантоисной оболочки. Поверхность яйца над воздушным пространством и в месте заражения протирают спиртом, прожигают, обрабатывают йодом и делают отверстие в полости воздушного мешка. На месте заражения скорлупу удаляют так, чтобы не повредить подскорлупную оболочку, которую затем прокалывают короткой стерильной иглой, чтобы не повредить хорионаллантоисную оболочку. Воздух из полости воздушного мешка отсасывают. Вирусный материал (0,05–0,2 мл) наносят на хорионаллантоисную оболочку туберкулиновым шприцем с короткой иглой или пастеровской пипеткой. Отверстие в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом или тем же выпиленным кусочком скорлупы и по краям заливают расплавленным парафином. Зараженные эмбрионы располагают на подставке горизонтально и инкубируют в термостате. Вскрытие эмбрионов производится не раньше 48 ч инкубации. На зараженной оболочке обнаруживаются беловатые непрозрачные пятна разной формы (бляшки).
Заражение в аллантоисную полость. Вирус, введенный в аллантоис, размножается в эндодермальных клетках, переходя затем в аллантоисную жидкость. Заражение осуществляют следующим способом: в скорлупе над воздушной камерой острием скальпеля или ножниц производят прокол, после чего через отверстие в вертикальном направлении вводят иглу со шприцем, которая проходит через хорионаллантоисную оболочку и попадает в аллантоисную полость, материал вводится в объеме 0,1 мл и отверстие заливают парафином.
Заражение в желточный мешок. С этой целью используют эмбрионы 5–10-дневного возраста. Наиболее употребительны два метода заражения. По первому материал вводится через воздушное пространство. В центре яйца делают отверстие, помещают его на подставку тупым концом вправо и через отверстие в вертикальном направлении вводят иглу, надетую на шприц, игла проходит через хорионаллантоисную оболочку, аллантоисную полость в желток. В желточный мешок можно ввести от 0,1 до 0,5 мл вируссодержащего материала. После заражения отверстие в скорлупе заливают парафином, и эмбрион помещают в термостат. По второму методу на границе воздушного пространства с той стороны, где лежит желток (стороны, противоположной от эмбриона), делают прокол скорлупы, через который вводят инфекционный материал. Направление иглы должно быть к центру яйца.
Индикацию вирусов в курином эмбрионе осуществляют на основании специфических поражений оболочек и тела эмбриона (оспины, кровоизлияния), а также в РГА.
В результате заражения могут происходить и появляться:
1) гибель эмбриона;
2) дефекты развития: на поверхности оболочек появляются образования – бляшки, представляющие собой скопления погибших клеток, содержащих вирионы;
3) накопление вирусов в аллантоисной жидкости (обнаруживают путем титрования);
4) размножение в культуре ткани (это основной метод культивирования вирусов).
12.3. Способы заражения лабораторных животных
В зависимости от цели исследования используют различные способы заражения: внутрикожный, подкожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, пероральный или интраназальный. При перечисленных способах, за исключением перорального и интраназального, заражение осуществляется с помощью шприца.
Взвесь микробной культуры, эмульсию из зараженных органов или кровь больного осторожно набирают в шприц, после чего конец иглы закрывают кусочком ваты, смоченным 5,0 % раствором хлорамина или спиртом. Повернув шприц иглой кверху, осторожно выпускают из него пузырьки воздуха и вводят содержимое шприца животному.
Внутрикожный способ заражения. При этом способе применяют тонкие (№ 18–20) острые иглы с небольшим скосом. Кожу в месте введения материала растягивают I и II пальцами левой руки, правой рукой вводят иглу под очень острым углом, почти касаясь кожи. Конец иглы должен быть виден через эпидермис: при введении материала эпидермис приподнимается в виде четко ограниченного бугорка, кожа над ним становится прозрачной и пористой, вследствие чего ее сравнивают иногда с лимонной корочкой. Материал вводят в объеме до 0,1 мл обычно в кожу спины или живота.
Подкожный способ заражения. Кожу в месте введения материала приподнимают I и II пальцами левой руки. Иглу шприца вкалывают в основание образовавшейся складки. Проколов кожу и пройдя вглубь на несколько миллиметров, иглу отклоняют вправо или влево и затем медленно вводят материал, содержащийся в шприце. Изменять направление иглы под кожей рекомендуется для того, чтобы введенное вещество не выступало через прокол кожи наружу. Затем складку кожи опускают, на место укола накладывают ватный тампон, смоченный спиртом или спиртовым раствором, а иглу быстро вынимают. Наиболее удобными местами для подкожного введения материала у кроликов и морских свинок являются область спины и боковые поверхности несколько ниже подмышечных впадин, у крыс и мышей – область спины, крестца и затылка. Количество жидкости, вводимой подкожно, не должно превышать 30 мл для кроликов, 15 мл – для морских свинок, 10 мл – для крыс и 1 мл – для мышей.
Внутримышечный способ заражения. Выбирают участок тела с наиболее развитым мышечным слоем. У кроликов, морских свинок, крыс и мышей таким местом является наружная верхняя треть бедра задней лапы. Захватывают I и II пальцами левой руки толстую мышечную складку и вводят иглу почти под прямым углом в глубь мышц. Объем жидкости, допустимый для внутримышечного введения, составляет для кроликов 8 мл, для морских свинок – 5 мл, для крыс – 3 мл, для мышей – 0,5 мл.
Внутрибрюшинный способ заражения. Помощник держит животное вниз головой. В этом положении кишечник смещается в сторону диафрагмы, что в значительной мере уменьшает возможность его повреждения в момент прокола. У животных (за исключением мышей) в нижней трети живота, несколько отступя от средней линии, делают скальпелем или остроконечными ножницами надсечку кожи длиной 2–3 мм и через нее вводят притуплённую иглу, держа шприц перпендикулярно брюшной стенке. Преодолевая сопротивление, очень осторожно, буравящими движениями иглу продвигают вглубь. Чувство "провала", исчезновение ощущения сопротивления на пути говорят о проникновении иглы в брюшную полость. После этого иглу переводят в вертикальное положение и вводят содержащийся в шприце материал в полость брюшины. Внутри-брюшинно можно вводить до 30 мл жидкости кроликам, до 10мл – морским свинкам, до 5 мл – крысам, до 2 мл – мышам.
Внутривенное заражение кроликов. Кроликов заражают в краевую вену уха. Вдоль наружного края уха выщипывают шерсть, затем это место слегка пощелкивают кончиками пальцев, чтобы вызвать гиперемию сосудов, и протирают ватой, смоченной в 70 % спирте. После явного набухания вены под ухо подводят II палец левой руки. Прокол вены следует делать ближе к верхушке уха, так как при частых уколах возможна облитерация сосуда в этом месте, но проксимальный участок вены остается неповрежденным. Чтобы удостовериться, правильно ли введена игла, сначала вводят небольшое количество материала. При нахождении иглы в полости вены материал вводится свободно, в противном же случае жидкость из шприца вытекает с трудом, а на ухе в месте введения образуется вздутие. Если игла не попала в вену, ее вынимают и вводят повторно в другое место ближе к основанию уха. По окончании введения нижний участок вены слегка придавливают, а к месту укола прикладывают кусочек стерильной ваты, смоченной спиртом или спиртовым раствором йода, после чего из вены извлекают иглу. Внутривенно кроликам можно вводить до 20 мл жидкости.
Внутривенное заражение крыс и мышей. Крыс и мышей заражают в боковую вену хвоста. Непосредственно перед введением материала хвост животного, чтобы вызвать гиперемию сосудов, погружают в сосуд с водой, подогретой до 50°С, смазывают ксилолом или толуолом. После того как сосуды заметно набухают, корень хвоста сдавливают пальцами. Для введения материала лучше всего пользоваться туберкулиновыми иглами, очень тонкими и короткими, с косым срезом. При введении иглы в вену шприц держат под острым углом, почти параллельно оси хвоста. Иглу поворачивают отверстием наружу. Корень хвоста освобождают от сдавливания. Как и в предыдущем случае, нахождение иглы в вене определяют по легкости введения материала и отсутствию заметного уплотнения в месте, где находится игла. Взрослым белым крысам допускается вводить до 6 мл жидкости, мышам – до 0,5 мл.
Заражение через пищеварительный тракт. Заразить животное через рот можно двумя способами. Материал, предназначенный для заражения, примешивают к корму или питью животного. Такой способ является наиболее простым и естественным, однако в лабораторной практике применение его ограничено, поскольку количество материала, попадающее в организм заражаемого животного, не подлежит точному учету.
В связи с этим значительно чаще материал, предназначенный для заражения, вводят животному шприцем, игла которого имеет незначительный изгиб и утолщение на конце в виде оливы. Наличие изгиба допускает введение иглы в пищевод животного. Диаметр иглы для мышей должен быть не более 1 мм, для крыс – 1–1,5 мм, длина – соответственно 35–45 и 70–75 мм.
Крыс и мышей фиксируют перед заражением в вертикальном положении: одной рукой помощник держит животное за складку кожи на затылке, около ушей, другой – за корень хвоста. Животным открывают рот браншами пинцета, вставляя их между нижней и верхней челюстями. Иглу, введенную в рот, продвигают по задней стенке глотки на глубину 1 см у мышей и 2–2,5 см у крыс. На указанной глубине игле придают вертикальное положение. Процесс введения иглы, как правило, затруднений не представляет, конец ее проникает непосредственно в желудок или в нижний отдел пищевода. Количество материала, вводимого за один раз в желудок мышей, должно быть не более 1 мл, взрослых крыс – не более 3,5 мл (рис. 12.7).
А.Е.Попова (1972) при пероральном введении жидкостей мелким лабораторным животным предложила пользоваться вместо металлического зонда с оливой полихлорвиниловой трубкой, представляющей собой наружную оболочку одного про вода многожильного телефонного кабеля, из которого удален проводник. Длина трубки 15–17 см, наружный диаметр 1– 1,5 мм, внутренний просвет 0,5–0,7 мм.
Рис. 12.8. Заражение кролика per os.
В отличие от металлического зонда, часто попадающего в дыхательные пути и вызывающего гибель животных от асфиксии, а при глубоком введении повреждающего стенку желудка и пищевода, эластический зонд при незначительном усилии легко проникает из полости рта в пищевод и желудок животного, не требуя строгого ограничения глубины введения, так как даже при излишне глубоком введении стенки желудка не повреждаются.
Вводимая жидкость дозируется с помощью шприца, на сосок которого надевают эластичный зонд.
Морских свинок и кроликов перед заражением peros фиксируют в нормальном для животного положении. Удобнее всего завернуть их в полотенце и посадить к помощнику на колени.
Зараженный материал вводят через эластичный зонд. Для этой цели обычно выбирают катетер из наиболее мягкой и эластичной резины длиной 7,5–8 см и толщиной не более 0,3–0,5 см. Перед введением зонда в рот животному вставляют роторасширитель, или, как его называют, "зевник", который представляет собой дощечку с круглым отверстием в середине. Ширина дощечки для кролика равна 2 см, для морской свинки – 1 см. Через отверстие вставленного в рот "зевника" осторожно вводят в пищевод зонд, смазанный вазелином или глицерином. Для того чтобы облегчить введение зонда, животному вливают пипеткой в рот несколько капель воды, вызывая глотательные движения, во время которых зонд легко, без внешнего воздействия продвигается в глубь пищевода. Наружный конец введенного зонда присоединяют к шприцу, наполненному материалом, который вводят в желудок медленно в количестве 2,5–3,5 мл морским свинкам и 3,5–5 мл кроликам (рис. 12.8).
Заражение через дыхательные пути (интраназальное заражение). Животному, фиксированному на доске, прикладывают к носу кусочек ваты, смоченной эфиром или хлороформом. К заражению приступают после того, как у животного появится состояние легкого наркоза. Зараженный материал с помощью шприца вводят в нос небольшими каплями на глубину 1–1,5 мм мышам, 2–3 мм крысам, 4 мм кроликам и морским свинкам. Чтобы не поранить слизистые оболочки, для введения материала берут абсолютно тупую иглу.
Прочитайте:
|
Методы заражения лабораторных животных с целью выделения и культивирования вирусов применяются значительно реже, чем культуры клеток и куриные эмбрионы. Тем не менее для ряда вирусных инфекций выявление возбудителя путем заражения животных имеет первостепенное значение (например, выявление вирусов Коксаки, бешенства, клещевого энцефалита). Следует отметить, что метод выделения вирусов путем заражения лабораторных животных был первым и долгое время единственным методом, с помощью которого удалось обнаружить целый ряд вирусов.
Экспериментальные модели. Восприимчивые к изучаемым вирусам животные называются эксперименгальной моделью. В качестве модели отбирают животных, обладающих видовой чувствительностью и высокой восприимчивостью к определенным вирусам.
Взятые в опыт животные должны быть одного вида, определенного возраста и содержаться в одинаковых условиях,
экспериментального животного существенно влияет на воспроизведение инфекции. Например, при заражении вирусами Коксаки используют мышей-сосунков семидневного возраста, которые более восприимчивы к этим инфекциям нежели 3-4-недельные мыши.
Необходимым условием успешного выделения вирусов является использование животных, свободных от латентных (скрытых) инфекций вирусной, бактериальной или протозойлой этиологии, которые нередко встречаются у многих видов лабораторных животных. К таким заболеваниям относятся вирусные пневмонии, вирусный энцефаломиелит белых мышей, протозойный энцефалит многих млекопитающих и птиц и др.
Для вирусологической работы чаще всего используют так называемые "чистые линии" экспериментальных животных. Они обладают однотипной наследственностью, имеют минимальное число латентных инфекций, обладают высокой восприимчивостью к вирусам. Особенно чувствительны к вирусам животные-гнотобионты. Работу с животными рекомендуется проводить в настольном боксе или в специальной операционной вивария. Все отходы и трупы погибших животных автоклавируют и сжигают, (см. граф 5, стр. 43).
Методы и техника заражения животных. Лабораторных животных заражают различными вируссодержащими материалами, взятыми от больных людей, от павших и забитых животных и т.п. Исследуемый материал должен быть взят с учетом патогенеза данного вирусного заболевания и тропизма возбудителя.
Способы заражения лабораторных животных, применяемые при вирусологических исследованиях в основном такие же, как при
заражении другими инфекционными материалами. Применяют подкожное, накожное, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное, пероральное, интраназальное, интрацсребральное заражение и др. Выбор способа заражения животных проводят с учетом тропизма исследуемого вируса к определенным тканям,
Ниже приводятся два метода заражения - интраназальное (в нос) и интрацеребральное (в мозг), которые имеют некоторые
Интраназальное заражение. Этот метод используют для выделения пыевмотропных (респираторных) вирусов. Заражение мышей проводится под эфирным наркозом.
Животных помещают под стеклянный колпак или в закрытую стеклянную банку, в которую положен кусок ваты, пропитанный эфиром. Эфир следует давать в значительной дозе в течение сравнительно короткого срока для создания непродолжительного, но глубокого сна. Показателем достаточности наркоза является глубокое, ритмичное дыхание животного, отсутствие кашлевых толчков во время заражения.
Объем заражающего материала для мышей 0,03-0,1 мл, его вводят с помощью шприца или пастеровской пипетки в ноздри животного.
Иптраназальный метод заражения животных можно осуществить также путем аэрозольного способа введения материала. Для этого подопытное животное помещают в специальную камеру, в которой распыляют исследуемый вируссодержащий материал. За зараженными животными устанавливается наблюдение, при появлении признаков заболевания мышей забивают при помощи эфирного наркоза, а затем вскрывают.
Этапы вскрытия животных. Для выделения респираторных вирусов вскрытие проводят в следующем порядке:
1. Увлажненный 5% раствором лизола или фенола труп
мыши фиксируют на простерилизованной поверхности (обычно
это кювета со смесью воска и парафина) брюшком вверх.
2. Обрабатывают кожные покровы спиртом, йодом и вновь
спиртом; опаливают пламенем.
3. Ножницами делают продольный разрез кожи от нижней
челюсти до лобка и боковые разрезы к лапкам, отсеиаровьгвают ее.
4. Вскрывают трудную полость, вырезав грудину
ножницами по реберным хрящам.
5. Осматривают внешний вид органов грудной полости,
обращая внимание на наличие эксудата. Извлекают легкие при
строгом соблюдения асептики и сохраняют их при минусовой
температуре в морозильнике до получения ответа на
бактериологический контроль-результат посева кусочка легочной
ткани в мясо-пелтонный бульон (после выдерживания его в
термостате при 37 °С в течение суток ).
6. При отрицательном контроле на бактериальную
загрязненность готовят 10% суспензию легочной ткани путем
растирания ткани в фарфоровой ступке, с постепенным
добавлением физиологического раствора.
7. Суспензию центрифугируют для осаждения крупных
частиц при 1500 об/минут, надосадочную жидкость собирают и
используют для последующего вирусологического исследования.
Интрацеребральное заражение. Этот метод предназначен для выделения нейротропньх вирусов.
При заражении мыши в мозг ее плотно прижимают левой рукой к столу, большим и указательным пальцами оттягивают кожу головы к затылку, мизинцем и безымянным фиксируют хвост. Лобный участок головы предварительно обрабатывают 3% йодной настойкой. Заражающий материал (кровь) в объеме 0,02-0,03 мл вводят в мозг туберкулиновым шприцем с тонкой иглой, снабженной предохранительной муфтой, путем прокола лобной кости на глубину 1,5-2 мм. Материал вводят постепенно, чтобы не было резкого повышения внутреннего давления.
Этапы вскрытия животных. Для выделения нейротропных вирусов вскрытие животных осуществляют в следующей последовательности:
1. Труп увлажняют раствором лизола или фенола.
2.Обрабатывают кожные покровы головы последовательно спиртом, йодом и вновь спиртом, опаливают пламенем.
3.Вскрывают и отделяют кожу головы. Отрезают голову, помещают ее в стерильную чашку Петри, проведя предварительно через пламя горелки.
4.Вскрывают ножницами черепную коробку, извлекают мозг сохраняют его в замороженном состоянии до получения результата бактериологического контроля.
5.В случае отрицательного бактериологического контроля из мозговой ткани приготавливают 10% суспензию в физиологическом растворе. Освобождают ее от крупных тканевых частиц центрифугированием, надосадочную жидкость используют для вирусологической работы.
Первичное заражение лабораторных животных вирусе од ержащим материалом не всегда приводит к развитию экспериментальной инфекции. При многих вирусных инфекциях возможны так называемые "слепые" пассажи, при которых наличие вируса выявить не удается.
После 4-5 таких пассажей через организм восприимчивого животного, вирус приобретает способность вызывать заболевание. При этом в соответствующих тканях вирус накапливается в достаточном количестве, что позволяет провести его идентиф икацию.
На лабораторных животных проводят титрование вирусов, ставят реакцию нейтрализации; животных используют для получения вирусных вакцин, диагностикумов, противовирусных сывороток.
Дата добавления: 2014-12-11 | Просмотры: 2190 | Нарушение авторских прав
Способы фиксации и техника заражениятем или другим методом также различны для животных разных видов. Кроликов удерживают за кожу спины ближе к лопаткам, а другой рукой придерживают за заднюю часть тела. Такая фиксация предотвращает получение царапин. Морских свинок держат одной рукой за грудь, а другой – за задние лапы. Крыс и мышей берут за хвост, дают им возможность уцепиться передними конечностями за металлическую сетку (например, клетки), захватывают двумя пальцами левой руки кожу на затылке и слегка растягивают животное. При этом крыс прочнее и безопаснее фиксировать корнцангами, а для большей надежности голову животного можно удерживать двумя корнцангами за щечные кожные складки. Оба этих корнцанга помощник держит в левой руке, а корнцанг, фиксирующий хвост, – в правой.
Белых мышей без помощника фиксируют, захватывая складку кожи между ушами пинцетом Пеано, который, в свою очередь, укрепляют, набрасывая его кольца на держатели штатива Бунзена или, что еще проще, на стоящую в обычном штативе пробирку. Возможна фиксация мышей и одной рукой.
Перед заражением место введения материала тщательно обрабатывают 3%-ным спиртовым раствором йода.
Смонтировав шприц и укрепив на нем инъекционную иглу, набирают вируссодержащий материал так, чтобы во флакон или пробирку была введена только игла, но не цилиндр шприца.
От попавшего с набираемым в шприц материалом воздуха освобождаются, повернув шприц вертикально вверх иглой, которая предварительно воткнута в толщу стерильного комочка ваты, упакованного в сложенный по типу конверта небольшой лист пергаментной бумаги. Иглу вкалывают в толщу ватика через складки бумаги, где ее не касались руками. Ватики предотвращают потерю капель вируссодержащего материала из шприца, т. е. распространение вируса в окружающей среде. Кроме того, игла, находясь в ватике, до момента инъекции остается стерильной.
Заражение через пищеварительный трактпредставляет значительный интерес для выяснения патогенеза болезней, передающихся алиментарным путем (кишечные вирусные инфекции).
В зависимости от поставленной задачи животных заражают per os, в желудок и ректально.
Per os – вируссодержащий материал вводят с пищей, а также с помощью тупой иглы, не прикасаясь к слизистым оболочкам, по нескольку капель в один прием. Через несколько минут процедуру повторяют. В желудок инфекционный материал вводят с помощью зонда или желатиновых капсул, содержащих исследуемую суспензию. Ректально заражают путем введения вирусного материала, суспендированного в физиологическом растворе, имеющем температуру тела, при помощи клизмы. Анальное отверстие заклеивают лейкопластырем, создавая копростаз, что ускоряет проникновение в организм заразного начала.
Подкожное заражение. Кожную складку, захваченную большим и указательным пальцами левой руки, приподнимают и в ее основание параллельно поверхности тела вводят иглу со шприцем. Местом инъекции, как правило, у большинства животных является область спины, бока, плеча, лопатки и реже боковой стенки грудной клетки (собака), коленной складки (морская свинка), шеи (куры).
Внутрикожное заражение. Для заражения этим методом у кроликов на боку или животе выстригают, а затем выбривают шерсть на участке кожи. Подготовленное поле протирают спиртом и физраствором. Иглу шприца скосом наружу вводят под острым углом в толщу поверхностного слоя кожи на несколько миллиметров. Материал инъецируют до приподнимания слоя кожи в виде бугорка.
Мелким лабораторным животным внутрикожно вводят материал в плантарную поверхность задней конечности, которую фиксируют, отводя ее назад и помещая на указательный палец левой руки. Правой рукой иглу со шприцем вводят в кожу в направлении от пальцев к голеностопному суставу.
Для размножения в организме дермотропных вирусов (например, возбудителей оспы) содержащий их материал втирают в скарифицированную кожу. На коже, подготовленной, как и для внутрикожного заражения, делают несколько поверхностных царапин иглой или обломленной пастеровской пипеткой до появления капелек лимфы. Затем наносят материал и втирают его шпателем, стеклянной палочкой или остриженной зубной щеткой. Заражение в скарифицированную кожу у крупных животных проводят на боку или животе, у морской свинки – на плантарной поверхности ступни, у мелких животных – в области спины, у петухов – в гребень и сережки, а также в перьевые фолликулы голени сразу же после удаления перьев.
Внутримышечное заражение. Для этого способа заражения чаще всего выбирают мышцы бедра, а у кур – большую мышцу груди. Иглу после дезинфекции места инъекции вводят через кожу и подкожную клетчатку в мышцы, направляя перпендикулярно к поверхности тела. После инъекции материала иглу извлекают, место введения повторно дезинфицируют.
Внутрибрюшинное заражение. Животное при данном способе заражения фиксируют вертикально вниз головой для того, чтобы органы брюшной полости сместились к диафрагме и при введении материала игла не травмировала кишечник (рис. 10). В области паха, а у кур на середине расстояния между верхушкой грудной кости и клоаки короткую иглу вводят сквозь кожу и брюшинную стенку, направляя под углом 45° к продольной оси тела. При этом левой рукой слегка оттягивают лапу животного, создавая натяжение кожи и мышц брюшной стенки со стороны инъекции. Проникновение иглы ощущается по исчезнувшему сопротивлению брюшной стенки.
Внутривенное заражение. Важно контролировать, чтобы в вену из шприца не попали пузырьки воздуха или частицы материала, которые могут вызвать эмболию и гибель животного.
Рисунок 10 - Внутрибрюшинное заражение мыши
Рисунок 11 - Внутривенное заражение мыши
Белых мышей и крыс заражают в боковые вены хвоста, предварительно расширив их, растирая тампоном, смоченным ксилолом или горячей водой. Помощник левой рукой сдавливает хвост у корня, а правой фиксирует животное за кожу затылка (рис.11). Иглу скосом наружу вводят под острым углом в вену нижней трети хвоста, где кожа тоньше, и направляют к корню хвоста. Если игла попала в сосуд, то жидкость легко поступает из шприца, а сосуд на всем протяжении бледнеет.
Освободив вену у корня хвоста, медленно вводят материал. Затем вену передавливают ниже места вкола, иглу извлекают, и место инъекции прижимают сухой ватой.
Морским свинкам можно ввести вирус в ток крови, только проникнув иглой в сердце. Для этого определяют место сердечного толчка, в межреберный промежуток слева и на 1 см выше мечевидного отростка вводят иглу без шприца. Если в игле покажется кровь, значит, игла попала в сердце, и тогда, присоединив шприц, инъецируют материал.
Кроликам внутривенно материал вводят в краевую вену уха, предварительно удалив волосы на месте инъекции и пережав сосуд ниже вкола иглы. Игла должна быть направлена по ходу тока крови, т.е. к голове.
Птице вируссодержащий материал вводят в подкрыльцовую вену.
Интраназальное заражение
Большинство лабораторных животных (за исключением кроликов) при закапывании материала в ноздри чихают и разбрызгивают вируссодержащую суспензию. Поэтому перед интраназальным заражением животным делают глубокий эфирный наркоз. Для этого помещают их в банку с крышкой и кусочком смоченной эфиром ваты. Заснувших животных извлекают, фиксируют вверх ноздрями. Материал по каплям вводят в ноздри, и с вдыхаемым воздухом он втягивается внутрь.
Кроликам же вируссодержащую суспензию можно закапывать в ноздри по каплям при запрокинутой на спину голове без наркоза.
Рисунок 12 - Интрацеребральное заражение кролика
Интрацеребральное заражение.Кожу головы мышат большим и указательным пальцами левой руки оттягивают к затылку. Иглой шприца с ограничителем прокалывают кожу и череп на глубину 1–2 мм в точке, лежащей в центре квадрата, образованного средней сагиттальной линией и перпендикуляром к ней, проходящим по наружному краю глазниц.
Белых крыс интрацеребрально заражают через трепанационное отверстие, а молодых кроликов и морских свинок – прокалывая кости черепа в надглазничной борозде, где кость довольно тонкая. Иглу используют с ограничителем, обеспечивающим проникновение иглы не более чем на 4–5 мм.
Старых животных интрацеребрально заражают через трепанационное отверстие (рис. 12).
Объем заражающей дозы материала значительно варьирует в зависимости от метода внесения и вида животных (табл. 4).
Таблица 4 - Максимальные объемы вводимого материала для лабораторных животных
| Метод заражения | Кролики | Морские свинки | Белые крысы | Белые мыши |
| Внутрикожный | 0,1 | 0,1 | 0,05 | 0,02 |
| Подкожный | 5,0 | 3,0 | 3,0 | 0,5 |
| Внутримышечный | 5,0 | 2,0 | 1,0 | 0,3 |
| Внутрибрюшинный | 10,0 | 5,0 | 2,0 | 1,0 |
| Внутривенный | 5,0 | 2,0 | 2,0 | 1,0 |
| Интраназанальный | 1,0 | 0,3 | 0,1 | 0,03 |
| Интрацеребральный | 0,3 | 0,05 | 0,03 | 0,02 |
СОДЕРЖАНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ ПОСЛЕ ЗАРАЖЕНИЯ
После заражения животные должны быть помещены в клетки, на которые навешивают этикетки с указанием вируса или номера экспертизы исследуемого материала, количества и номеров зараженных животных, даты заражения. В рабочем журнале записывают название вируса или номер экспертизы исследуемого материала, количество и характеристику зараженных животных, их маркировку, метод введения и дозу вируса.
За животными устанавливают наблюдение, обращая внимание на их внешний вид, подвижность, прием корма и т. п. Следует отметить, что гибель животных в первые дни после заражения может быть связана с травмой или токсическим действием исследуемого материала.
Задания
1.Отработка приемов фиксации и экспериментального заражения лабораторных животных всеми методами.
2.Заражение внутрикожно белых мышей вирусом эктромелии и кроликов вирусом осповакцины.
Самостоятельная работа студентов
Студенты отрабатывают приемы фиксации и экспериментального заражения лабораторных животных всеми методами.
Подведение итогов занятия
Задание к следующему занятию
Контрольные вопросы
1. С какой целью используют лабораторных животных в вирусологических исследованиях.
2. Требования, предъявляемые к лабораторным животным, уход, содержание.
3. Животные - гнотобиоты. СПФ - животные.
4. Методы заражения лабораторных животных.
Механическое удерживание земляных масс: Механическое удерживание земляных масс на склоне обеспечивают контрфорсными сооружениями различных конструкций.
Опора деревянной одностоечной и способы укрепление угловых опор: Опоры ВЛ - конструкции, предназначенные для поддерживания проводов на необходимой высоте над землей, водой.
Читайте также: