Экспресс метод исследования на инфекции

Далеко не всякая инфекция проявляет себя — многие бактерии и вирусы могут годами жить в нашем организме, не вызывая никаких подозрений. Однако последствия скрытых инфекций бывают очень серьезными. В этой статье мы расскажем о том, как найти и определить возбудителя заболевания и какими бывают анализы на скрытые инфекции.

В основном к скрытым инфекциям относятся заболевания, передающиеся половым путем. Это болезни с продолжительным инкубационным периодом. Они могут никак не проявляться на протяжении нескольких месяцев и даже лет. Таких инфекций более 30. К самым распространенным относятся сифилис, герпес, гонорея, а также менее опасные уреаплазмоз, вирус папилломы человека и хламидиоз. Однако и они могут создать значительные проблемы, особенно при планировании беременности.

Протекая бессимптомно, скрытые инфекции вызывают воспаление и легко переходят в хроническую форму. Последствиями скрытых инфекций, передающихся половым путем, могут быть частые воспалительные заболевания мочеполовой сферы, сложности с зачатием, у мужчин — проблемы с потенцией, у женщин — с менструальным циклом и вынашиванием детей.

Чаще всего скрытые инфекции обнаруживаются практически случайно — во время исследований, которые проводятся по совершенно иному поводу, например, во время выяснения причин бесплодия. Еще хуже, если скрытые инфекции у женщин диагностируются во время планового обследования после наступления беременности — многие из них оказывают негативное воздействие на плод, которое особенно выражено в первые недели беременности.

Именно поэтому сдавать анализы на скрытые инфекции нужно регулярно — если диагностировать их вскоре после заражения, лечение будет более простым и быстрым, они не успеют нанести существенного вреда здоровью. Рекомендуется сдавать анализы на скрытые инфекции через несколько недель после предполагаемого заражения (после незащищенного полового акта), а также перед планированием беременности — причем в этом случае сдать анализы нужно обоим партнерам. Врачи советуют проходить плановое обследование хотя бы раз в год. Анализы на скрытые инфекции доступны и стоят недорого, но при этом они могут помочь вам сохранить здоровье и средства.

Существует несколько методов лабораторной диагностики скрытых инфекций. Все они позволяют обнаружить возбудителя болезни на ранних стадиях, еще до появления первых симптомов заболевания. Некоторые анализы могут также показать стадию болезни, был ли человек заражен определенной инфекцией в прошлом, а также более или менее точно указать время заражения.

Микроскопический анализ. Биоматериалом обычно является мазок — клетки эпителия, которые берут из уретры или цервикального канала при помощи специальной мягкой щеточки, напоминающей щеточку от туши для ресниц. Для того чтобы результат был точным, перед забором материала нельзя пользоваться тампонами, вагинальными свечами и гелями, антибактериальным мылом, желательно также отказаться от половых контактов. Биоматериал из уретры берут до мочеиспускания. Полученный биоматериал переносят на предметное стекло и окрашивают специальными красителями (анилиновые красители, окраска по Граму, окраска по Романовскому), которые позволяют отчетливо увидеть определенных возбудителей заболеваний. Микроскопическое исследование также позволяет заметить косвенные признаки наличия воспалительной реакции — например, повышенное содержание лейкоцитов или фибрина. Такие возбудители, как трихомонады, гонококки, гарднереллы и грибки, отлично видны при микроскопическом исследовании, особенно во время острой стадии заболевания. Но вот при хроническом течении трихомониаза и гонореи точность этого метода не превышает 40%, что довольно небольшой показатель.

Бактериологический посев на микрофлору и чувствительность к антибиотикам. Для этого анализа также используется мазок. Полученный биоматериал переносят на питательную среду. В течение нескольких дней бактерии, полученные вместе с биоматериалом, размножаются в ней, а затем специалист рассматривает их в микроскоп и идентифицирует. У метода бактериологического посева есть один существенный плюс. При этом исследовании возможно не только выявить возбудителя болезни, но и экспериментальным путем выяснить, к какому типу антибиотиков он наиболее чувствителен. Это позволяет врачу сразу подобрать самые действенные препараты, которые однозначно сработают.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Методом ИФА исследуют сыворотку крови, взятой утром натощак, или мазок из уретры или цервикального канала. Метод ИФА показывает не самих возбудителей, а антитела к ним. Антитела вырабатываются нашей иммунной системой при столкновении с инфекцией. Эти белки специфичны, то есть для каждой отдельной инфекции защитная система вырабатывает определенный, характерный только для нее белок. ИФА эффективен и точен при выявлении тех инфекций, к которым формируются антитела — уреаплазмам, микоплазмам, хламидиям, различным паразитам и вирусам. Точность метода доходит до 90% [1] .

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ). Этим методом чаще всего исследуют мазок. Суть его заключается в окраске биоматериала специальными флуоресцентными антителами. Они соединяются с определенными возбудителями болезни, и специалист может увидеть их при помощи люминесцентного микроскопа — в особом излучении они начинают светиться. Это очень эффективный метод диагностики уреаплазмоза, микоплазмоза, хламидиоза, трихомониаза и некоторых других инфекций, которые порой непросто выявить другими способами. Точность этого метода — около 80% [2] .

Полимерная цепная реакция (ПЦР). Этим методом можно исследовать любой биоматериал, но на практике чаще всего для анализа берут мазок или кровь. Сегодня этот метод считается одним из самых современных и точных. Суть этого способа диагностики скрытых инфекций заключается в многократном копировании фрагмента ДНК или РНК возбудителя. Когда копий будет достаточно много, специалист идентифицирует их и выяснит, какой именно вирус или бактерия присутствует в организме. Преимущество метода ПЦР в том, что для диагностики достаточно наличия всего одного фрагмента РНК или ДНК. На практике это означает, что метод ПЦР позволяет проводить диагностику на самых ранних стадиях заболевания, тогда, когда остальные методы в этом случае могут дать ложноотрицательный результат [3] . Этот способ особенно точен в отношении вирусов, уреаплазм, микоплазм, гарднерелл, грибковых инфекций.

Скорость получения результатов зависит от метода исследования.

Дольше всего придется ждать результатов бактериологического посева. Это исследование никак нельзя отнести к экспресс-методам — результаты можно будет получить самое раннее через неделю, а часто приходится ждать еще дольше.

Результаты анализов, проводимых методом ИФА, РИФ или ПЦР, обычно выдают уже через сутки или через 2 дня.

Если лаборатория перегружена, результаты выдадут позже. Чаще всего это бывает с небольшими лабораториями, у которых нет достаточного количества сотрудников и оборудования. Крупные же учреждения работают быстрее.

Результаты анализов расшифровывает врач, он же выписывает направление на дополнительные исследования, если результат вызывает сомнения. Иногда результаты анализов, проведенных разными способами, не совпадают друг с другом — один дает положительный результат, а другой — отрицательный. Пусть это вас не настораживает — причина подобного положения вещей не в слабости методов, а в их специфике. Например, если ПЦР показал наличие инфекции, а ИФА — нет, это значит, что болезнь давно перешла в хроническую стадию и иммунная система уже не реагирует на нее, так как ПЦР показывает наличие возбудителя как такового, а ИФА — лишь реакцию защиты организма.

Бывает и наоборот: ПЦР — отрицательный, а ИФА — положительный. Это достаточно характерно для пациентов, которые не так давно вылечились от заболевания. Бактерий или вирусов уже нет, но антитела, выработанные организмом, еще присутствуют в биоматериале.

Сдать анализы на скрытые инфекции можно в государственных или частных лабораториях. Первый вариант — бесплатный, однако он сопряжен с некоторыми неудобствами. Нужно записаться на прием к врачу, получить направление, отстоять очередь. Часы работы муниципальных медучреждений не всегда удобны.

Именно поэтому многие предпочитают выбрать более короткий путь и обращаются в коммерческие лаборатории и частные клиники. Сдать анализы там можно и без направления от врача, по собственной инициативе, в любое удобное время, без очередей. Многие лаборатории даже предлагают комплексные обследования, в которые входят анализы на все самые распространенные скрытые инфекции, а также пакеты диагностических услуг для женщин, мужчин и тех, кто планирует стать родителями. Это очень удобно: во-первых, такие обследования дешевле, во-вторых, вам не придется думать, какие именно анализы целесообразно сдавать.

Цена анализов на скрытые инфекции может значительно различаться в разных лабораториях. На стоимость влияет и расположение лаборатории (чем она ближе к центру, тем дороже), и ее оснащение, и, наконец, уровень обслуживания.

Стоимость ПЦР на скрытые инфекции зависит от типа возбудителя. В среднем стоимость исследования составляет приблизительно 200–600 рублей за анализ на одного возбудителя и около 1500–2000 рублей за комплексное обследование.

Микроскопическое исследование стоит примерно 250–400 рублей.

ИФА — метод весьма недорогой и доступный, такой анализ обойдется в сумму около 200–600 рублей.

Бактериологическое исследование с определением чувствительности к антибиотикам стоит около 1400–2000 рублей.

Исследование методом РИФ обойдется для пациента приблизительно в 250–800 рублей.

К стоимости анализа как такового нужно прибавить и стоимость забора биоматериала — в районе 150–250 рублей за забор крови и от 200 рублей — за забор мазка.

Все современные методы диагностики скрытых инфекций информативны, но для того чтобы получить полную картину, нужно сдать несколько анализов — только тогда, сопоставив их результаты, врач сможет установить, есть ли инфекция и как именно нужно ее лечить.

ПЦР, КАК ЭКСПРЕСС МЕТОД ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Некультивируемость микроорганизмов - главная причина, по которой культуральный метод все более и более теряет свои позиции по мере появления альтернативных подходов. При этом под некультивируемостью мы понимаем, как невозможность на современном уровне развития микробиологии подобрать условия культивирования для большинства микроорганизмов, существующих в природе (по некоторым данным эта цифра может достигать 99%), так и невозможность высеять хорошо культивируемый микроорганизм из какой-либо биологической среды, содержащей ингибиторы его размножения. Кроме того, целый ряд клинически важных бактериальных возбудителей животных может плохо культивироваться из-за широкого применения в современной ветеринарной лечебной практике антибиотиков широкого спектра действия. Помимо этого, для многих возбудителей культуральный метод представляет собой трудоемкую, длительную и дорогостоящую процедуру. В то же время традиционные серологические тесты: РСК, РДП, РГА, а порой и наиболее перспективные методы диагностики - иммуноферментный анализ (ИФА) и иммунноблотинг (ИБ), оказываются фактически неэффективными или принципиально неприемлемыми для выявления инфекционных возбудителей по причине, главным образом, их низкой чувствительности.

Принцип ПЦР был описан в 1986 г. К. Мullis, получившим за это Нобелевскую премию в 1993 г. В основе этого метода лежит многократное копирование с помощью фермента ДНК-полимеразы определенного фрагмента ДНК, который является маркерным для данного вида. Механизм копирования таков, что комплементарное достраивание нитей может начаться не в любой точке последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках — коротких двунитевых участках. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют затравки, представляющие собой специально синтезированные in vitro олигонуклеотиды длиной около 20 нуклеотидов, называемые праймерами (рис.1).

Рис.1.Праймеры-основа специфичности ПЦР.

Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразой, протекает только между ними. В результате происходит экспоненциальное увеличение количества копий специфического фрагмента по формуле 2n , где п — число циклов амплификации (рис. 2).

Рис.2. Экспоненциальная ампфликация

Поскольку праймеры входят в состав амплифицируемого фрагмента, его размер определяется числом олигонуклеотидных пар между 5'-концами праймеров. Обычно размер фрагмента составляет несколько сотен нуклеотидных пар. Построение новых ДНК нитей из дезоксирибонуклеотидтрифосфатов осуществляет фермент термостабильная ДНК-полимераза, называемая Таq-полимеразой. Процесс амплификации заключается в повторении циклов амплификации, состоящих из денатурации ДНК (1 мин), отжига праймеров (1—2 мин) и построения фрагмента (1—2 мин). В результате 30—35 циклов амплификации синтезируется 10 8 копий фрагмента, что делает возможным визуальный учет результатов после электрофореза в агарозном или акриламидном геле. Использование термостабильной ДНК-полимеразы позволило автоматизировать процесс амплификации с помощью специального прибора, называемого термоциклером (рис.3).

Этот прибор автоматически осуществляет смену температур согласно заданной программе и числу циклов амплификации. Таким образом, ПЦР аналогична росту бактерий на искусственных питательных средах — процессу биологической амплификации, при которой одна микробная клетка, образуя видимую колонию, амплифицируется в 10 5 —10 6 раз, давая возможность определить свойства бактерии, манипулируя уже с целой колонией. Как и питательные среды, которые могут быть селективными, поддерживающими рост только одного микроорганизма, или обогатительными, дающими возможность размножаться широкому кругу микробов, так и праймеры, определяющие специфичность ПЦР, могут быть строго видоспецифичными или с их помощью можно выявить целые роды или семейства микроорганизмов. Но в то же время ПЦР имеет принципиальное преимущество перед культуральными методами. Диагностические потенции ПЦР не ограничены способностью микроба расти на искусственных средах или в культуре клеток. Поэтому основное преимущество ПЦР перед культуральными методами состоит не в высокой чувствительности ПЦР-метода (так как чувствительность этих методов сопоставима), а в способности идентифицировать и определять свойства тех микроорганизмов, которых не удается по тем или иным причинам размножать в лабораторных условиях. Здесь уместно отметить, что идентификационные тест-системы, основанные на ПЦР, разрабатываются для микроорганизмов с известными к данному моменту последовательностями ДНК в интересующих генах. Наивысшая чувствительность ПЦР обычно достигается при работе с чистой культурой микроба или, что еще лучше, с очищенной нуклеиновой кислотой. Эта чувствительность автоматически не трансформируется в чувствительность метода при работе с клиническим материалом. На успех определения при работе с этим материалом влияют такие факторы, как методика приготовления образца, возможное присутствие ингибитора фермента, осуществляющего амплификацию, объем образца при низких концентрациях тестируемых молекул. Наибольшее внимание среди этих методов привлекает полимеразная цепная реакция (ПЦР) в основе которой лежит многократное повторение циклов удвоения (амплификация) специфического участка нуклеотидной последовательности. Главное достоинство метода - очень высокая чувствительность: в результате амплификации концентрация специфической олигонуклеотидной последовательности в реакционной пробе возрастает в десятки миллионов раз. За последние 10 лет достигнут значительный прогресс в изучении молекулярной основы наследственных болезней и в их диагностике с помощью молекулярного анализа ДНК. В первую очередь это относится к болезням, которые вызваны мутацией в одном гене (моногенным). Каждый год увеличивается список наследственных болезней, которые могут быть выявлены методами анализа последовательности нуклеиновых оснований хромосомной ДНК. Появилась возможность с помощью исследования образцов ДНК поставить диагноз наследственного заболевания еще до появления клинических симптомов или в пренатальный период. Это позволяет выявить носителей мутантного гена при аутосомнорецессивных болезнях, а также распознать фенотипически сходные, но генетически различные заболевания. В настоящее время расширяется сфера применения этих методов. Помимо диагностики болезней с установленным типом наследования, они начинают использоваться для изучения и мультифакториальных заболеваний (коронарная болезнь сердца, сахарный диабет, опухоли и др.), а также для идентификации личности, установления отцовства и др.

Схема 1. Схема ПЦР-анализа

Особую диагностическую ценность ДНК-анализ приобретает при тех наследственных болезнях, при которых неизвестен биохимический дефект, лежащий в их основе, и которые поэтому не могут быть выявлены традиционными методами лабораторной диагностики. Кроме того, этот метод практически незаменим в тех случаях, когда патологический ген оказывает свое действие только в тканях, которые недоступны для исследования (мозг, печень). Ключом к расширению клинического применения достижений современной молекулярной генетики являются не только разработка методов рекомбинантной ДНК, но и значительное упрощение технологии проведения ДНК-анализа, повышение чувствительности, быстроты и надежности методов с их последующей автоматизацией. Остановимся теперь более подробно на основных этапах технологии анализа. Получение и хранение ДНК. Геномную ДНК выделяют с помощью многоступенчатых методов из тканей, содержащих ядерные клетки, в том числе из лимфоцитов периферической крови, лимфобластоидных клеточных линий, а также из амниоцитов и ворсин хориона плода, полученных путем биопсии. Кровь для исследования берут в количестве около 10 мл с антикоагулянтом: цитратом, глюкозоцитратным раствором (глюгициром) или ЭДТА. В большинстве лабораторий ДНК выделяют из взятых образцов в тот же день, но их можно и хранить при температуре —20°С. Первым этапом анализа ДНК является ее экстракция из тканей по стандартному методу. Клетки крови (или ворсин хориона) гемолизируют, обрабатывают протеиназой в течение ночи для расщепления белков, экстрагируют сопутствующие вещества фенолом и хлороформом и осаждают нуклеиновые кислоты этанолом. Методы экстракции ДНК постоянно совершенствуются, разрабатываются различные модификации, направленные на ускорение и повышение эффективности методов, а также использование менее вредных для исследователя реактивов. Количество и чистота препарата ДНК оцениваются спектрофотометрически. Экстрагированная ДНК стабильна и может храниться неопределенно долгое время. Это имеет большое значение, так как образцы от людей с генетическими заболеваниями могут быть собраны и сохранены для будущих сопоставлений при обследовании других членов семьи, а также для проведения повторных исследований после получения ДНК- проб нового поколения. Обычно образцы ДНК дублируются и хранятся раздельно в двух морозильниках. Хранение ДНК обеспечивает возможность ДНК-диагностики в семьях, в которых пожилые или страдавшие наследственными заболеваниями родственники умерли до того, как стало возможным предсказательное тестирование. В случаях, когда пораженные родственники уже умерли и ДНК лейкоцитов недоступна для анализа, оказалось возможным использовать замороженную ткань мозга, взятую на аутопсии. Для радиоизотопного анализа по Саузерну обычно требуется 5—10 мкг геномной ДНК, что составляет около 2-10 –18 мол. Такое количество ДНК присутствует приблизительно в 10 6 ядерных клеток, которые могут быть выделены менее чем из 1 мл крови, а в случае пренатальной диагностики — из биоптата ворсин хориона или из амниоцитов. Еще меньшее, крайне незначительное количество ДНК необходимо в тех случаях, когда анализу предшествует амплификация (умножение) участка ДНК-мишени с помощью недавно разработанного метода, использующего повторные циклы полимеразной цепной реакции (ПЦР).

В настоящее время используется несколько способов подготовки образца для проведения ПЦР. Процедура подготовки пробы включает лизис микроба и экстракцию нуклеиновой кислоты. С целью разрушения микробной клетки используют простое кипячение, замораживание—оттаивание в присутствии лизоцима, а также специальные лизирующие буферы, содержащие детергенты и протеиназу. Выбор метода, как правило, диктуется природой микроба, а точнее природой его клеточной стенки. Для экстракции ДНК используют два основных метода. Во-первых, классическую процедуру фенольно-хлороформной экстракции. При этом достигается хорошая очистка ДНК и в первую очередь от ингибиторов Таq-полимеразы, но неизбежны большие потери нуклеиновой кислоты, особенно заметные при работе с образцами небольшого объема с низкой концентрацией инфекционного агента. Другой способ, применяемый для очистки нуклеиновой кислоты, основан на использовании нуклеосорбентов. Подготовка материала с применением нуклеосорбента занимает меньше времени и более проста в исполнении, хотя не всегда может гарантировать удаление возможных ингибиторов. Зная возможности и преимущества этого метода, сформулируем те направления исследований в инфекционной патологии, в решении которых ПЦР начинает играть ведущую роль: — диагностика хронических инфекционных состояний, обусловленных персистенцией бактерий или вирусов, — наиболее очевидная область применения ПЦР в диагностических целях; — ПЦР — незаменимый инструмент при идентификации и молекулярно- генетических исследованиях практически всех внутриклеточных и мембранных паразитов, таких как вирусы, риккетсии, хламидии, микоплазмы; — ПЦР является наиболее эффективным способом выявления и изучения возбудителей сапронозов, которые, находясь во внешней среде в "некультивируемом" состоянии, способны там сохраняться, переживая неблагоприятные внешние условия в межэпидемические периоды; — ПЦР позволяет проводить определение антибиотикорезистентности у мед- ленно растущих и труднокультивируемых бактерий; — технология ПЦР коренным образом изменила способы маркирования штаммов для целей эпидемиологического анализа, тем самым расширив его возможности. Теперь обратимся к конкретным примерам, которые показывают, как технология ПЦР позволяет решать перечисленные выше задачи. На настоящий момент преимущество ПЦР-анализа перед "золотым стандартом" (так красиво называют культуральный метод выявления бактерий и вирусов) состоит в следующем: 1) более высокая частота обнаружения микроба, превышающая культуральный метод на 6— 7%. Эти различия объясняются возможной гибелью микроба при хранении и транспортировке, тогда как ПЦР способна обнаруживать и нежизнеспособные формы микроорганизма; 2) время, необходимое для обнаружения микроба культуральным методом, составляет около 4-6 сут., тогда как при использовании ПЦР через 4—5 ч; 3) использование технологии ПЦР позволяет проводить определение инфекционного агента в образцах, взятых неинвазивным путем. Одной из наиболее интересных сфер приложения ПЦР в эпидемиологии является использование этой технологии для мониторинга объектов внешней среды. Помимо решения чисто прикладных задач (усовершенствование методик обнаружения возбудителей в пробах воды, почвы и т. д.) в этой области, ПЦР является важным инструментом для получения фундаментальной информации о способах поддержания жизнеспособности микроорганизмов вне связи с организмом животного или человека. За последние 5—7 лет накоплен достаточно обширный материал, свидетельствующий о способности многих видов патогенных бактерий переходить в так называемое некультивируемое состояние. Формирование некультивируемых форм бактерий сопровождается глубокими перестройками метаболизма и изменением морфологии бактериальной клетки. В результате клетки бактерий, сохраняя жизнеспособность, перестают делиться и, будучи перенесены на плотную питательную среду, не формируют колоний. Однако переход в некультивируемое состояние не является необратимым, и под воздействием изменяющихся условий внешней среды некультивируемые клетки бактерий могут восстанавливать способность к пролиферации.46 Очевидно, что некультивируемые формы бактерий нельзя выявить традиционными микробиологическими приемами, включающими посевы из исследуемых образцов на плотные питательные среды. Микроскопия с использованием витальных красителей в данном случае может служить лишь инструментом изучения формирования некультивируемых форм в лабораторном эксперименте. Показано, что переходить в некультивируемое состояние могут возбудители многих заболеваний человека. Переход в некультивируемое состояние представляет собой способ поддержания жизнеспособности в неоптимальных для активного роста условиях. Эта способность обнаруживается в первую очередь у патогенных бактерий—сапрофитов. Диагностика заболеваний, вызванных многими из подобных инфекционных агентов, успешно обеспечивается традиционными методами. Однако единственным в настоящее время методическим подходом, способным доказать присутствие в образце некультивируемых форм возбудителя, является ПЦР. При использовании такого подхода продемонстрировано, что эндемичность ряда природных очагов объясняется способностью возбудителей сапронозов сохраняться в объектах внешней среды в некультивируемом состоянии. Это положение, по нашему мнению, чрезвычайно важно для всей системы эпизоотоологического надзора, так как дает возможность, используя технологию ПЦР, выявлять потенциально опасные штаммы возбудителей сапронозов раньше, чем они попали в человеческую популяцию и вызвали эпидемиологическое осложнение. Большое значение приобретает метод ПЦР при контроле продуктов питания. Таким образом, технология ПЦР является мощным инструментом, обеспечивающим возможность фундаментального изучения хронических инфекционных процессов и экологии возбудителей инфекционных заболеваний.

Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций подразделяются на несколько больших групп.

- Прямые методы, состоящие в выявлении непосредственно в биологическом материале самого вируса или антител к нему.

- Непрямые методы-заключаются в искусственной наработке вируса в значительных количествах, и его дальнейшем анализе.

К наиболее актуальным в повседневной практике методам диагностики относятся:

Серологические методы диагностики - выявление в сыворотке крови пациента определенных антител или антигенов в результате реакции антиген-антитело(АГ-АТ). То есть, при поиске у пациента определенного антигена используется соответствующее искусственно синтезированное антитело, и, соответственно, наоборот-при выявлении антител используют синтезированные антигены.

Реакция иммунофлуоресценции (РИФ)

Основана на использовании меченых красителями антител. При наличии вирусного антигена он связывается с мечеными антителами, и под микроскопом наблюдается специфическая окраска, которая говорит о положительном результате. При этом методе, к сожалению, невозможна количественная интерпретация результата, а только лишь качественная.

Возможность количественного определения дает иммуноферментный анализ(ИФА). Он похож на РИФ, однако в качестве маркеров используют не красители, а ферменты, превращающие бесцветные субстраты в окрашенные продукты, что и дает возможность количественной оценки содержания как антигенов, так и антител.

- Отмывают не связавшиеся антитела и антигены.

- Добавляют бесцветный субстрат, и в лунках с антигеном, который мы определяем, произойдет окрашивание, т.к. там будет связанный с антигеном фермент, после чего на специальном приборе оценивают интенсивность свечения окрашенного продукта.

По похожей схеме происходит и выявление антител.

Реакция непрямой(пассивной) гемаглютинации (РПГА).

Метод основан на способности вирусов связывать эритроциты. В норме эритроциты падают на дно планшета, образуя так называемую пуговку. Однако если в исследуемом биологическом материале находится вирус, он свяжет эритроциты в так называемый зонтик, который не упадет на дно лунки.

Теперь остановимся на методах диагностики непосредственно нуклеиновых кислот исследуемых вирусов, и прежде всего о ПЦР ( Полимеразная Цепная Реакция) .

Суть этого метода заключается в обнаружении специфического фрагмента ДНК или РНК вируса путём его многократного копирования в искусственных условиях. ПЦР можно проводить только с ДНК, то есть для РНК-вирусов предварительно необходимо произвести реакцию обратной транскрипции.

Непосредственно ПЦР проводят в специальном приборе, под названием амплификатор, или термоциклер, который поддерживает необходимый температурный режим. ПЦР-смесь состоит из добавленной ДНК, которая содержит интересующий нас фрагмент, праймеров (короткий фрагмент нуклеиновой кислоты, комплиментарный ДНК-мишени, служит затравкой для синтеза комплиментарной цепи), ДНК-полимеразы и нуклеотидов.

Стадии цикла ПЦР:

- Деннатурация-первая стадия. Температура повышается до 95 градусов, цепочки ДНК расходятся друг относительно друга.

- Отжиг праймеров. Температуру понижают до 50-60 градусов. Праймеры находят комплиментарный участок цепи и связываются с ним.

- Синтез. Температуру вновь повышают до 72, это рабочая температура для ДНК-полимеразы, которая, отталкиваясь от праймеров, строит дочерние цепи.

Цикл многократно повторяется. Через 40 циклов из одной молекулы ДНК получается 10*12 степени копий копий искомого фрагмента.

При проведении ПЦР в режиме реального времени синтезируемые копии фрагмента ДНК метятся красителем. Прибор регистрирует интенсивность свечения и по ходу реакции строит графики накопления искомого фрагмента.

Современные методы лабораторной диагностики с высокой достоверностью позволяют выявить присутствие вируса - возбудителя в организме, нередко, задолго до появления первых симптомов заболевания.