Характеристика клещевого энцефалита сибирского подтипа заусаев

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Ткачев Сергей Евгеньевич, Боргояков Вячеслав Юрьевич, Ливанова Наталья Николаевна, Панов Виктор Васильевич

Проведено выявление РНК вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) и генотипирование положительных образцов из клещей рода Ixodes, собранных на территории лесопарковой зоны Новосибирского научного центра и прилегающих территорий в 2007-2010 гг. Показано, что на указанных территориях выявляется преимущественно сибирский (подтипы Заусаев, Васильченко и подтип, неописанный ранее) генотип и, в единичных случаях, дальневосточный и западноевропейский генетические типы ВКЭ.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Ткачев Сергей Евгеньевич, Боргояков Вячеслав Юрьевич, Ливанова Наталья Николаевна, Панов Виктор Васильевич

The occurrence of tick-borne encephalitis virus genotypes and subgenotypes on the territory of Novosibirsk scientific center

TBEV RNA detection and positive samples genotyping were performed for Ixodes family ticks on the territory of Novosibirsk scientific center and its suburbs in 2007-2010. It was shown that Siberian genotype (with three subgenotypes) was mainly revealed on these territories and in single cases Far-Eastern and Western genotypes were found.

том, что у детей с общеинфекционным синдромом ИКБ наблюдается увеличение концентрации 1Ъ-1 Яа [1]. В настоящей работе также выявлена статистически значимо более высокая концентрация 1Ъ-1 Яа в группе больных с безэритемной формой ИКБ относительно больных с эритемной формой (табл. 1).

Таким образом, в общей группе больных ИКБ отмечено преобладание провоспалительных цитокинов (1Ь-6, у-ИНФ, а-ФНО) над противовоспалительными (1Ъ-10, 1Ъ-4, 1Ъ-1 Яа). На ранней стадии развития ИКБ, предшествующей появлению специфических анти-боррелиозных антител, наблюдается пониженная концентрация противовоспалительных цитокинов 1Ъ-4 и 1Ъ-10, тогда как увеличение их концентрации ассоциировано с развитием высокого уровня специфических антител.

В общей группе больных с диагнозом ИКБ выявлено статистически значимое увеличение концентрации цирДНК плазмы и скп-цирДНК по сравнению со здоровыми лицами (табл. 1). Показано статистически значимо увеличение концентрации как скп-цирДНК, так и уровня цирДНК плазмы крови у больных с без-эритемной формой ИКБ по сравнению с эритемной формой ИКБ, что говорит об ассоциации увеличения

цирДНК с отсутствием неспецифической воспалительной реакции местного характера. Обнаружено, что среднее значение концентрации скп-цирДНК в группе больных с ИКБ, имеющих специфические антитела к АГ боррелий (п=29), существенно превышает значение концентрации у больных без выявленных антител (п=32) (р Не можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Следует отметить, что деление вируса на генетические типы с привязкой к географическому месту выделения изолятов и штаммов ВКЭ является условным, так как в различных регионах встречаются различные генетические типы ВКЭ, причем в одном и том же регионе возможно выявление нескольких генотипов вируса, как, например, на территории Западной Сибири [3,11,17].

Целью данной работы являлось исследование генетического разнообразия ВКЭ в образцах индивидуальных иксодовых клещей, собранных на территории лесопарковой зоны Новосибирского научного центра СО РАН (ННЦ СО РАН).

Материалы и методы

Сбор образцов. Голодных имаго клещей рода Ixodes собирали флагированием с растительности в природном очаге лесопарковой зоны Новосибирского научного центра в эпидемиологические сезоны 2007-2010 гг. Также проводили сбор образцов клещей с людей, обращающихся по поводу укуса в Пункт вакцинопро-филактики ЦКБ СО РАН и Центра новых медицинских технологий в эпидсезоны 2009-2010 гг.

Обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция. Получение кДНК, соответствующих фрагментам

генома ВКЭ, проводили методом обратной транскрипции (ОТ) с применением наборов “РевертаП’ в соответствии с инструкциями изготовителя (“АмплиСенс”, ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ). В качестве матрицы использовали образцы суммарных нуклеиновых кислот, выделенных из клещей. Двухраундовую полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с праймерами, соответствующими 3’-концу гена Е (позиции 2199-2219 и 2214-2238 н.о.) и 5’-концу гена NS1 (позиции 2402-2424 и 2517-2539 н.о.) ВКЭ.

Определение нуклеотидных последовательностей и молекулярно-генетический анализ. Определение нуклеотидных последовательностей продуктов ПЦР, соответствующих фрагментам генома ВКЭ, проводили с помощью наборов BigDye Terminators Cycle Sequencing Kit v.3.1 (Applied Biosystems, США) с применением автоматического анализатора ДНК модели ABI 310 (Applied Biosystems, США) в Центре секвенирования ДНК СО РАН. Выравнивание полученных последовательностей осуществляли с использованием программы ClustalW [15]. Поиск гомологии полученных нуклеотидных последовательностей с уже известными последовательностями фрагментов геномов ВКЭ проводили с помощью программы BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ blast/). Для сравнения использовали последовательности генов E и NS1 штаммов ВКЭ, относящихся к различным генетическим типам, из базы данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html). Филогенетический анализ проводили с помощью программы MEGA 5 [14,16]. Оценку достоверности построенных филогенетических деревьев осуществяли с помощью бутстрэп-анализа, индекс, которого был посчитан при общем числе повторов 1000.

Результаты и обсуждение

Было проведено выявление вирусных РНК и гено-типирование положительных образцов из индивидуальных клещей рода Ixodes, собранных либо флагиро-ванием в 2007-2010 гг., либо с людей, обратившихся по поводу укуса в Пункт вакцинопрофилактики ЦКБ СО РАН и ЦНМТ в 2009-2010 гг., на территории лесопарковой зоны Академгородка и прилегающих территорий.

Положительные по ВКЭ образцы выявляли методом двухраундовой ПЦР с праймерами, соответствующими фрагментам генов E-NS1, причем вирус обнаруживали как в самках, так и самцах иксодовых клещей. Затем, для ряда образцов, выделенных на различных территориях, были определены нуклеотидные последовательности ПЦР-фрагментов длиной 341 п.н.:

1) Ботанический сад, окрестности ННЦ, смешанный березово-осиновый лес: Акад2007-м11а; Акад2007-м11г;

О Акад2007-ж37 О Акад2007-ж106 О Акад2007-м11а О Акад200Э-в70 О Акад2007-ж105 О Акад2007-м47г О Акад2007-м11г О Акад2007-м47а О Акад2007-м28

Й1486 О Акад2009-487 О Акад2010-к27 1226

О Алтай2009-27 Заусаев О Акад2010-к19 в Алтай2009-15 О Акад2010-кЗ

• НОВ2010-7/152 О Акад2009-в74

• Нов2010-5/688 О Акад2009-в291 г О Акад2009-в291а О Акад2009-в43

• НОВ2010-5/1338 О Акад2008-мЗЗ

• НОВ2010-5/189 О Акад2009-518 1061

О Акад2008-м102 990

• НОВ2010-5/64 О Акад2008-м59

• НОВ2009-38 О Акад2009-в265 1700 1675

О Акад2009-432и О Акад2009-430 О Акад2010-к35 О Акад2009-в8 О Акад2009-432г О Акад2009-524 О Акад2008-м90а Софьин О Акад2007-ж28 О Акад2008-м90г О Акад2010-к32 Найдорф вирус ОГЛ

0.24 0.22 0.20 0.18 0.16 0.14 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00

СИБ - сибирский генотип ВКЭ; ДВ - дальнвосточный генотип ВКЭ; ЗАП - западноевропейский генотип ВКЭ. I - подтип Васильченко; II - подтип Заусаев; III - подтип, неописанный ранее.

Белым кругом отмечены образцы ВКЭ из индивидуальных клещей, собранных флаги-рованием; черным кругом отмечены образцы ВКЭ из индивидуальных клещей, собранных после покусов людей. Жирным выделены прототипные штаммы и внешняя группа - вирус омской геморрагической лихорадки (ОГЛ).

Рис. 1. Дендрограмма, построенная на основании нуклеотидных последовательностей фрагментов генов Е и N81 ВКЭ методом иРОМЛ.

Акад2007-м28; Акад2007-м33; Акад2007-м47а; Акад2007-м47г; Акад2008-ж305; Акад2008-м59; Акад2008-м102;

Акад2008-м90а; Акад2008-м90г; Акад2009-487; Акад2009-518; Акад2009-524; Акад2010-к3; Акад2010-к19;

Акад2010-к27; Акад2010-к32; Акад2010-к35;

2) Пойма реки Шадриха, 8 км к юго-востоку от ННЦ, сосновый лес: Акад2009-430; Акад2009-432т; Акад2009-432ц;

3) Смешанный березово-осиновый лес за Институтом Катализа СО РАН, окрестности ННЦ: Акад2007-ж28;

Акад2007-ж37; Акад2007-ж105; Акад2007-ж106;

4) Новосибирский район, окрестности села Жеребцово, 25 км к северо-востоку от ННЦ, смешанный березово-осиновый лес: Акад2009-в265; Акад2009-в291а; Акад2009-в291г;

5) Тогучинский район, окрест-

ности села Усть-Каменка, 53 км к северо-востоку от ННЦ, смешанный березово-осиновый лес: Акад2009-в8; Акад2009-в9; Акад2009-в43;

6) Садовое общество “Ключи”: Акад2010-5/1227;

7) Шлюзы: Нов2010-5/1338;

8) Матвеевка: Нов2010-5/189;

9) Садовые общества в Верхней Зоне ННЦ: Акад2009-109а, Акад2009-109г;

10) г. Искитим: Нов2009-38;

11) пос. Краснообск: Нов2009-29;

12) г. Бердск: Нов2009-41.

Анализ последовательностей, соответствующих вариантам вируса, выявленным в индивидуальных клещах, показал доминирование ВКЭ, относящихся к сибирскому генетическому типу с уровнем гомологии 89-98% последовательностям прототипных штаммов Васильченко и Заусаев на территории ННЦ; также, сибирский генотип выявлялся в иксодовых клещах, собранных с людей после укуса в окрестностях города Новосибирска.

Далее проводили филогенетический анализ полученных последовательностей. Для сравнения были использованы нуклеотидные последовательности данного фрагмента генома для ряда штаммов ВКЭ, исследованных ранее, выделенных методом биопробы на указанной территории в 1981-2001 гг. (штаммы 990 (номер 1Ы542607 в базе данных ОепВапк),

1043 ^N542610), 1061 ^N542614),

1128 ^N542619), 1226 (Щ542627),

1259 ^N542629), 1486 (Щ542640),

1627 ^N542652), 1675 ^N542656), 1700 ^N542660), относящиеся к различным подтипам сибирского генотипа ВКЭ) [7,8]. Методом иРОМЛ было показано, что исследуемые варианты ВКЭ, относящиеся к сибирскому генотипу, разделяются на 3 подтипа - подтипы Васильченко (I) , Заусаев (II) и подтип, неописанный ранее (III) (рис. 1), что было описано ранее и для коллекции штаммов ВКЭ, собранных на территории ННЦ в 1981-2011 гг. [7,8]. Также, два образца ВКЭ, выявленные в индивидуальных иксодовых клещах с территории лесопарковой зоны Новосибирского научного центра, относились к дальневосточному генотипу и один - к западноевропейскому. Ранее нами было показано, что в крови больных, госпитализированных после укусов клещами с различными формами клещевого энцефалита, несмотря на доминирование сибирского генотипа в клещах, выявлялся дальневосточный генотип ВКЭ [18], что, вероятно, может быть связано с особенностями патогенеза различных вирусных вариантов.

Интересен факт единичного обнаружения за последние несколько лет западноевропейского генотипа ВКЭ на территории Академгородка. Ранее данный генотип в Западной Сибири был найден на территории Алтая [9], и, по всей видимости, может встречаться и на других территориях, либо заноситься на них в силу активного перемещения населения в результате туристической деятельности.

^ подтип Заусаев ^ подтип Васильченко 0 подтип, неописанный ранее

Рис. 2. Встречаемость различных генотипов и подтипов ВКЭ на территории Новосибирского научного центра и его окрестностях.

Таким образом, с учетом места сбора выявленных положительных генотипированных образцов ВКЭ, была построена схема встречаемости различных генотипов ВКЭ на территории Новосибирского научного центра и его окрестностях (рис. 2).

1. Демина Т.В., Джиоев Ю.П., Верхозина М.М. и др. Генетическая вариабельность и генотипирование вируса клещевого энцефалита с помощью дезоксиолигонуклеотид-ных зондов // Вопросы вирусологии. - 2009. - Т. 54. №3. -С.33-42.

2. Демина Т.В., Джиоев Ю.П., Верхозина М.М. и др. Молекулярная эпидемиология вируса клещевого энцефалита географическая вариабельность, определяемая методом молекулярной гибридизации // Эпидемиология и вакцино-профилактика. - 2009. - Т. 46. №3. - С.27-39.

3. Злобин В.И., Беликов С.И., Джиоев Ю.П. и др. Молекулярная эпидемиология клещевого энцефалита. -Иркутск: РИО ВСНЦ СО РАМН, 2003. - 272 с.

4. Злобин В.И., Демина Т.В., Беликов С.И. и др. Генетическое типирование штаммов вируса клещевого энцефалита на основе анализа уровней гомологии фрагмента гена белка оболочки // Вопросы вирусологии. - 2001. - Т. 46. №1. - С.17-22.

5. Львов Д.К. Медицинская вирусология: руководство. -М.: МИА, 2008. - 656 с.

6. Погодина В.В., Бочкова Н.Г., КараньЛ.С. и др. Сибирский и дальневосточный подтипы вируса клещевого энцефалита в европейских и азиатских регионах России: генетическая и

антигенная характеристика штаммов // Вопросы вирусологии. - 2004. - Т. 49. №4.

7. Ткачев С.Е., Бахвалова В.В., Панов В.В. и др. Исследование генетической структуры популяции вируса клещевого энцефалита, выявляемого на территории лесопарковой зоны Новосибирского научного центра: Инфекции, передаваемые клещами в Сибирском регионе. Вып. 30 серии “Интеграционные проекты СО РАН” / Под ред. В.В. Власова, В.Е. Репина.

- Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2011. -395 с.

8. Ткачев С.Е., Панов В.В., Бахвалова

B.Н. Исследования генетического разнообразия вируса клещевого энцефалита в районе г. Новосибирска // Журнал инфекционной патологии. - 2010. - Т. 17. №3. -

9. Demina T.V., Dzhioev Y.P., Verkhozina M.M., et al. Genotyping and characterization of the geographical distribution of tick-borne encephalitis virus variants with a set of molecular probes // J. Med. Virol. - 2010. -Vol. 82. №6. - P965-976.

10. Ecker M., Allison S.L., Meixner T., Heinz F.X. Sequence analysis and genetic classification of TBEV from Europe and Asia // J. Gen. Virol. - 1999. - Vol. 80. - P179-185.

11. Gritsun T.S., Frolova T.V., Zhankov A.I., et al. Characterization of a siberian virus isolated from a patient with progressive

chronic tick-borne encephalitis // Journal of Virology. - 2003. -Vol. 77. №1. - P25-36.

12. Hayasaka D., Ivanov L., Leonova G.N., et al. Distribution and characterization of tick-borne encephalitis viruses from Siberia and far-eastern Asia // J. Gen. Virol. - 2001. - Vol. 82. -P1319-1328.

13. Hayasaka D., Suzuki Y., Kariva H., et al. Phylogenetic and virulence analysis of tick-borne encephalitis viruses from Japan and far-eastern Russia // J. Gen. Virol. - 1999. - Vol. 80. - P3127-3135.

14. Kumar S., Tamura K., Nei M. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment // Briefings in Bioinformatics. - 2004. - №5. - P.150-163.

15. Larkin M.A., Blackshields G., Brown N.P., et al. Clustal W and Clustal X version 2.0 // Bioinformatics. - 2007. - Vol. 23. -P.2947-2948.

16. Tamura K., Peterson D., Peterson N., et al. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods // Molecular Biology and Evolution. - 2011. - Vol. 28. №10. - P2731-2739.

[youtube.player]

Аннотация научной статьи по ветеринарным наукам, автор научной работы — Андаев Е. И., Беликов С. И., Кулакова Н. В., Борисова Т. И., Сидорова Е. А.

Похожие темы научных работ по ветеринарным наукам , автор научной работы — Андаев Е. И., Беликов С. И., Кулакова Н. В., Борисова Т. И., Сидорова Е. А.

Characterization of a Tick-Borne Encephalitis Virus of the Siberian Subtype Strain Isolated from a Patient with Chronic Disease

Характеристика штамма вируса клещевого энцефалита сибирского подтипа, изолированного от пациента с прогредиентным течением болезни

Е.И. Андаев1 ([email protected]), С.И. Беликов2 ([email protected]), Н.В. Кулакова2 ([email protected]), Т.И. Борисова1, Е.А. Сидорова1 ([email protected])

Вирулентность штамма для беспородных белых мышей массой 6 - 8 г составила при внутримозговом заражении 8,95 lg ЛД^/мл, при подкожном - 6,24 lgЛД5/мл, индекс инвазивности - 2,71. Титр вируса на пятые сутки культивирования составил 106,25 ЦПД5/мл. В культуре клеток СПЭВ под агаровым покрытием вирус образует бляшки размером от 2 до 3 мм на пятые сутки. Ключевые слова: вирус клещевого энцефалита, сибирский подтип вируса, прогредиентное течение болезни, полногеномное секвенирование

characterization of a Tick-Borne Encephalitis Virus of the Siberian Subtype Strain Isolated from a patient with chronic Disease

E.I. Andaev1 ([email protected]), S.I. Belikov2 ([email protected]), N.V. Kulakova2 ([email protected]), T.I. Borisova1, E.A. Sidorova1 ([email protected])

The strain virulence for outbred white mice in weight 6 - 8 g was 8.95 lg LD50/ml by intrabrain infection and 6.24 lg LD5/ml by subcutaneous injection, the invasiveness index was 2.71. A virus titer at the 5 day of cultivation was 106 25 CPE5/ml. The virus formed plaques in size from 2 to 3 mm at the 5 day in cell culture of a pig fetus kidney under agar covering. Key words: tick-borne encephalitis virus, siberian subtype, progredient course of a disease, whole genome sequencing

Введение спинного мозга, периферическую нервную систему.

Клещевой энцефалит (КЭ) - природно-очаго- Распространен в лесной и лесостепной умеренной

вая вирусная инфекция, поражающая централь- климатической зоне на большей части Евразийско-

ную нервную систему (ЦНС) - отделы головного и го континента и характеризуется весенне-летней

сезонной активностью. По современным представлениям, вирус КЭ (ВКЭ) включает три подтипа -дальневосточный, европейский и сибирский. Установлена преимущественная циркуляция каждого подтипа: дальневосточного - на Дальнем Востоке, европейского - в европейской части страны, в Центральной, Западной, Восточной и Северной Европе, сибирского - на Урале и в Сибири [1, 2].

Длительное время наиболее тяжелые поражения ЦНС с развитием очаговых форм и летальностью связывали с дальневосточным, а заболевания, которые отличаются доброкачественным течением и единичными очаговыми формами, - с европейским или сибирским подтипами вируса [3 - 5]. В последние годы изменилось представление о патогенно-сти сибирского подтипа ВКЭ в связи с его способностью вызывать очаговые летальные формы КЭ на европейской и азиатской территории России, а в отдельных случаях - у многократно вакцинированных пациентов [6]. Исходя из ведущего симптома, выделяют три основные клинические формы болезни: лихорадочную, менингеальную и очаговую менинго-энцефалитическую [7, 8]. Многие исследователи отмечают рост числа больных с лихорадочной формой при уменьшении числа менингеальных и очаговых форм болезни [8, 9]. С другой стороны, на Южном Урале в течение 11 лет наблюдается рост удельного веса тяжелых клинических форм КЭ, рост очаговых форм [9]. Несмотря на способность ВКЭ к перси-стенции в организме, чаще прогредиентное течение КЭ наблюдается у пациентов в Сибири и на Дальнем Востоке России [10, 11].

Цель настоящей работы - изучение биологических свойств и расшифровка полной нуклеотид-ной последовательности кодирующей области генома штамма вируса КЭ, выделенного от больного с прогредиентным течением КЭ.

Материалы и методы

Для изоляции ВКЭ использовали клинический материал - кровь от пациента С. с лихорадочной формой клещевого энцефалита с двухволновым течением, наблюдавшегося в Иркутской областной инфекционной клинической больнице.

Вирусологические исследования проведены в Иркутском научно-исследовательском противочумном институте Сибири и Дальнего Востока.

Для последующих пассажей и дальнейших вирусологических и молекулярно-биологических исследований использовали 10%-ную суспензию

головного мозга заболевших мышей и вируссо-держащую культуральную жидкость. Клетки СПЭВ заражали вируссодержащей культуральной жидкостью с целью выявления цитопатического действия (ЦПД) и идентификации ВКЭ в зараженных клетках методом непрямой иммунофлюоресценции (НМФА), ИФА и ОТ-ПЦР в соответствии с Инструкцией изготовителя.

Титр вируса в lg ЦПД50/мл расчитывали по методу Рида и Менча (1938).

Гемагглютинирующую активность вируса в культуральной жидкости исследовали в реакция гемаг-глютинации (РГА) с эритроцитами гуся при рН 6,2.

Нейровирулентность выделенного штамма вируса изучали титрованием на беспородных белых мышах массой 6 - 8 г при заражении в мозг и под кожу (0,03 и 0,25 мл соответственно), определяя величину в lg ЛД50/мл. Нейроинвазивность оценивали по индексу инвазивности - разнице титров в lg ЛД50/мл при внутримозговом и подкожном заражениях.

Иммунотипирование штаммов проводили в реакции диффузной преципитации в агаре (РДПА)

Анализ нуклеотидных последовательностей. Последовательность генома штамма Irkutsk-12 получена на основе выравнивания нуклеотидных фрагментов при сравнении с референтным штаммом Vasilchenko в программе BioEdit V.7.0.5.3 [12] и депонирована в международную базу данных GenBank с номером доступа JN003209.

Вторичные структуры нетранслируемых регионов и построены с помощью программы RNAfold [13].

Филогенетический анализ. Реконструкция филогенетических отношений проведена на основе анализа кодирующей части генома. Кроме штаммов вируса КЭ сибирского подтипа (номера доступа GenBank приведены на рисунке 1) для реконструкции филогенетических отношений анализировали штаммы европейского (с номерами доступа в GenBank: U27495, GU183379 - GU183381, GU183383, U39292, GQ266392, DQ401140, FJ572210, AM600965, NC001672, HM535610) и дальневосточного (AY182009, JF819648,

JN229223, JN003205, HQ901366, HQ901367, JF316707, JF316708, Еи816450 - Еи816455, HQ201303, НМ859894, НМ859895, AY169390, GQ228395, GU121642, FJ997899, FJ906622, FJ402285, FJ402286, АВ062064) подтипов. Расчет филогенетических отношений и построение деревьев проводили с помощью метода Байеса с применением модели GTR + G + I.

Реконструкцию филогенетических отношений проводили на основе кодирующих нуклеотидных последовательностей 53 геномов вируса КЭ, в качестве аутгруппы включали вирус омской геморрагической лихорадки (АВ507800). Для анализа оценивали 100 000 генераций тете (марковские цепи Монте-Карло).

Результаты и обсуждение

Из анамнеза установлено, что 16-летний юноша С. заболел 5 июля 2010 года. Предъявлял жалобы на умеренную слабость, высокую температуру 38 оС, боли в мышцах. С его слов, присасывание клеща произошло 30 июня 2010 года во время пребывания в спортивном лагере в Тункинской долине, расположенной на эндемичной по КЭ территории Республики Бурятия. Клеща удалил сам (клеща на зараженность вирусом КЭ не исследовали), против КЭ не вакцинирован, иммуноглобулин не вводили. С 5 по 9 июля отмечено повышение температуры до 38 оС и легкие катаральные явления. Лечение симптоматическое. С 26 июля наблюдалась вторая волна повышения температуры до 39 оС. На протяжении

Филогенетическое положение штамма Irkutsk-12. Байесовское дерево построено на основе анализа кодирующей части генома с применением модели GTR+G+I

Примечание: жирным шрифтом обозначены основные субтипы ВКЭ. Исследуемый в работе штамм выделен жирным шрифтом и подчеркиванием. В узлах указаны апостериорные вероятности в процентах. Шкала соответствует количеству нуклеотидных замен.

пяти дней предъявлял жалобы на головные боли в лобно-височной области, тошноту, повторную рвоту. После приема жаропонижающих препаратов и антибиотиков температура снизилась, головные боли уменьшились. В крови методом ИФА выявлены иммуноглобулины G и М (4 августа 2010 г.). С 5 по 10 августа 2010 года находился на лечении в Иркутской областной инфекционной клинической больнице. Диагноз: клещевой энцефалит, двухвол-новое течение, лихорадочная форма средней степени тяжести. По объективным данным, состояние средней тяжести, очаговые и менингеальные симптомы отсутствовали.

В конце ноября 2010 года клинический материал от больного поступил в институт для вирусологического исследования.

Вирус КЭ выделен из крови больного на 143-й день с момента начала заболевания путем вну-тримозгового заражения двухсуточных беспородных белых мышей. На 4-е сутки у мышей извлекли головной мозг и использовали для последующего заражения мышей и культуры клеток СПЭВ. На первом пассаже на 5-е сутки после заражения у мышей наблюдали парезы задних конечностей. При последующем пассаже инкубационный период сократился до трех-четырех суток. Вирулентность штамма для беспородных белых мышей массой 6 - 8 г составила при внутримозговом заражении 8,95 ^ ЛД50/мл, при подкожном - 6,24 ^ ЛД50/мл, индекс инвазивности - 2,71. Гибель животных наблюдали на 4 - 12-е сутки при внутримозговом заражении и на 5 - 13-е - при подкожном. Изолированный патогенный агент идентифицирован в ИФА, в реакции непрямой иммунофлюоресценции и ОТ-ПЦР как вирус КЭ и назван ^кШзк-^.

Заражение культуры клеток СПЭВ на втором-третьем пассажных уровнях вызывало деструкцию клеточного монослоя. Титр вируса на 5-е сутки культивирования составил 106,25 ЦПД 50/мл. В НМФА на слайд-антигенах, приготовленных из зараженных клеток, с иммуноасцитической жидкостью к штамму Софьин в цитоплазме наблюдали яркое гранулярное свечение, характерное для антигенов ВКЭ.

В культуре клеток СПЭВ под агаровым покрытием вирус на 5-е сутки образовывал бляшки, размер которых варьировал от 2 до 3 мм.

Выделенный штамм агглютинировал эритроциты гуся при рН 6,2. Титр гемагглютинина в культу-ральной жидкости составил 1:32.

В результате анализа нуклеотидных последовательностей перекрывающихся фрагментов вирусного генома получена полноразмерная последовательность генома штамма, которая депонирована в базе данных GenBank с номером доступа JN003209. Размер генома составил 11 068 н.п. и незначительно превышал полноразмерную последовательность генома штамма Vasilchenko (L40361) длиной 10 927 н.п. Нетранслирующие регионы и фланкировали открытую рамку считывания полипротеина, а структура генома соответствовала структуре геномов других представителей ВКЭ. Сходство ну-клеотидных последовательностей кодирующих регионов штамма Irkutsk-12 со штаммом Vasilchenko составило 96,3%, тогда как сходство со штаммами Sofjin-HO (AB062064) и Neudoerfl (U27495) - 85,5 и 84,7% соответственно. Сходство НТР штаммов Irkutsk-12 и Vasilchenko составило 95,3%. В последовательности НТР было обнаружено шесть нуклеотидных замен по типу трансверсий.

Вторичная структура НТР для штаммов Irkutsk-12 и Vasilchenko была сходной. Структура

НТР штамма Irkutsk-12 была характерна для ВКЭ и содержала консервативные и вариабельный регионы. По сравнению со штаммом Vasilchenko штамм Irkutsk-12 содержал вставку длиной 183 н.п., локализующуюся в вариабельном регионе НТР. Ранее, в работе G. Wallner с соавт. [14], было показано, что структура НТР не зависит от таких параметров, как год изоляции, географическое и эволюционное происхождение штаммов и источник изоляции. Однако наибольшее сходство

НТР штамма Irkutsk-12 наблюдалось с географически и филогенетически близкими штаммами IR99 (Иркутская область) и Cht-22 (г. Чита), длина

НТР которых составила 730 н.п., а уровень гомологии нуклеотидных последовательностей - 94,2 - 98,9%.

Сравнение транслированных аминокислотных последовательностей штаммов позволило обнаружить 34 аминокислотных замены, по которым штамм Irkutsk-12 отличался от прототипного штамма Vasilchenko. Замены обнаружены во всех белках, кроме капсидного белка С (табл. 1).

Неконсервативные замены обнаружены в 14 сайтах. Наибольшее число мутаций отмечено в белке NS5, что, вероятно, связано с наибольшей протяженностью этого белка. Замены в белке Е, несущем главные антигенные детерминанты, локализованы на поверхности во II (позиции 81 и 279 относительно полипротеина штамма Vasilchenko) и III (позиция 349) доменах. Обнаруженные вариабельные сайты были распределены по всему полипротеину, за исключением белка С, однако функциональная роль отдельных мутаций остается неясной.

Филогенетический анализ байесовского дерева показал, что все штаммы формируют три отдельные клады, соответствующие европейскому, сибирскому и дальневосточному подтипам. Штамм Irkutsk-12 наиболее близко кластеризуется со

Сравнение транслированных аминокислотных последовательностей

Белки Позиция Штамм Vasilchenko Штамм Irkutsk-12

[youtube.player]

Наступила весна, журчат ручьи и поют птички. Хочется влюбиться, пойти на природу или начать дачный сезон. Красота, да и только! Но есть в бочке меда ложка дегтя - клещи. Я (равно как и вы) забыла о прививках, мои домочадцы остались без защиты.Поэтому спешу вам напомнить о клещах, болезнях и прививках. По статистике 70% читателей обращают внимание на начало и конец статьи, потому главное и очень важное смотрите здесь. Дальше будет интересно скептикам, оппонентам и любопытным.

Клещевой энцефалит - природно-очаговая вирусная инфекция, характеризующаяся поражением центральной нервной системы. Клещевой боррелиоз (болезнь Лайма) - природно-очаговое инфекционное полисистемное заболевание, поражающее нервную систему, опорно-двигательный аппарат и другие системы.

Проявления: лихорадка, выраженная головная боль и красное пятно на теле (для болезни Лайма).

Обе инфекции передаются через укус клеща. От клещевого энцефалита можно защититься вакциной (благо на сегодняшний день есть большой выбор), а от болезни Лайма нет. Необходимо помнить о правилах поведения после укуса:
1. Не трогать клеща. Обратиться в ближайший травмпункт, где удалят клеща, поставят иммуноглобулин. Если вы застрахованы - бесплатно или с вашим заранее купленным препаратом.
2. Если вы привиты от клещевого энцефалита, то можно не вводить иммуноглобулин.
3. Пропить антибиотики группы тетрациклина 10-14 дней (профилактика боррелиоза).
4. Отвезти в СЭС на улице Сопочной клеща для исследования на возбудителя.
5. Наблюдаться у инфекциониста.
6. Не забывайте о вакцинации.

В России наблюдается многократный рост заболеваемости клещевым энцефалитом. Об этом заявил сегодня главный государственный санитарный врач РФ Геннадий Онищенко, выступая на селекторном совещании с регионами по проблемам организации детского отдыха.

Природно-очаговые болезни – это четко очерченная группа заболеваний, характеризующихся специфическими чертами эпидемического процесса. Это болезни диких животных, возбудители которых обладают полипатогенностью и могут передаваться человеку, вызывая у него заболевание.

К настоящему времени не вызывает сомнения то, что на территории Красноярского края, как и всей Восточной Сибири, широко распространены очаги трансмиссивных иксодовых заболеваний, таких как клещевой энцефалит (КЭ), клещевой боррелиоз (КБ), клещевой риккетсиоз (КР). Следует отметить, что эпидемическая ситуация по основным трем инфекциям с каждым годом ухудшается. Стабильно высокие показатели заболеваемости КЭ, превышающие во много раз среднереспубликанские (4,0-4,5 на 100 тыс. населения 2000-2003 гг.) отмечаются в Томской, Кемеровской, Новосибирской, Иркутской областях, Красноярском и Алтайском краях.

В сохранении и распространении вируса КЭ в природе особая роль принадлежит клещам рода Ixodes: I. ricinus и persulcatus. На территории Сибири и Дальнего Востока заболевания КЭ экологически связаны с таежными клещами Ixodes persulcatus. Для КБ идентичен вектор передачи – иксодовые клещи. Нозоареал КР связан с клещами D. nuttalii, D. silvarum и Н. concinna . Нозоареалы КЭ и КБ, как правило, совпадают. Однако зона распространения КБ шире, чем ареал КЭ. В литературе приводятся данные о совпадении очагов КЭ и КР. Выявлена зараженность вирусом КЭ не только клещей I. persulcatus, но Н. concinna и D. Nuttali. Имеются данные об инфицировании R. sibirica клещей I. persulcatus в Новосибирской области и Алтайском крае. В ряде мест имеются сочетанные очаги трех инфекций. Совпадение нозоареала вирусных, риккетсиозных и бактериальных инфекций обусловливает инфицирование клещей одновременно различными возбудителями. Наличие смешанных инфекций в сочетанных очагах ведет к возникновению микст форм заболеваний КЭ и КБ. Зараженные боррелиями клещи менее восприимчивы к заражению высоковирулентными штаммами КЭ.

Репродукция вируса в клещах с боррелиями затруднена. При укусе микст-инфицированных клещей наблюдается более мягкое течение вирусной инфекции или отсутствие симптомов КЭ у больных боррелиозом. В этих случаях КЭ диагностируется серологически. Как самостоятельная нозологическая форма КЭ известен с 1937 года. В настоящее время КЭ регистрируется в 18 Европейских странах и 4 странах Азии. Заболевание в Европе протекает более мягко и уровень заболеваемости ниже. Одной из причин низкой заболеваемости в странах Европы является широкое использование вакцинопрофилактики.

Сегодня КЭ регистрируется на 46 административных территориях РФ, в том числе на 18 территориях Сибири и Дальнего Востока. На данный регион приходится более 60% от всех заболеваний КЭ в Российской Федерации. В многолетней динамике заболеваемости КЭ в РФ выделяют два периода подъема: 1952-1964 и 1984-1990 гг. На второй подъем приходится 39,9 % случаев КЭ за годы наблюдения. Наиболее высокие темпы роста регистрируются в регионах Западной и Восточной Сибири. В Восточной Сибири отмечено увеличение показателей заболеваемости от 2,4 на 100 тыс. населения в 1984 г. до 13,2 в 1994 г.; в Западной Сибири – от 8,7 до 12,1 соответственно. В 1989 и в 1994 гг. впервые за всю историю изучения КЭ уровень заболеваемости в Восточной Сибири превысил уровень в Западной Сибири, на Урале и на Дальнем Востоке. Особенно большой прирост клинически выраженных случаев КЭ зарегистрирован на большей части Сибири, что намного превышает этот показатель в среднем по России. Летальные исходы регистрировались в 18 субъектах РФ, и этот показатель колеблется по разным регионам от 0,3 до 23% от числа заболевших.

Известно, что границы ареала КЭ на евроазиатском континенте простираются от берегов Атлантического до Тихого океана, включая 8 очаговых регионов. Эпидсезон в данных очаговых регионах зависит от континентальности, климата из-за разобщенности на большой территории. Продолжительность эпидсезона очагов КЭ определяется периодом активности переносчиков. Так, по данным ряда исследователей в странах Европейского региона эпидемический сезон продолжается 6-7 мес (апрель-сентябрь-октябрь), в Сибирском регионе (Омской, Тюменской, Новосибирской, Иркутской областях, Республике Бурятия) – до 5 мес (апрель-август), в Свердловской, Читинской областях, Республике Тыва – до 4 мес (май-август), в Амурской области – до 3 мес (май-июль). Относительно эпидемиологической ситуации в отдельных природных очагах следует сказать, что на разных территориях имеет отличие как в уровне заболеваемости и смертности от КЭ, так и в преобладании того или иного вида возбудителя, численности клещей и т.д.

Анализ заболеваемости, по литературным данным, в природных очагах указанных инфекций показал, что в Омской области за весь период регистрации КЭ отмечено три подъема заболеваемости: 1953-1956, 1962-1965, 1984- 1995 гг. Нозоареал КЭ в Омской области совпадает с центральной частью Западно-Сибирской группы очаговых регионов и включает Ишимо-Иртышские и Васюганские очаговые регионы. Заболевание КЭ регистрируется на всех административных территориях Западно-Сибирского региона, но наиболее высокие показатели отмечаются в Томской, Новосибирской, Кемеровской области, Республика Алтай. В частности в Томской области в 1999-2000 гг. показатель заболеваемости КЭ составил 64,2 и 41,1 на 100. тыс. населения. В Омской области показатель заболеваемости (2,4-6,1 за последние 11 лет) не превышал среднефедеральный уровень, хотя в отдельных сельских районах (Тарском, Знаменском) достигал высокого уровня – 80,8 – 113,0 на 100 тыс. населения. Здесь, особенно в северных районах, отмечается возрастание вирусофорности иксодовых клещей в десятки раз (от 2,9 до 10,8%), что, несомненно, влияет на уровень заболеваемости. С 1990 г. в Новосибирской области также регистрируется подъем заболеваемости КЭ с пиком в 1995 г. и показателем 22,9 на 100 тыс. населения. В 1997 г. наблюдалась тенденция к снижению заболеваемости до 10,2 на 100 тыс. населения, но и этот показатель превышал республиканский более чем в 2 раза.

В Красноярском крае за 36-летний период наблюдения выраженное увеличение числа больных КЭ регистрировалось в 1984-1995 гг. Показатель заболеваемости возрос от 4,6 до 32,2 на 100 тыс. населения. Особенно благоприятные природные условия Алтайского края обуславливает формирования здесь активных природных очагов КЭ. В регионе фауна иксодовых клещей представлена 17 видами. Такого разнообразия видов нет ни в одной территории РФ, которые передаются клещами Ixodes persulcatus. Формирование современного ареала иксодовых клещей в очагах КЭ Алтайского края исследователи считают влияние антропогенного фактора на трансформацию экосистем, что приводит к активизации очагов КЭ. Кроме того, на уровень заболеваемости влияют снижение объема акарицидных обработок и возросший контакта населения с клещами (40% в среднем для эндемичных районов). В связи с этим в данном регионе в 90-е годы заболеваемость населения КЭ увеличилась от 5,0 до 14,2 случая на 100 тыс. населения.

Более 50 лет наблюдаются природные очаги КЭ в Ярославской области, расположенной в Центральном регионе России. Ежегодно среди жителей области регистрируются случаи заболеваний КЭ с летальными исходами. Климатические условия области таковы, что активность клещей наблюдается уже первой декаде апреля, когда заканчивается таяние снега. В отдельные годы активность клеща возможна с конца марта-начала апреля и до наступления заморозков – в сентябре-октябре. И здесь отмечается участившиеся контакты людей лесом и, следовательно, с клещами. Об этом свидетельствует число обратившихся с укусами клещей на травмпункты – от 10 до 12 тыс. ежегодно. Наиболее высокие показатели заболеваемости наблюдались в сезон 1993 и 1998 гг. (3,06 и 2,22 на 100 тыс. населения). Однако в последние 2 года в области прослеживается тенденция к сниже6нию заболеваемости КЭ – 1,6 на 100 тыс. населения.

Регистрация единичных случаев КЭ в Кировской области началась с 1952 г., серологическая диагностика впервые применена в 1959 г. Изучение эпидемиологии КЭ в области было начато в 1960-м году. В течение последних 40 лет эпидемиология КЭ в Кировской области претерпела определенные изменения. В 60-е годы прошлого века заболеваемость КЭ держалась стабильно высоких цифрах и превышала среднероссийскую в 2 раза. В 60-е годы в южных районах области преобладал алиментарный путь (52%) заражения КЭ через козье молоко. В настоящее время из-за резкого сокращения поголовья коз в южных районах данный путь передачи почти не встречается и, возможно, явилось причиной снижения заболеваемости. В настоящее время наиболее высокие показатели заболеваемости КЭ в Кировской области наблюдается в районах высокой заболеваемостью (8 районов), где показатели заболеваемости достигает 25,0 на 100 тыс. населения. В последние годы здесь также отмечается увеличение доли городских жителей (до 60%) заболевших КЭ. Сезонность в Кировской области и в г. Кирове длится с первой декады апреля по вторую-третью декаду октября. Пик заболеваемости приходится на июнь-июль (70-80%). Заболеваемости КЭ здесь в 90-е годы в 4,5 раза превысил уровень 80-х годов.

В Томской области заболеваемость КЭ регистрируется на уровне 50-80 случаев на 100 тыс. населения. Наиболее неблагополучной остается ситуация в южных районах области. А в северных и северо-западных районах заболеваемость остается на уровне 3-5 случаев в год. В 90-х годах прошлого столетия как в природных очагах Евро-Азиатского континента, так и в Тюменской области, заболеваемость КЭ резко возросла. Обилие I. Persulcatus на территории области (14-16,6 клещей на 1 км маршрута), высокая вирусофорность иксодид (1-2,9%), увеличение контакта населения с лесом стали основной причиной роста заболеваемости КЭ в области за последние 5 лет. В Тюменской области в 1996-2002 гг. иксодовыми клещами покусано людей – 100890, из них переболело КЭ 2308 (2,3%) человек. Наибольшее число заболевших были жителями из южных районов – 2087 (2,0%) человек. В последние годы очаги КЭ в Тюменской области, как и в других сибирских регионах, претерпели значительные антропургические изменения: теперь эта инфекция является болезнью жителей городов и крупных населенных пунктов. Сокращение масштабов обработки акарицидами и сложность профилактики КЭ (нарушение сроков иммунизации населения, в первую очередь из-за высокой стоимости вакцин, дефицита и высокой стоимости специфического иммуноглобулина, а также отсутствие необходимого санитарного надзора за освоением территорий, недостаток эффективных репеллентов, расширение территорий под личные хозяйства) отрицательно влияют на возможность регуляции активности эпидемического процесса. В течение 10 лет до 2002 года в Тюменской области отмечалась выраженная цикличность заболеваемости КЭ, при периодическом росте с интервалом в 3 года. Мужчины болели в 2 раза чаще, чем женщины. В возрастной структуре заболевших дети до 14 лет составляли 20-24%, 15-19 лет – 9-15%, 20-49 лет – 30-47%, 50 лет и старше – 23-28%. В 54,7% случаев КЭ протекал в лихорадочной форме. Сезонность в Тюменской области идентична таковой в Восточной Сибири – с апреля по август-сентябрь месяцы.

Заболеваемость КЭ в последние годы не только имеет тенденцию к неуклонному росту, но также происходит существенное изменение структуры заболеваемости. Она в большей части падает на городских жителей и около 1/3 из них на детей. Не вакцинированные городские жители подвергаются нападению клещей и инфицированию при посещении леса в выходные дни, а также постоянно находясь на своих садоводческих и дачных участках в течение лета. Кроме того, в последние годы широкий размах приобретает строительство коттеджей непосредственно в лесных массивах. В прошлом имело место весьма высокая заболеваемость людей, профессионально связанных с лесами – это работники лесничеств, лесхозов, геологоразведочных, топографических и других экспедиций, воинских частей. С введением обязательной вакцинации против КЭ этих контингентов, заболеваемость среди них практически сведена к нулю. Среди жителей сельских эндемичных районов заражение КЭ обычно связано посещением очагов инфекции с бытовыми целями – это заготовка дров, покосы, пастьба скота, сбор ягод и грибов, съедобных растений – черемша, папоротник.

До начала 80-х годов прошлого столетия прочно существовало мнение, что иксодовые клещи не являются переносчиками патогенных для человека боррелий. Однако в этой связи настоящей сенсацией стало открытие в США Borrelia burgdorferi – возбудителя болезни Лайма (Лайм-боррелиоза) и обнаружение его у клещей рода Ixodes. Как теперь стало ясно, с ним связано происхождение, современное распространение, эпизоотология и эпидемиология целой группы этиологически самостоятельных заболеваний, вызываемых B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii, B. afzeliiи другими геновидами боррелий.

В Иркутской области также как и на других территориях Восточной и Западной Сибири регистрируется рост числа случаев КЭ. За двадцать лет (1977-1995 гг.) отмечено увеличение заболеваемости в 75 раз, а за период 1977-1999 гг. – в 136 раз. Показатель заболеваемости за двадцать три года увеличился с 0,1 в 1977 г. до 18,9 – в 1999 г. На повышение уровня заболеваемости повлиял ряд природных и социальных факторов. Интенсивное хозяйственное освоение регионов привело к возрастанию контактов населения с природой. В области постоянно менялась эпидемиологическая обстановка по КЭ. Природные очаги КЭ располагаются на значительной территории Республики Бурятия, где в 1990-х годах как и на других территориях Восточной Сибири, прослеживалась тенденция к повышению уровня заболеваемости данной инфекции. С 1993 г. заболеваемость КЭ на данной территории возросла с 1,8 на 100 тыс. населения до 15,1 в 2000 году, превысив среднероссийский показатель в 3,8 раза. КЭ регистрируется в 16 из 21 районов Республики. Летальность по КЭ составила в 2000 году 3,2%. Пик Сезнность для КЭ здесь аналогична таковой в Иркутской области. Пик Заболеваемости приходится на июль месяц.

Таким образом, природно-очаговые трансмиссивные иксодовые инфекции на территории Восточной Сибири в целом и Красноярском крае в частности представляют определенную эпидемиологическую значимость в связи с неуклонным ростом заболеваемости в данном регионе. С каждым годом приходится констатировать увеличение числа лиц с микст формами инфекций, что свидетельствует об изменении экологии переносчика и диктует необходимость коренного пересмотра тактики эпидемиологической, клинико-диагностической и лечебно-профилактической работы.

[youtube.player]