Курсы повышения квалификации пцр-диагностика инфекционных заболеваний

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ
ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА

от 10 ноября 2006 года N 359

О проведении специализированного курса
повышения квалификации

В целях реализации мероприятий по предупреждению распространения гриппа птиц в Российской Федерации, совершенствования эпидемиологического надзора за циркуляцией вируса гриппа, в соответствии с распоряжением Правительства Российской Федерации от 4 августа 2006 года N 1083-р

1. Директору ФГУН "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Роспотребнадзора В.И.Покровскому:

1.1. Организовать в 2006 году специализированный курс повышения квалификации для врачей вирусологов ФГУЗ "центры гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора в субъектах Российской Федерации" и противочумных учреждений Роспотребнадзора по методам молекулярной диагностики гриппа птиц в соответствии с программой (приложение).

1.2. Разработать график проведения обучения специалистов.

1.3. Представить отчет о проделанной работе.

2. Главным врачам ФГУЗ "центры гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора в субъектах Российской Федерации и руководителям противочумных учреждений Роспотребнадзора направить специалистов для повышения квалификации в соответствии с графиком, разработанным ФГУН "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Роспотребнадзора.

3. Начальнику Финансово-экономического управления Роспотребнадзора В.Н.Гришиной произвести финансирование ФГУН "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Роспотребнадзора в сумме 5,2 млн.рублей для организации специализированного курса по повышению квалификации для врачей вирусологов.

4. Контроль за выполнением приказа возложить на заместителя руководителя Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Л.П.Гульченко.

Приложение. Программа курса повышения квалификации по ПЦР диагностике инфекционных заболеваний с обучением работе на тест-системах с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации "Молекулярная диагностика гриппа птиц"

Приложение
к приказу Роспотребнадзора
от 10 ноября 2006 года N 359

ПРОГРАММА
курса повышения квалификации по ПЦР диагностике
инфекционных заболеваний с обучением работе на тест-системах
с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов
амплификации "Молекулярная диагностика гриппа птиц"
(15 рабочих дней)

Вводная лекция. Грипп птиц - основные понятия, пути передачи, эпизоотия гриппа птиц в мире 2003-2006 годов. Обеспечение готовности к пандемии.

Лекция. Рекомендации ВОЗ и Роспотребнадзора по проведению эпид. и вет. надзора над гриппом птиц. Контроль над безопасностью пищи. Вопросы межведомственного взаимодействия.

Лекция. Рекомендации ВОЗ и Роспотребнадзора по диагностике гриппа птиц.

Лекция. Принципы генодиагностики. Основы ПЦР.

Лекция. Принципы генодиагностики. Основы ПЦР. (продолжение)

Практическое занятие. Демонстрация: выделение РНК и постановка ПЦР на панели стандартных клинических образцов (FEP).

Лекция. ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией (FEP, FRT).

Лекция. ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией (FEP, FRT) (продолжение).

Практическое занятие. Демонстрация: Детекция фрагментов ПЦР (FEP).

Практическое занятие. Самостоятельная работа: выделение РНК и постановка ПЦР на панели стандартных клинических образцов (FEP - I группа).

Лекция. Правила работы с клиническим материалом (типы клинического материала, правила отбора, организация транспортировки клинического материала, методы экстракции РНК).

Практическое занятие. Самостоятельная работа: выделение РНК и постановка ПЦР на панели стандартных клинических образцов (FEP - II группа).

Практическое занятие. Постановка ПЦР на панели стандартных клинических образцов (FEP - II группа). Обсуждение результатов.

Обсуждение алгоритмов лабораторной диагностики.

Практическое занятие. Постановка ПЦР на панели стандартных клинических образцов (FEP - I группа). Обсуждение результатов.

Лекция. Принципы организации ПЦР лаборатории (оборудование и материалы).

Лекция. Правила организации работы диагностической лаборатории в аспекте биобезопасности (планировка лаборатории, использование средств индивидуальной защиты).

Практическое занятие. Демонстрация: Забор материала для исследования. Использование средств индивидуальной защиты.

Практическое занятие. Демонстрация: постановка ПЦР на панели стандартных клинических образцов (FRT).

Лекция. ПЦР - в режиме реального времени - основные принципы.

Лекция. ПЦР - в режиме реального времени. Дополнительные возможности программного обеспечения прибора Rotor-Gene. Оптимизация. Оценка результатов. Артефакты анализа.

Практическое занятие. Самостоятельная работа: выделение РНК и постановка ПЦР на панели стандартных клинических образцов (FRT - I группа).

Практическое занятие. Обработка результатов демонстрационной постановки эксперимента. Порядок действий при запуске прибора. Основные операции с прибором. Качественный анализ.

Практическое занятие. Самостоятельная работа: выделение РНК и постановка ПЦР на панели стандартных клинических образцов (FRT - II группа).

Знакомство с лабораторией.

Лекция. Комплексное оборудование для ПЦР-анализа.

Практическое занятие. Планировка собственной лаборатории. Обсуждение.

Лекция. Методы детекции фрагментов ПЦР. (Электрофорез).

Лекция. Оптимизация ПЦР. Артефакты анализа. Контроль качества.

Практическое занятие. Самостоятельная работа: выделение РНК и постановка ПЦР на панели стандартных клинических образцов. (FEP - I группа)

Практическое занятие. Самостоятельная работа: выделение РНК и постановка ПЦР на панели стандартных клинических образцов. (FEP - II группа).

Практическое занятие. Самостоятельная работа: выделение РНК и постановка ПЦР на панели стандартных клинических образцов. (FRT - II группа).

Практическое занятие. Обработка результатов самостоятельной постановки эксперимента. Порядок действий при запуске прибора. Основные операции с прибором. Количественный анализ.

Практическое занятие. Практическое занятие. Самостоятельная работа: выделение РНК и постановка ПЦР на панели стандартных клинических образцов. (FRT - I группа).

Практическое занятие. Электрофорез.

ПЦР - диагностика возбудителей ОРЗ и ТОРС.

Выдача сертификатов о прохождении цикла усовершенствования. Фуршет.

Общее количество часов

Объем теоретических занятий

- не менее 45 часов.

Объем практические занятия

- не менее 63 часов.

Полностью оборудованное индивидуальное рабочее место для практических занятий:

[youtube.player]

Лекции читают научные сотрудники ФБУН ЦНИИ эпидемиологии, ведущие специалисты в области молекулярно-биологических исследований. Значительное количество времени отводится совершенствованию практических навыков: способам подготовки клинических проб для выделения нуклеиновых кислот, амплификационным технологиям, интерпретации результатов исследования при постановке диагноза.

Программа обучения рассчитана на двух- и трехнедельные циклы подготовки. Учебный процесс проходит с понедельника по пятницу и занимает весь рабочий день с перерывом на обед. Каждому слушателю выдается личный комплект методических и лекционных материалов, во время обеденного перерыва курсанты обеспечиваются бесплатным горячим питанием.

Обучение проводит ЦНИИ эпидемиологии.

ПЦР-диагностика инфекционных заболеваний

10 рабочих дней,
72 академических часа

Обучение по тест-системам с детекцией накопления продуктов амплификации в режиме реального времени (real-time PCR)

5 рабочих дней,
36 академических часов

Курс ПР-А + курс ПР-С

ПЦР-диагностика инфекционных заболеваний + Обучение по тест-системам с детекцией накопления продуктов амплификации в режиме реального времени (Real-Time PCR)

15 рабочих дней, 108 академических часов

Применение технологии пиросеквенирования для детекции генетических полиморфизмов

3 рабочих дня, 22 академических часа

Регистрация участников обучения. Анкетирование. Приветственное слово. Прием и обработка документов.

Лабораторная диагностика инфекционных болезней: настоящее и будущее. Методы типирования

возбудителей острых кишечных инфекций в эпидемиологической практике. Применение метода

пиросеквенирования для детекции генетических полиморфизмов.

Основы метода Полимеразной Цепной Реакции (ПЦР)

ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией и ПЦР в режиме реального

времени (Real-Time ПЦР)

Методы предобработки клинического материала и выделение нуклеиновых кислот (ДНК/РНК)

Realtime Manager. Программирование.

Организация санитарно противоэпидемического режима в лабораториях. Принципы правильной организации работ (GLP) в ПЦР-лаборатории. Комплексное оснащение ПЦР – лаборатории

Молекулярно-биологические методы в диагностике ИППП. Роль молекулярных методов в

диагностике нарушений биоценоза влагалища

ПЦР в диагностике вирусных гепатитов.

Молекулярно-генетические технологии и ВИЧ-инфекция: диагностика, мониторинг и подбор

Противоретровирусных препаратов. ПЦР в диагностике оппортунистических инфекций.

Острые кишечные инфекции, энтеровирусная инфекция: лабораторная диагностика и детекция возбудителей в объектах окружающей среды.

Возможности ПЦР-анализа этиологигческой диагностики ОРЗ.

Применение молекулярных методов для диагностики папилломавирусной инфекции и рака

Молекулярные методы в диагностике инфекций беременных и новорожденных.

Возможности метода ПЦР в диагностике туберкулеза.

Демонстрация. Выделение ДНК/РНК и постановка ПЦР на панели стандартных клинических

Семинар. Обсуждение результатов постановки стандартных клинических образцов (ДНК/РНК) в формате FRT.

Контрольная работа и подведение итогов курса. Тест-опрос. Экзамен.

Регистрация участников обучения. Анкетирование. Приветственное слово. Прием и обработка документов.

Realtime Manager. Программирование. Информационные технологии в медицине.

Семинары. Работа с выделительной станцией Neon 100 (Xiril AG). Качественный и количественный анализ. Программирование, расчет и анализ результатов. Работа с инструкциями к различным наборам для ПЦР в режиме реального времени.

Программа тематического цикла

Регистрация участников обучения. Анкетирование. Приветственное слово. Прием и обработка документов.

Введение. Детекция генетических полиморфизмов и методика пиросеквкенирования.

Комплексное оснащение лаборатории, использущей метод пиросеквенирования.

a. инсталляция и программирование прибора;

b. проведение ПЦР;

d. детекция нуклеотидной последовательности;

e. завершение работы, уборка реагентов и расходных материалов.

Анализ результатов пиросеквенирования:

a. общие характеристики сиквенсов;

c. интерпретация пирограмм и анализ полученных данных;

d . сложности и их устранение при интерпретации результатов пиросеквенирования.

Общее знакомство с прибором. Инсталляция оборудования.

Демонстрация. Пробоподготовка продукта ПЦР и проведение пиросеквенирования:

a . подготовка ПЦР-продукта к пиросеквенированию;

b . иммобилизация ПЦР-продукта;

с. подготовка планшета для секвенирования;

d . пробоподготовка с использованием вакуумной станции;

e. пиросеквенирование ПЦР-продукта.

Самостоятельная работа. Пробоподготовка продукта ПЦР и проведение пиросеквенирования и анализ полученных результатов.

Завершение работы. Уборка реагентов и расходных материалов.

Обсуждение возможных проблем, которые могут возникнуть при проведении пиросеквенирования.

[youtube.player]

2. Я подтверждаю, что указанный мною номер мобильного телефона, является моим личным номером телефона, выделенным мне оператором сотовой связи, и готов нести ответственность за негативные последствия, вызванные указанием мной номера мобильного телефона, принадлежащего другому лицу.

4. Клиент – физическое лицо (лицо, являющееся законным представителем физического лица в соответствии с законодательством РФ), заполнившее Заявку на обучение на Сайте, выразившее таким образом своё намерение воспользоваться образовательными услугами, предлагаемыми Центром.

5. Центр в общем случае не проверяет достоверность персональных данных, предоставляемых Клиентом, и не осуществляет контроль за его дееспособностью. Однако Центр исходит из того, что Клиент предоставляет достоверную и достаточную персональную информацию по вопросам, предлагаемым в форме регистрации (форма Заявки, форма Подписки), и поддерживает эту информацию в актуальном состоянии.

6. Центр собирает и хранит только те персональные данные, которые необходимы для проведения приема на обучение и организации оказания образовательных услуг (исполнения соглашений и договоров с Клиентом), а также информирования о новостях в области дистанционного образования для специалистов здравоохранения.

7. Собираемая информация позволяет отправлять на адрес электронной почты и номер мобильного телефона, указанные Клиентом, информацию в виде электронных писем и СМС-сообщений по каналам связи (СМС-рассылка) в целях проведения приема в Образовательные учреждения, организации образовательного процесса, отправки важных уведомлений, таких как изменение положений, условий и политики Центра. Так же, такая информация необходима для оперативного информирования Клиента обо всех изменениях условий и организации образовательного и процесса приема в Образовательные учреждения, информирования Клиента о предстоящих акциях, ближайших событиях и других мероприятиях Центра, путем направления ему рассылок и информационных сообщений, а также в целях идентификации стороны в рамках соглашений и договоров с Центром, связи с Клиентом, в том числе направления уведомлений, запросов и информации, касающихся оказания услуг, а также обработки запросов и заявок от Клиента.

8. Наш сайт использует идентификационные файлы - cookies. Cookies – небольшой фрагмент данных, отправленный веб-сервером и хранимый на компьютере пользователя. Веб-клиент (обычно веб-браузер) всякий раз при попытке открыть страницу соответствующего сайта, пересылает этот фрагмент данных веб-серверу в виде HTTP-запроса. Применяется для сохранения данных на стороне пользователя, на практике обычно используется для: аутентификации пользователя; хранения персональных предпочтений и настроек пользователя; отслеживания состояния сеанса доступа пользователя; ведения статистики о пользователях. Вы можете отключить использование cookies в параметрах настройки браузера. Следует учитывать, однако, что в этом случае некоторые функции будут недоступны или могут работать некорректно.

11. Я проинформирован, что в любое время могу отказаться от получения на указанный мной номер мобильного телефона СМС-рассылки путем направления электронного письма на адрес: [email protected]

12. Центр принимает необходимые и достаточные организационные и технические меры для защиты персональных данных Клиента от неправомерного или случайного доступа, уничтожения, изменения, блокирования, копирования, распространения, а также от иных неправомерных действий с ней третьих лиц.

13. К настоящему соглашению и отношениям между Клиентом и Центром, возникающим в связи с применением соглашения, подлежит применению право Российской Федерации.

14. Настоящим соглашением подтверждаю, что я старше 18 лет и принимаю условия, обозначенные текстом настоящего соглашения, а также даю свое полное добровольное согласие на обработку своих персональных данных.

15. Настоящее соглашение, регулирующее отношения Клиента и Центра, действует на протяжении всего периода предоставления Услуг и доступа Клиента к персонализированным сервисам Сайта Центра.

[youtube.player]

Приложение к приказу
Федеральной службы по надзору
в сфере защиты прав потребителей
и благополучия человека
от 10 ноября 2006 г. N 359

Программа курса повышения квалификации по ПЦР диагностике инфекционных заболеваний с обучением работе на тест-системах с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации "Молекулярная диагностика гриппа птиц"
(15 рабочих дней)

Вводная лекция. Грипп птиц - основные понятия, пути передачи, эпизоотия гриппа птиц в мире 2003 - 2006 гг. Обеспечение готовности к пандемии.

Лекция. Рекомендации ВОЗ и Роспотребнадзора по диагностике гриппа птиц.

Лекция. Принципы генодиагностики. Основы ПЦР.

Лекция. Принципы генодиагностики. Основы ПЦР. (продолжение)

Лекция. ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией (FEP, FRT).

Лекция. ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией (FEP, FRT) (продолжение).

Практическое занятие. Демонстрация: Детекция фрагментов ПЦР (FEP).

Практическое занятие. Постановка ПЦР на панели стандартных клинических образцов (FEP- II группа). Обсуждение результатов.

Обсуждение алгоритмов лабораторной диагностики.

Практическое занятие. Постановка ПЦР на панели стандартных клинических образцов (FEP- I группа). Обсуждение результатов.

Лекция. Принципы организации ПЦР лаборатории (оборудование и материалы).

Практическое занятие. Демонстрация: постановка ПЦР на панели стандартных клинических образцов (FRT).

Лекция. ПЦР - в режиме реального времени - основные принципы.

Знакомство с лабораторией.

Лекция. Комплексное оборудование для ПЦР-анализа

Практическое занятие. Планировка собственной лаборатории. Обсуждение.

Лекция. Методы детекции фрагментов ПЦР. (Электрофорез)

Лекция. Оптимизация ПЦР. Артефакты анализа. Контроль качества.

Практическое занятие. Самостоятельная работа: выделение РНК и постановка ПЦР на панели стандартных клинических образцов. (FEP-II группа)

Практическое занятие. Самостоятельная работа: выделение РНК и постановка ПЦР на панели стандартных клинических образцов. (FRT-II группа)

Практическое занятие. Практическое занятие. Самостоятельная работа: выделение РНК и постановка ПЦР на панели стандартных клинических образцов. (FRT-I группа)

Практическое занятие. Электрофорез.

ПЦР - диагностика возбудителей ОРЗ и ТОРС.

Выдача сертификатов о прохождении цикла усовершенствования. Фуршет.

Общее количество часов

Объем теоретических занятий

не менее 45 часов.

Объем практические # занятия #

не менее 63 часов.

Полностью оборудованное индивидуальное рабочее место для практических занятий:

(из расчета на 1 человека)

Дозаторы, 1-канальные, PrimePet

Трансиллюминатор Vilber Lurmat

Подставка к БАВ-ПЦР-"Ламинар-С"

Palm Cycler CG-96

Твердотельный термостат "Термо 24-15"

Камера для гор. Фореза, S-2N

Источник питания "Эльф-2"

Отсасыватель медицинский ОМ-1

Штатив для наконечников (100 мкл)

Штатив для наконечников (1000 мкл)

Штатив настольный (для пипеток)

Штатив для пробирок 1,5 мл "рабочее место"

Штатив для пробирок 0,6 мл "рабочее место"

Штатив для пробирок 0,2 мл "рабочее место"

Контейнер для мусора (в ламинар)

Емкость для спирта (на 200 мл)

Емкость для ДП-2Т (на 200 мл)

Файлы с боковой перфорацией

Обучение сорбентной методике выделения ДНК

Обучение сорбентной методике выделения РНК

Самостоятельная работа слушателей с тест-системами

- Автоклавированные пробирки 0,2 мл;

- Спирт 70% для обработки;

- Комплекты для амплификации Influenza Virus H5;

Практические занятия с люминисцентным # анализатором

Обучение количественным методам ПЦР анализа

Самостоятельная работа слушателей с амплификаторами с детекцией в режиме реального времени

Бесплатное предоставление расходных материалов и реагентов для практических работ:

- Пинцет (в ламинар);

- Салфетка разовая 10 x 10;

- Перчатки 6 - 7 размер;

- Перчатки 7 - 8 размер;

- Наконечники универсальные желтые с фаской 100 мкл;

- Наконечники универсальные с фильтром до 100 мкл;

- Наконечники универсальные с фильтром до 200 мкл;

- Наконечники универсальные с фильтром до 1000 мкл;

- Микропробирки 1,5 мл;

- Микропробирки 0,2 мл с плоской крышкой.

Бесплатное обеспечение учебно-методическими пособиями

- Папка с методическими материалами;

- Папка с лекционными материалами;

- Рекламная папка продукции AmpliSens;

- Листовки по оборудованию АЛА-1/4, Rotor Gene 3000, Rotor Gene 6000

- Анкета курсов повышения квалификации;

- Инструкция к прибору RG

- Прайс-лист ИЛС ПЦР.

Вы можете открыть актуальную версию документа прямо сейчас.

Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.

[youtube.player]

За звучной аббревиатурой ПЦР скрывается сложная и не слишком понятная для рядового пациента расшифровка — полимеразная цепная реакция. Что же такое ПЦР-диагностика, на чем она основана и почему в последнее время ее стали считать самой перспективной технологией в постановке диагнозов, касающихся инфекционных и вирусных заболеваний? Мы расскажем о преимуществах ПЦР-метода, его особенностях и этапах проведения.

ПЦР-диагностика: что это такое?

Диагностика методом ПЦР существует чуть более 30 лет. Значительно эволюционировав за это время, она зарекомендовала себя как один из наиболее точных способов выявления инфекций. В основе метода лежит принцип многократного увеличения микроскопических концентраций фрагментов ДНК возбудителя в биологической пробе пациента в искусственных условиях. В результате сложного процесса, называемого амплификацией, под воздействием ферментов и изменения температуры (от 50 до 95°С) из одной молекулы ДНК образуется две. При этом происходит копирование участка ДНК, который присутствует только у того вида патогенного микроорганизма, который интересует врача.

Цикл образования новой молекулы ДНК занимает всего около 3 минут, а тридцати-сорока циклов вполне достаточно, чтобы получить количество молекул, необходимое для достоверного визуального определения методом электрофореза.

Кроме амплификации, то есть простого увеличения числа копий молекулы ДНК, с помощью ПЦР можно производить и другие манипуляции с генетическим материалом, например, сращивать фрагменты ДНК, вводить мутации и т.д. Это позволяет использовать ПЦР не только для диагностики инфекционных и генетических заболеваний, но и для установления отцовства, клонирования и выделения новых генов.

ПЦР-диагностика проводится в специальных лабораториях с помощью амплификационного оборудования. На сегодня существует множество различных модификаций ПЦР, включая технологии с использованием не только ДНК, но и фрагментов рибонуклеиновой кислоты (РНК). В некоторых из них амплификация осуществляется при постоянной температуре, и для их проведения специальное оборудование не требуется.

Еще одна популярная модификация ПЦР — мультиплексная амплификация (МПА), которая позволяет проводить исследование сразу нескольких изучаемых фрагментов в одной пробирке. Это не только ускоряет и удешевляет проведение анализа, но и позволяет рассматривать одни фрагменты, получившиеся в результате реакции, в качестве положительных маркеров для других, что еще больше увеличивает точность исследования методом ПЦР.

В клинической медицине ПЦР-диагностика является одним из наиболее востребованных методов анализа в самых разных сферах:

Прямое определение возбудителя инфекции. Некоторые традиционные методы, такие как иммуноферментный анализ (ИФА), выделяют только белки-маркеры, которые являются продуктом жизнедеятельности возбудителей инфекции, а потому только косвенно указывают на присутствие микроорганизмов. Наличие специфического участка в ДНК, выявленное с помощью ПЦР, безошибочно или почти безошибочно указывает на присутствие конкретной инфекции.
Высокая специфичность метода . Она обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется фрагмент ДНК, характерный только для конкретного возбудителя инфекции. Специфичность исключает возможность ложных результатов анализа, тогда как в иммунологических методах исследований ошибки вполне вероятны из-за перекрестной реакции антигенов.
Высокая чувствительность . При помощи ПЦР-диагностики можно выявить присутствие в организме даже единичных клеток вирусов или бактерий в тех случаях, когда обычными методами сделать это практически невозможно. ПРЦ определяет наличие всего 10–100 клеток в пробе, тогда как иммунологическими и микроскопическими тестами можно определить наличие инфекции при количестве клеток не менее 103–105.
Универсальность . Сходство состава всех ДНК или РНК дает возможность применять универсальные методы лабораторных исследований, диагностируя сразу несколько возбудителей из одной биологической пробы.
Скорость получения результатов . Поскольку для проведения ПЦР-диагностики не нужен посев и выделение культуры возбудителя, то и большого количества времени на нее не требуется. Весь цикл — от забора биоматериала до получения результатов — занимает 4–5 часов.
Диагностика латентных инфекций . ПЦР-методом диагностируются трудно культивируемые и некультивируемые формы микроорганизмов, встречающиеся в тех случаях, когда заболевание протекает в скрытой форме.

Методом ПЦР можно выявлять возбудителей инфекции не только в организме человека, но и в почве, воде, продуктах питания.

Тем не менее не стоит думать, что ПЦР-диагностика не имеет недостатков. У нее есть свои ограничения, но их количество настолько незначительно, что не может отрицательно повлиять на популярность и эффективность метода:

Вероятность амплификации ДНК не только живого, но и погибшего микроорганизма . При проведении ПЦР-диагностики для контроля эффективности лечения необходимо соблюдать определенные требования. В частности, проводить ПЦР нужно после определенного промежутка времени (1–2 месяца), за который происходит полное исчезновение возбудителя инфекции в организме.
Возможность возникновения перекрестной реакции . Подбор фрагментов ДНК (праймеров) осуществляется на основе знаний о генетическом строении конкретного микроорганизма. Но теоретически такой же фрагмент может присутствовать и у других микроорганизмов, геном которых на сегодняшний день еще не расшифрован. Их присутствие в пробе может привести к ложноположительному результату анализа.
Изменчивость микроорганизмов . Эта способность возбудителей к мутации иногда приводит к тому, что некоторые их штаммы становятся неуловимыми в процессе ПЦР-анализа.

Чтобы уменьшить риски, разработаны стандарты объемов испытаний тест-систем ПЦР-диагностики, включающие проверку на перекрестные реакции и тестирование всех известных штаммов конкретного возбудителя.

ПЦР-диагностика проводится в специальной лаборатории в несколько этапов.

Забор биоматериала . Процедура, предшествующая непосредственному анализу, которая осуществляется в процедурном кабинете соответствующего профиля. Забор делается с помощью стерильного оборудования только в стерильные пробирки. Материалом для исследования могут быть:
- Эпителиальные соскобы со слизистых оболочек: из уретры, из цервикального канала, со слизистой дыхательных путей и зева, из конъюнктивы. Забор проводится с помощью специального ершика, при этом недопустимо попадание в материал следов крови.
- Моча . Собираются первые 50 г утренней мочи в стерильную емкость. Материал используется для диагностики мочеполовых инфекций.
- Мокрота . Используется для ПЦР-диагностики туберкулеза и респираторных форм микоплазмоза и хламидиоза. Мокроту собирают в стерильный флакон в количестве 15–20 мг.
- Кровь, сыворотка, плазма . С их помощью диагностируются гепатиты, герпес, ВИЧ-инфекция. Для анализа используется венозная кровь (1–1,5 мл), собранная у пациента натощак в стерильную пробирку. Хранить биоматериал можно не более суток при температуре 4°С. Замораживать кровь категорически запрещается.
- Биологические жидкости . К ним относятся слюна, сок простаты, околоплодная, плевральная, спинномозговая, суставная жидкости. Собираются при помощи пункции с использованием стерильного инструментария в количестве 0,1–1,5 мл в стерильные пробирки.
- Биоптаты , т.е. материалы, полученные путем биопсии. Обычно на анализ отправляют биоптаты двенадцатиперстной кишки или желудка, чтобы выявить хеликобактерную инфекцию. Объем материала 2–3 мм 3 .
Хранение и транспортировка биоматериала . Хранить образцы можно при комнатной температуре не более 2 часов. Если необходимо длительное хранение, то пробы помещают в холодильник с температурой 2–8°С на срок не более одних суток. Допустимо хранение некоторых биоматериалов в течение двух недель в замороженном виде при температуре -20°С. Оттаивание и повторное замораживание проб запрещено. Транспортировка, если она необходима, должна проводиться в специальных термоконтейнерах или термосах с соблюдением всех правил хранения и перевозки биоматериалов.
Выделение ДНК из образца . Способ выделения зависит от вида определяемого микроорганизма и от вида биологического образца. Если, например, анализируется соскоб эпителиальных клеток, используется так называемый метод твердофазной сорбции, заключающийся в добавлении в образец специального вещества, концентрации ДНК на сорбенте и его многократной отмывке буферным раствором.
Проведение ПЦР . Некоторое количество образца из биологической пробы переносится в специальную микроцентрифужную пробирку. Туда же добавляется амплификационная смесь, имеющая сложный состав, в объеме 25 мл. Пробирки устанавливают в программируемый термостат, и автоматическом режиме проводится амплификация. Время ее проведения зависит от заданной программы и составляет 2–3 часа. Одновременно с опытными пробами проводятся контрольные — положительные , включающие в себя контрольный препарат ДНК исследуемого возбудителя, и отрицательные , не содержащие исследуемую ДНК. Количество циклов амплификации варьирует от 30 до 40, более 40 циклов проводить не рекомендуется, так как это способствует увеличению количества неспецифических продуктов в пробе.
Регистрация результатов . Фрагмент ДНК, характерный для возбудителя инфекции, выделяют методом электрофореза в присутствии специального вещества — бромистого этидия. Его соединение с фрагментами ДНК дает светящиеся полосы при облучении ультрафиолетовым излучением. Образец помещают в камеру для электрофореза и в течение 35–40 минут проводят разделение продуктов амплификации. После этого образец просматривают в ультрафиолетовом свете — наличие оранжевой светящейся полосы свидетельствует о положительном результате.
Интерпретация результатов исследования . Результат ПЦР-диагностики может быть либо положительным, либо отрицательным. Положительный результат говорит о том, что в организме человека обнаружены следы инфекции, причем именно в данный момент времени. Количественный результат ПЦР-анализа оценить может только врач, они индивидуальны для разных типов инфекций. На основании количественного результата можно сделать вывод о степени активности заболевания и определить характер лечения.

Цена ПЦР-диагностики зависит от того, на какую конкретно инфекцию пациент планирует проверяться, от вида анализируемого материала, методики тестирования — качественной или количественной. Цена за определение одной инфекции составляет от 200 до 800 рублей в разных клиниках. Кроме того, к стоимости анализа добавится и плата за забор биоматериала — около 400 рублей. Средняя стоимость ПЦР-диагностики разных видов приведена в таблице 1.

Таблица 1 . Примерные цены на анализы ПЦР в Москве

Название анализа	Цена, руб.
Определение ДНК хламидия	750
Определение ДНК микоплазмы хоминис	540
Определение микоплазмы гениталиум	350
Определение ДНК уреаплазмы	350
Гонококк, определение ДНК	350
Определение ДНК герпеса (разные типы)	350–600
Определение ДНК кандиды	570
Вирус краснухи, определение РНК	800
Дифференцированное определение ДНК ВПЧ (разные типы)	350–1900 [1]

[youtube.player]

Читайте также: