Методы микробиологических исследований при бактериальных инфекциях
Методы исследований в микробиологии
В настоящее время проведение микробиологических исследований является важной и актуальной деятельностью в биологии и медицине, так как они позволяют с высокой степенью точности и достоверности подтвердить или опровергнуть факт присутствия в организме (или другом исследуемом объекте) возбудителей инфекционных заболеваний. Классические микробиологические методы исследования решают задачи выделения чистой культуры возбудителя с его последующей идентификацией по биохимическим, антигенным и другим признакам [1]. Основу микробиологической диагностики инфекционных заболеваний составляют микроскопические, микробиологические, биологические, серологические и аллергологические методы [3]. Благодаря микробиологическим методам исследования можно установить возбудителей тех или иных инфекционных заболеваний и подобрать правильный метод лечения этого заболевания.
Цель: Описать основные микробиологические методы исследований, применяемых в биологии и медицине.
Задачи:
- охарактеризовать основные методы исследований в микробиологии по литературным источникам;
- ознакомить учащихся с основными микробиологическими методами исследований в кратком изложении.
Микроскопические методы исследования – это способы изучения очень мелких, неразличимых невооруженным глазом объектов с помощью микроскопов. Широко применяются в бактериологических, гистологических, цитологических и других исследованиях.
Микроскопические методы исследований включают в себя приготовление мазков и препаратов для микроскопирования. В большинстве случаев результаты микроскопических исследований носят ориентировочный характер (например, определяют отношение возбудителей к окраске), так как многие микроорганизмы лишены явных морфологических (т.е. структурных) внешних и внутренних особенностей. Тем не менее микроскопией материала можно определить некоторые морфологические признаки возбудителей (например, наличие ядер, жгутиков, внутриклеточных включений и т.д.), а также установить сам факт наличия или отсутствия микроорганизмов в исследуемых образцах.
Существуют световая, фазово-контрастная, темнопольная (ультрамикроскопия), люминесцентная, поляризационная, ультрафиолетовая и электронная микроскопия [2].
Биологические методы исследований направлены на определение наличия токсинов возбудителя в исследуемом материале и на обнаружение самого возбудителя (особенно при его незначительном исходном содержании в исследуемом образце). Методы включают в себя заражение лабораторных животных исследуемым материалом с последующим выделением чистой культуры патогена либо установлением факта присутствия микробного токсина и его природы.
Моделирование экспериментальных инфекций у чувствительных животных — важный инструмент изучения патогенеза заболевания и характера взаимодействий внутри системы микроорганизм-макроорганизм. Для проведения биологических проб используют только здоровых животных определённой массы тела и возраста. Инфекционный материал вводят внутрь, в дыхательные пути, внутривенно, внутримышечно, подкожно, в переднюю камеру глаза, через трепанационное отверстие черепа, субокципитально (в большую цистерну головного мозга). У животных прижизненно забирают кровь, экссудат (скопившуюся жидкость) из брюшной полости, после гибели — кровь, кусочки различных органов, экссудаты из различных полостей [3].
Серологические методы исследований для выявления специфических антител и антигенов возбудителя — важный инструмент в диагностике инфекционных заболеваний. Особую ценность они имеют в тех случаях, когда выделить возбудителя не представляется возможным. При этом необходимо выявить повышение титров антител (т.е. их концентрации), в связи с чем исследуют парные образцы сыворотки, взятые в интервале 10-20 суток (иногда этот интервал может быть более длительным). Aнтитела обычно появляются в крови на 1-2-ю неделю заболевания и циркулируют в организме относительно долго, что позволяет использовать их выявление для эпидемиологических исследований.
Особое значение имеют методы выявления микробных антигенов, порождающих антитела. В значимых количествах они появляются уже на самых ранних сроках, что делает их идентификацию важным инструментом экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, а количественное их определение в динамике инфекционного процесса служит критерием эффективности проводимой антимикробной терапии.
Антигены многих возбудителей обладают сенсибилизирующим действием, т.е. способны вызывать аллергические реакции. Это используют для диагностики инфекционных заболеваний, а также при проведении эпидемиологических исследований. Наибольшее распространение нашли кожно-аллергические пробы, включающие внутрикожное введение Аг (аллергена). Кожные пробы нашли применение в диагностике таких заболеваний как сап, мелиоидоз, бруцеллёз. Наиболее известна проба Манту, используемая как для диагностики туберкулёза, так и для оценки невосприимчивости организма к возбудителю [4].
В данной работе были кратко описаны основные методы исследований в микробиологии (микробиологические методы исследований):
1. Микроскопический метод.
2. Микробиологический метод.
3. Биологический метод.
4. Серологический метод.
5. Аллергологический метод.
С помощью методов, применяемых в микробиологии, люди научились выявлять и определять различного рода возбудителей тех или иных инфекционных заболеваний. Правильно выбранный метод способствует в дальнейшем правильному лечению заболеваний.
В настоящее время наиболее широко используются микроскопический, микробиологический и биологический методы исследования, потому что именно благодаря этим методам можно выявить причину возникновения и проявления инфекционных болезней у живых организмов и дать верную характеристику возбудителям этих болезней.
Микроскопический. С помощью микроскопии нативного патологического материала определяют вид возбудителя заболевания по форме, взаиморасположению и способности окрашиваться определенными красителями.
Бактериологический. Этот метод основан на выделении чистой культуры возбудителя заболевания и его идентификации (определение вида микроба).
Серологический. Метод основан на определении специфических антител в крови больных или переболевших инфекционными заболеваниями к соответствующим возбудителям с помощью различных реакций (агглютинации, пассивной гемагглютинации, связывания комплемента, преципитации и других).
Биологический. В основе этого метода лежит заражение лабораторных животных исследуемым материалом от больного с целью воспроизведения у них инфекционного заболевания или последующего выделения возбудителя.
Аллергический. С помощью этого метода обнаруживают повышенную чувствительность макроорганизма к определенным возбудителям инфекционных заболеваний или продуктам их жизнедеятельности. Для аллергических проб используют препараты, которые называются аллергенами.
Молекулярно-генетический. С помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) определяют в исследуемом материале наличие возбудителя инфекционного заболевания по специфичным для него последовательностям нуклеотидов.
ПРИЗНАКИ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ (для определения вида микроба)
Морфологические - форма, величина и характер расположения микробов друг к другу.
Тинкториалные - способность микробов окрашиваться различными красителями.
Культуральные - особенности роста микробов на жидких и плотных питательных средах.
Биохимические - способность микроорганизмов потреблять различные вещества (углеводы, белки и другие) с образованием характерных конечных продуктов, или наличие у микроорганизмов различных ферментов (уреаза, цистиназа и другие).
Антигенные - особенности химического состава микробных клеток (антигенной структуры), выявляемые с помощью специфических диагностических иммунных сывороток,
Чувствительность к специфическим фагам - способность бактерий лизироваться эталонными специфическими фагами.
Биологические свойства. Токсигенность - способность продуцировать экзотоксин. Чувствительность к определенным колицинам или тип синтезируемых колицинов.
Определение понятий "микроорганизмы" и "вид"
Микроорганизмы - это невидимые простым глазом живые существа, включающие в себя представителей всех царств жизни - плазмиды, вирусы, прокариоты (эубактерии и архебактерии) и эукариоты. Они стоят на низших ступенях эволюции и играют важную роль как в общей экономике природы, так и в патологии человека, животных и растений.
Вид - совокупность микроорганизмов, имевших общий корень происхождения, сходный генотип (более 80% гомологии ДНК) и максимально близкие фенотипические признаки и свойства.
Метод люминесцентной микроскопии.
Люминесцентная микроскопия основана на способности некоторых веществ светиться под действием коротковолновых лучей света. При этом длина волны излучаемого при люминесценции света всегда будет больше, чем длина волны света, возбуждающего люминесценцию. Так, если освещать объект синим светом, то он будет испускать лучи красного, оранжевого, желтого или зеленого цветов.
Препараты для люминесцентной микроскопии окрашивают специальными (светящимися) люминесцентными красителями - флуорохромами (например, раствор акридинового оранжевого 1:5000 - 1:10000). Лучи света от сильного источника (обычно ртутной лампы сверхвысокого давления) пропускаются через сине-фиолетовый фильтр. Под действием этого коротковолнового излучения окрашенные акридиновым оранжевым бактерии начинают светиться красным или зеленым светом. Для того, чтобы синий свет, вызывающий люминесценцию, не мешал наблюдению, над окуляром микроскопа ставят "запирающий" желтый светофильтр, задерживающий синие, но пропускающие желтые, зеленые и красные лучи.
В результате при наблюдении в микроскопе на темном фоне будут видны микробные клетки, светящиеся желтым, зеленым или красным цветом. При окраске акридиновым оранжевым дезоксирибонуклеиновая кислота (ядерное вещество) будет светиться ярко-зеленым цветом, а находящаяся в цитоплазме рибонуклеиновая кислота - красным цветом.
Метод люминесцентной микроскопии позволяет изучать живые нефиксированные бактерии, окрашенные сильно разведенными растворами красителей, не причиняющих вреда микробным клеткам. По характеру свечения могут быть дифференцированы отдельные химические вещества, входящие в состав микробной клетки. Метод с большим эффектом может -быть использован для ускорения диагностики ряда заболеваний.
Флуоресцирующими красителями можно обрабатывать диагностические сыворотки, содержащие антитела к определенным бактериям. Краситель, например, изотиоцианат флуоресцеина, химически соединяется с глобулинами иммунной сыворотки и таким образом как бы избирательно метит антитела.
Люминесцирующие сыворотки могут быть использованы для идентификации выделенных культур бактерии и для ускоренной индикации патогенных микробов во внешней среде и в выделениях больных.
Сущность иммунофлуоресцентного метода исследования заключается в том, что из исследуемого материала готовят мазок и после высушивания и фиксации обрабатывают его люминесцирующей сывороткой. При наличии в исследуемом мазке гомологичных бактерий, вследствие адсорбции на них меченных флуоресцирующим красителем антител, в люминесцентном микроскопе на темном фоне препарата обнаруживается специфическое яркое желто-зеленое свечение по периферии бактериальных клеток. Центральная часть клеток не светится. Присутствующие в препарате посторонние микробные клетки не светятся.
Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:
[youtube.player]Первым этапом микробиологической диагностики болезней является выбор материала для исследования, обусловленный патогенезом заболевания. При поражениях отдельных органов и систем целесообразно отбирать материал соответствующей локализации. При отсутствии поражений исследуют кровь, а затем отбирают образцы с учётом клинической картины заболевания и доступности материала для исследования. Так, при лихорадке неясного генеза первоначально проводят посев крови; затем, при появлении симптомов более конкретных проявлений, например пневмонии, проводят забор мокроты.
Образцы следует забирать до назначения антимикробной терапии, с соблюдением правил асептики для предупреждения загрязнения материала. Каждый образец следует рассматривать как потенциально опасный. При заборе, транспортировке, хранении и работе с ним необходимо соблюдать правила биологической безопасности. Материал собирают в объёме, достаточном для всего комплекса исследований. Микробиологические исследования следует начинать немедленно после поступления образца в лабораторию.
Выбор материала для исследования должен соответствовать характеру инфекционного процесса. Так, например, при установлении этиологии пневмонии материалом должна быть мокрота, а не слюна, а при раневых инфекциях отделяемое следует забирать из глубины раны, а не с её поверхности.
Различают следующие методы микробиологической диагностики бактериальных инфекций: бактериоскопический, бактериологический, биологический, серологический и аллергический.
Бактериоскопический, бактериологический и биологический методы направлены на обнаружение возбудителя в исследуемом материале.
Бактериоскопический метод заключается в приготовлении мазка из исследуемого материала, окраске его (иногда изучают возбудителя в живом состоянии) и микроскопии. Данный метод находит ограниченное применение, так как может быть использован лишь при наличии каких-либо морфологических или тинкториальных особенностей у возбудителя и достаточном содержании возбудителя в исследуемом материале. Чаще всего бактериоскопический метод применяют как ориентировочный.
Основным методом диагностики инфекционных заболеваний является бактериологический метод.Его применяют практически при всех бактериальных инфекциях для установления точного диагноза и нередко для назначения лечения, несмотря на продолжительность исследования – от 3 до 5 дней (иногда до 2 мес.). Бактериологический метод включает посев исследуемого материала на питательные среды, выделение чистой культуры и ее идентификацию. В том случае, если в исследуемом материале предполагается содержание возбудителя в достаточном количестве, посев материала производят на плотные питательные среды (для получения изолированных колоний). При незначительном содержании микроорганизмов исследуемый материал прежде всего засевают на жидкие питательные среды – среды обогащения. Идентификацию выделенной чистой культуры проводят по морфологическим, антигенным и токсигенным свойствам (в зависимости от вида возбудителя). Определение перечисленных свойств позволяет установить вид возбудителя. С эпидемиологической целью производят внутривидовую идентификацию (эпидемиологическое маркирование) выделенной культуры: определяют ее фаговар, биовар и т.д. Кроме того, для назначения рациональной химиотерапии, как правило, определяют чувствительность выделенной культуры к антибиотикам. При заболеваниях, вызванных условно-патогенными бактериями, необходимо определять количество микроорганизмов в исследуемом материале.
Биологический методнаправлен на обнаружение в исследуемом материале возбудителя или его токсина. Метод заключается в заражении исследуемым материалом лабораторных животных с последующим выделением чистой культуры возбудителя и ее идентификацией или определением природы токсина.
Однако постановка микробиологического диагноза инфекционного заболевания возможна не только с помощью выделения и идентификации возбудителя, но и при обнаружении специфических антител к нему. Для этого используют серологический метод, заключающийся в постановке реакций иммунитета. Антитела к возбудителю заболевания появляются, как правило, к концу 1-ой недели заболевания, с этого времени и используют данный метод. Определение классов Ig четко характеризует этапы инфекционного процесса, а также может служить косвенным прогностическим критерием. Особое значение имеют методы выявления микробных антигенов. В значимых количествах они появляются уже на самых ранних сроках, что делает их идентификацию важным инструментом экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, а количественное их определение в динамике инфекционного процесса служит критерием эффективности проводимой антимикробной терапии. В частности, для экспресс-диагностики инфекционного заболевания применяют реакцию иммунофлуоресценции, позволяющую быстро (в течение нескольких часов) выявить возбудителя в исследуемом материале.
Аллергический метод направлен на выявление повышенной чувствительности организма к специфическому аллергену, которым является возбудитель заболевания. Примером этого метода является постановка кожно-аллергических проб. В основе метода лежит феномен гиперчувствительности замедленного типа (ГЧЗТ).
Применяют также молекулярно-генетические методы диагностики: ПЦР, гибридизация ДНК и др.
[youtube.player]Инфекционные болезни — это заболевания, вызванные проникновением в организм бактерий, грибков или вирусов. Самая важная часть диагностики инфекций — это определение возбудителя и его концентрации. Для этих целей используются разнообразные лабораторные методы, которые позволяют выяснить, чем именно и как давно атакован организм, а в некоторых случаях — спрогнозировать эффективность лечения тем или иным препаратом.
Особенности диагностики инфекционных заболеваний
В клинической практике данный тип заболеваний встречается очень часто. Именно они, по данным Всемирной организации здравоохранения, становятся причиной 26% всех смертей. В список самых распространенных инфекционных заболеваний входят инфекционная пневмония и другие воспалительные заболевания дыхательных путей, гепатит, ВИЧ, туберкулез, малярия, воспаления органов половой системы и мочевыводящих путей, гистоплазмоз, ротавирусные инфекционные заболевания, ветряная оспа, герпес, вирус папилломы человека и еще несколько десятков болезней. Хотя бы раз в жизни каждый из нас сталкивается с инфекционными заболеваниями и необходимостью быстрой постановки диагноза.
Все инфекционные болезни делятся на пять типов — прионные, вирусные, бактериальные, протозойные и грибковые поражения. Далее будут рассмотрены последние четыре типа как наиболее распространенные. Разные возбудители иногда могут вызывать одно и то же заболевание. В частности, пневмония может быть результатом как вирусной, так и бактериальной инфекции. Лечение зависит не от проявлений, а от возбудителя болезни. Противовирусные препараты бесполезны в борьбе с бактериями и грибками, антибиотики не действуют на вирусы. Поэтому основная задача лабораторной диагностики инфекционных заболеваний — выявление типа возбудителя.
Способы лабораторной диагностики инфекционных болезней можно разделить на два типа: неспецифические и специфические методы.
К неспецифическим относятся общий анализ крови и исследование соотношения ее белковых фракций, печеночные пробы, общий анализ мочи и кала. Эти методы не дают информации о виде возбудителя, но позволяют узнать, в какой мере болезнь затронула органы и системы организма, что именно в их работе нарушено и насколько далеко зашел процесс.
Специфические — вирусологический и бактериологический методы, микроскопическое исследование возбудителей, анализы на антигены и антитела — направлены непосредственно на обнаружение возбудителя.
Современная медицина располагает множеством методов выделения возбудителей бактериальной инфекции:
Бактериоскопический . Исследуется окрашенный специальным образом мазок.
Бактериологический . Биоматериал высеивается в питательную среду, и через некоторое время специалист исследует колонию бактерий, выросшую в ней.
Биологический . Направлен на определение патогенности микроорганизмов.
Серологический . Выявляет антитела и антигены в сыворотке крови — особые вещества, которые вырабатываются организмом при контакте с возбудителем определенной болезни.
Чаще всего для исследований используют кровь или сыворотку крови, реже — слюну, мочу, кал, клетки эпителия (мазок и соскоб) и другой биоматериал.
В лабораторной диагностике вирусных заболеваний используются:
Вирусологическое исследование . Световая и электронная микроскопия дает возможность выявить наличие вирусных включений и сами вирусы и идентифицировать их.
Серологическое исследование для обнаружения антител и антигенов. Этот метод дает возможность быстро выявить агрессора, как и в случае с бактериальными инфекциями. Для диагностики используются разнообразные способы исследования материала — реакции гемадсорбции, гемагглютинации или метод непрямой иммунофлюоресценции. Имунноблоттинг, в частности, позволяет выявлять антитела сразу к нескольким инфекциям и считается современным и точным диагностическим методом.
Молекулярно-генетические методы . Последнее слово в лабораторной диагностике. Позволяют обнаружить вирус даже тогда, когда его концентрация ничтожно мала — то есть на самых ранних стадиях. Самым известным из этих методов является ПЦР, при которой фрагмент вируса многократно копируется до тех пор, пока специалист не получит достаточно материала для определения типа вируса и его изначальной концентрации.
Для выявления вирусов обычно требуется сделать анализ крови.
Так называют инфекции, вызванные простейшими паразитами, например, амебами. Малярия, амёбиаз, токсоплазмоз, лямблиоз, трихомониаз, сонная болезнь — вот неполный список самых распространенных протозойных инфекций. Лабораторная диагностика таких заболеваний включает в себя следующие методы:
Микроскопический . Простейшие паразиты выявляются путем исследования под микроскопом окрашенных образцов биоматериала. Самый простой и надежный метод для многих возбудителей.
Культуральный . Посев биоматериала в питательную следу для дальнейшего исследования размножившихся простейших. У этого метода есть существенный недостаток: результатов нужно ждать долго, сам процесс может занять не менее 5-6-ти дней.
Серологический . Используют редко ввиду малой информативности.
Аллергический . Также не является распространенным. Кожные аллергопробы делают для того, чтобы подтвердить лейшманиоз и токсоплазмоз. Это вспомогательный диагностический метод.
В качестве биоматериала для исследований в основном используется кровь, иногда — – кал или моча.
Микроскопическое исследование . Препарат окрашивается и рассматривается под мощным микроскопом. Посредством иммунофлюоресцентной микроскопии исследуется проба, помеченная флюоресцеинами — специальным красителем. Наиболее быстрый способ выявления грибка по сравнению с другими методами.
Культуральный . Происходит посев пробы на питательную среду и дальнейшее исследование полученной в результате колонии грибков.
Серологический . Используется для выявления грибковых поражений, однако для микозов он считается не особенно точным.
Гибридизация нуклеиновых кислот . Самый современный способ выявления грибковых инфекций, его применяют для идентификации основных возбудителей системных микозов. Из культуры извлекается РНК и вносится особым способом помеченная молекула ДНК. Если в пробе наличествует один из основных патогенных грибков, ДНК объединится с его РНК, создав легко различимую структуру. Несомненным преимуществом метода является возможность определить инфекцию на самых ранних стадиях.
Биоматериалом для исследований являются клетки кожи, волос и ногтей, клетки слизистых оболочек (мазок или соскоб), мокрота, моча, секрет простаты, сперма, грудное молоко.
Современные методики диагностики инфекций позволяет выявить их на начальном этапе, Чем раньше болезнь будет обнаружена, тем проще ее вылечить. Поэтому сдавать анализы на инфекции желательно регулярно, даже если вы ни на что не жалуетесь и не замечаете никаких перемен в самочувствии.
Перед сдачей биоматериала для исследований иногда требуется определенная подготовка. Так, кровь обычно сдают с утра, натощак, а перед забором мазка не рекомендуется принимать душ. Эти требования очень важны: они обеспечивают точность результата, поэтому узнайте у врача заранее о подготовительных мерах и точно следуйте всем его рекомендациям.
[youtube.player]Цели микробиологической диагностики:
- Нахождение возбудителя.
- Обнаружение антител или антигенов.
- Выявление состояния инфекционной аллергии.
- Обнаружение специфических фрагментов ДНК или РНК возбудителя.
Для обнаружения возбудителя материал от больных, бактерионосителей или из объектов внешней среды (например: кровь, гной, мокрота, испражнения, вода, пищевые продукты и т.п.) исследуют следующими методами:
А) Бактериоскопический (микроскопический) метод, при котором из исследуемого материала приготавливают микропрепараты и изучают их в окрашенном виде в световом микроскопе; применяют также фазово-контрастную и люминисцентную микроскопию. Бактериоскопический метод простой, быстрый, но обычно дает только предварительный ответ, может быть использован не при всех инфекциях. Но при некоторых заболеваниях позволяет ставить и окончательный диагноз (например, при спирохетозах и др.).
Б) Бактериологический метод, при котором исследуемый материал засевают на питательные среды с целью выделения чистой культуры возбудителя заболевания. Полученную культуру идентифицируют, т.е. подвергают тщательному изучению для определения ее видовой (иногда типовой) принадлежности. Бактериологический метод позволяет поставить окончательный диагноз, он является ведущим методом при диагностике многих инфекционных заболеваний. Основные недостатки – трудоемкость и длительность: обычно ответ получают на 4-5 день, а при некоторых заболеваниях и позже, например, при туберкулезе – через месяц и более.
В) Биологический метод, при котором исследуемым материалом заражают восприимчивых животных с тем, чтобы у инфицированного животного обнаружить и выделить возбудителя, пользуясь для этой цели бактериологическим и бактериоскопическим методами, или выявить на животных присутствие токсина (биологическая проба). Биологический метод, как правило, применяют в том случае, когда не удается поставить микробиологический диагноз другими способами.
Г) Экспресс-методы (быстрой диагностики) основаны на обнаружении возбудителя в пробах, взятых от больного, которые позволяют дать ответ через несколько часов.
Возбудитель может быть выявлен в пораженных тканях с помощью флюоресцирующих антител. Это прямой и непрямой ИФ.
Антиген может быть обнаружен в материале от больного и другим способом, при помощи твердофазного иммунологического анализа, в серологических реакциях на твердой основе. В зависимости от маркера, который используется для метки антигенов или антител, эти реакции разделены на РИА (с использованием радиоактивных маркеров) и ИФА (ферментов). Методы просты, доступны, являются высокочувствительными и сочетают наглядность микроскопического метода со специфичностью серологического.
Серологический метод применяется для обнаружения антител или антигенов в организме больного или других обследуемых лиц.
Серологический метод заключается в постановке различных реакций иммунитета (реакции агглютинации, непрямой гемагглютинации, реакции связывания комплемента, преципитации и др.).
Обычно серологическое исследование проводится для обнаружения антител в исследуемой сыворотке с помощью известных антигенов – диагностикумов. Реже в исследуемых материалах (крови, моче, спинномозговой жидкости и др.) определяют антиген, пользуясь для этой цели диагностическими сыворотками с известными антителами. Серологический метод широко применяется, так как сравнительно прост, дает ускоренный ответ (в течение суток) и отличается специфичностью.
Аллергический метод применяется для выявления состояния инфекционной аллергии. Метод заключается в постановке кожных аллергических проб со специфическими антигенами (аллергенами), приготовленными из возбудителей заболевания. При положительной кожной пробе на месте введения возникает гиперемия, припухлость, что может указывать на наличие инфекции. Кожные аллергические пробы ставятся при туберкулезе, бруцеллезе, туляремии и ряде других заболеваний.
Молекулярно-генетический метод исследования позволяет обнаружить в клиническом материале специфические фрагменты ДНК или РНК возбудителя посредством молекулярной гибридизации или полимеразной цепной реакции (ПЦР).
ПЦР – молекулярно-генетический экспресс-метод исследования, позволяющий выявить присутствие в клиническом материале даже минимального количества специфических фрагментов ДНК или РНК с определенной нуклеотидной последовательностью и тем самым диагностировать природу инфекции. По своей чувствительности ПЦР далеко превосходит все остальные методы диагностики инфекционных заболеваний.
Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет
[youtube.player]МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОБСЛЕДОВАНИЯ ПУЛЬМОНОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ
Зам. начальника Главного управления лечебно-профилактической помощи Министерства здравоохранения СССР В.А.Кошечкин 12 мая 1981 г. 10-11/62
Методические рекомендации рассмотрены и одобрены Ученым советом ВНИИ пульмонологии МЗ СССР.
Методические рекомендации составили сотрудники Всесоюзного научно-исследовательского института пульмонологии МЗ СССР:
руководитель лаборатории микробиологии, доктор медицинских наук Л.А.Вишнякова;
старший научный сотрудник, кандидат медицинских наук М.В.Герасимова;
младший научный сотрудник М.Е.Фаустова.
ВВЕДЕНИЕ
Ввиду широкого распространения так называемых неспецифических заболеваний легких (НЗЛ) и обусловленного ими высокого уровня нетрудоспособности, а также относительно значительного показателя инвалидизации и смертности от этих заболеваний, профилактика, диагностика и лечение НЗЛ являются одной из актуальных проблем здравоохранения нашей страны. Большая роль в патогенезе этих заболеваний принадлежит инфекционному воспалительному процессу.
До 40-50 годов было общепринято, что ведущим этиологическим фактором этих заболеваний являются пневмококки, а различные нозологические формы НЗЛ характеризовались лишь преобладанием тех или иных серотипов этих микроорганизмов. Широкое применение антибиотиков и сульфаниламидов и высокая чувствительность к этим препаратам пневмококка обусловили трудность его обнаружения у больных. Это послужило поводом к возникновению в последующие годы представления о резком снижении циркуляции и об уменьшении удельного веса, а часто и почти полного отрицании роли этих микроорганизмов в этиологии НЗЛ. При микробиологическом обследовании пульмонологических больных обычно обнаруживается ассоциация микроорганизмов, общих с микрофлорой верхних дыхательных путей и ротовой полости, не только в мокроте, но и в смывах из бронхов, куда эти бактерии легко проникают при аспирации и где при нарушении дренажной функции они длительно сохраняются и размножаются. Быстрое развитие вирусологии в 50-80-х годах дало возможность определить этиологию многих острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ), которые часто предшествуют возникновению и обострению хронических неспецифических заболеваний легких (ХНЗЛ). Эти факты послужили поводом к возникновению представления о полиэтиологичности НЗЛ и о возможности быть возбудителем их большого количества микроорганизмов вирусной, микробной и грибковой природы.
В последние годы произошли значительные изменения в представлении о роли респираторных вирусов в этиологии НЗЛ. Патологические процессы, вызываемые респираторными вирусами, характеризуются кратковременностью и относительно меньшей клинической выраженностью по сравнению с бактериальными. Они локализуются преимущественно в верхних дыхательных путях, трахее и крупных бронхах и почти никогда не поражают паренхиму легких, поэтому рентгенологически они характеризуются как интерстициальные. ОРВИ вызывают угнетение гуморальных и клеточных факторов иммунитета и сенсибилизацию организма, а морфологические изменения мерцательного эпителия и отек - нарушение дренажной функции бронхов и клиренса легких. Эти патологические процессы снижают иммунологическую реактивность организма, создают благоприятные условия для размножения и проникновения в ткани легких различных микроорганизмов и для развития бактериального инфекционного процесса. В настоящее время большинство исследователей рассматривает ОРВИ лишь как ведущий, но не единственный, предрасполагающий фактор для возникновения острых воспалительных процессов в легких, развитие которых есть проявление экзо- и эндогенной бактериальной инфекции. Поэтому деление пневмоний на вирусные и бактериальные, вероятно, неправомерно. Однако ввиду относительно высокой частоты возникновения острых и обострения хронических НЗЛ на фоне ОРВИ, профилактика и лечение этих инфекций являются в определенной степени профилактикой острых воспалительных процессов в легких.
Если исключить пневмонические процессы, наблюдающиеся при ряде нозологических самостоятельных инфекционных заболеваний (орнитозе, пситтакозе, Ку-риккетсиозе и т.д.), то создается представление о пневмонии и других воспалительных процессах в легких как о бактериальной инфекции, возбудители которой характеризуются выраженным тропизмом к легочной ткани.
В последние 10-20 лет на основании клинико-микробиологических и клинико-иммунологических сопоставлений и экспериментальных исследований была показана апатогенность или слабая патогенность для легочной ткани ряда микроорганизмов, обнаруживаемых в бронхиальном содержимом, а главное, ведущая роль пневмококков и Н. influenzae в возникновении и поддержании воспалительных процессов в легких. Это дало возможность разделить наиболее часто выделяемые из бронхиального содержимого микроорганизмы по степени их потенциальной способности быть возбудителями воспалительного процесса в легких на три группы: патогенные (Str. pneumoniae, Н. influenzae), условно-патогенные (St. aureus, Str. haemolyticus, Ps. aeruginosa, Kl. pneumoniae и другие энтеробактерии); непатогенные (St. epidermidis, Str. viridans, Str. anhaemalyrticus непатогенные нейссерии и другие). Патогенные микроорганизмы, вероятно, способны преодолевать защитные свойства бронхолегочной системы и вызывать первичный острый инфекционный процесс. При дисбактериозе и резком ослаблении резистентности организма в результате тяжелого заболевания или хирургического вмешательства, а также после лучевой, иммунодепрессивной или гормональной терапии условно-патогенные микроорганизмы могут обсеменять нижние отделы дыхательного тракта, а при нарушении дренажной функции бронхов и деструкции мерцательного эпителия вызывать развитие инфекционного процесса, преимущественно вторичного.
Основной задачей микробиологического исследования пульмонологических больных является выявление этиологии острого и обострения хронического заболевания, с целью определения этиотропной терапии и контроля за ее эффективностью.
При микробиологическом обследовании пульмонологических больных необходимо соблюдать принципы как общепринятые при диагностике инфекционных болезней, так и обусловленные значением условно-патогенных микроорганизмов в патогенезе НЗЛ.
Успешность микробиологического обследования пульмонологических больных зависит, в первую очередь, от полноценности патологического материала и соблюдения правил сбора, транспортировки и хранения его.
МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
При неспецифических воспалительных заболеваниях легких микробиологическому исследованию подвергается следующий материал: кровь, мокрота, аспират, содержимое и промывные воды бронхов, мазки из носоглотки и гортани, плевральный экссудат, пунктат инфильтрата или абсцесса, ткань легкого, бронха и т.д.
Кровь. Обследование лихорадящих больных в острый период заболевания необходимо начинать с анализа крови и бронхиального содержимого. В острую фазу инфекционного воспалительного процесса в легких у некоторых больных наблюдается бактериемия, причем у детей она отмечается значительно чаще. Бактериемия часто не интенсивная и ограничена первыми днями болезни, а при вторичной инфекции она наблюдается в самом начале повторного ухудшения состоянии больного. Появление микроорганизмов в крови при НЗЛ обычно связано с резким снижением иммунологической реактивности организма и является плохим прогностическим признаком. При бактериемии возможны отдаленные очаги нагноения и деструкции и значительно нарастает летальность. Так, при пневмококковой острой пневмонии пневмококк обнаруживается в крови у 15-33% больных. Среди этих больных погибает четвертая-третья часть, в то время как средняя летальность у взрослых равна 3-5%.
Пунктат из инфильтрата или абсцесса. Наиболее эффективен для определения этиологии заболевания, забор патологического материала непосредственно из очага инфильтрации или абсцесса легких до прорыва его в дренирующий бронх, т.е. до сообщения с внешней средой. При трансторакальной пункции удается получить материал из очага поражения и избежать таким образом обсеменения материала посторонними микроорганизмами. Иногда этот способ получения материала используют у маленьких детей и тяжелых больных, не способных откашливать мокроту, причем тяжесть данной манипуляции компенсируется значительно более точным определением этиологии и этиотропной терапией заболевания.
Бронхиальные смывы. Наиболее эффективно микробиологическое исследование бронхиального содержимого, аспирированного через бронхоскоп или катетер, особенно вблизи очага поражения. Из-за вязкой консистенции и небольшого количества забор таким образом бронхиального секрета практически удается редко. Поэтому делают смыв из бронхов физиологическим раствором, что значительно снижает микробиологическую ценность этого материала из-за разведения секрета, часто значительного и бактерицидного действия на чувствительные микроорганизмы этого раствора и дезинфицирующих средств, остающихся после обработки катетеров. В нашей лаборатории при сопоставлении количества живых микробных клеток в 1 мл смывов из бронхов и мокроты, взятых у больных одновременно, было показано, что концентрация микроорганизмов в промывных водах на 1-4 lg (в среднем на 2 lg) ниже, а при небольшой концентрации бактерий в бронхиальном содержимом выделить их из смывов не удается. Кроме того, эндоскопические манипуляции довольно трудоемки и тяжелы для больного, что препятствует проведению повторных исследований в динамике заболевания. К тому же, при введении катетера и бронхоскопа не исключается возможность занесения в бронх микроорганизмов из верхних отделов дыхательных путей.
Мокрота. Микробиологическое исследование бронхиального секрета, как правило, начинается с анализа мокроты, несмотря на хорошо известные недостатки этого материала: зараженность посторонней микрофлорой из верхних отделов дыхательных путей и ротовой полости, и неравномерность обсеменения микроорганизмами различных частей одной порции мокроты. Положительные стороны этого материала: легкость многократного получения в динамике заболевания большого количества мокроты как в условиях стационара, так и амбулаторно, возможность более точного определения количества микроорганизмов в 1 мл ее.
Ввиду неравномерного распределения микрофлоры в мокроте, необходимо исследовать большое ее количество: гомогенат всей утренней порции или не менее 1-2 мл ее. Утренняя порция мокроты наиболее точно отражает состав микрофлоры нижнего отдела дыхательных путей. Поэтому исследование бронхиального секрета, скопившегося в течение ночи, значительно эффективнее.
С целью предотвращения попадания в бронхиальное содержимое посторонней микрофлоры из верхних дыхательных путей и ротовой полости и уменьшения произошедшей контаминации, используется ряд приемов: перед отхаркиванием мокроты необходимо полоскать полость рта раствором слабого антисептика, например, фурацилина, а затем кипяченой водой для удаления последнего, или просто кипяченой водой, что значительно уменьшает попадание в исследуемую мокроту микроорганизмов, вегетирующих в ротовой полости (стрептококков, нейссерий и др.).
Для освобождения мокроты от наслоившейся флоры рта и глотки проводится трехкратная механическая "отмывка" слизистых комочков секрета в стерильном физиологическом растворе или бульоне или используется количественный метод исследования (см. ниже).
При соблюдении правил сбора и обработки мокроты результаты ее динамического исследования позволяют с достаточной степенью достоверности судить о микрофлоре нижних отделов дыхательного тракта и патологического очага в легочной паренхиме.
Мазки из гортани и зева. При отсутствии мокроты или скудном ее количестве, а также у больных, не умеющих или не способных ее откашливать, микробиологическому исследованию могут быть подвергнуты мазки из гортани (с голосовых связок), т.е. на границе, разделяющей верхний и нижний отдел дыхательных путей. Однако определение концентрации микроорганизмов достаточно условно из-за трудности получения стандартных мазков, но количественное исследование их в динамике дает возможность судить о соотношении различных групп микроорганизмов и о преобладании некоторых видов, что очень важно для понимания этиологической значимости отдельных бактерий. Результаты посева мазка из зева очень трудно интерпретировать при наличии местных очагов инфекции и из-за возможного носительства патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.
Плевральный экссудат. Микробиологическое исследование плеврального экссудата способствует определению этиологии плеврита, а динамическое наблюдение с помощью количественного метода необходимо для назначении и оценки адекватности проводимого лечения.
УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ОБСЛЕДОВАНИЯ ПУЛЬМОНОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ
Основным условием эффективности микробиологического исследования является проведение его в начале заболевания или обострения до лечения антибактериальными препаратами. Только раннее микробиологическое обследование в течение первых 7-10 дней дает возможность выявить этиологию относительно кратковременных инфекционных процессов, характерных для острого бронхита и пневмонии. На второй-третьей неделе при этих заболеваниях наблюдается освобождение организма от возбудителя, в результате, главным образом, иммунного клиренса легких, что почти исключает выделение жизнеспособных бактерий. Применение, даже очень кратковременное (в течение 1-2 дней), антибиотиков и сульфаниламидов при этих острых формах НЗЛ резко снижает, а часто полностью исключает возможность определения микробиологическими методами этиологии данных заболеваний. При обострении хронических НЗЛ антибактериальное лечение приводит к 3-4-кратному снижению частоты выделения патогенных микроорганизмов (Str. pneumoniae и H. influenzae), и обсеменению дыхательных путей резистентными формами бактерий, главном образом, стафилококком, грамотрицательными энтеробактериями и псевдомонадами, что очень затрудняет определение этиологии заболевания.
Предварительная обработка и посев материала должны проводиться не позднее 1-2 часов после сбора материала, т.к. более длительное пребывание его в условиях комнатной температуры приводит к гибели пневмококка, H. influenzae и других чувствительных к влиянию внешней среды микроорганизмов и размножению в исследуемых субстратах устойчивых видов микробов (стафилококков, грамотрицательных энтеробактерий и других). Срок хранения материала до его обработки и посева может быть увеличен до 3-4 часов, если в течение этого времени пробы находятся в условиях комнатного рефрижератора при 4-8°. После окончания антибактериальной терапии микробиологическое исследование содержимого бронхов должно проводиться не раньше, чем через 5-7 дней.
Следующим важным условием эффективности микробиологических исследований является динамическое изучение микрофлоры (не менее двух-трех раз в течение болезни), что дает возможность уточнить этиологию патологического процесса, проследить длительность персистенции возбудителя, контролировать эффективность проводимой терапии, а также выявить иногда наблюдающуюся смену этиологических факторов. Мокроту и бронхиальные смывы больных острой пневмонией можно хранить в комнатном холодильнике до суток, так как пневмококк сохраняет в этих условиях свою жизнеспособность.
ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ И БУМАЖНЫЕ ДИСКИ, НАГРУЖЕННЫЕ РАЗЛИЧНЫМИ ПРЕПАРАТАМИ
Основой основ эффективности микробиологического обследования больных является использование элективных сред для определенного возбудителя.
Ведущие этиологические факторы НЗЛ - пневмококки и Н. influenzae требуют для своего выделения и культивирования высококачественных питательных сред, содержащих термолабильные и термостабильные факторы роста. Согласно биологическим свойствам этих двух видов микроорганизмов, для выделения пневмококка используют биопробы на мышах, посев на среду Викторова, агар Хоттингера и другие, или сочетание этих способов, в то время как для выделения H. influenzae применяются "шоколадный" агар, агар Левинталя, триптозно-соевый агар, среду Филдса, сердечно-мозговые среды и т.д. Возможность возникновения вторичного инфекционного процесса, вызванного St. aureus, Ps. aeruginosa и грамотрицательными энтеробактериями, требует использования элективных сред и для этих микроорганизмов.
1. "Среда ВНИИП". На основании изучения чувствительности различных питательных сред и необходимости ряда субстратов для роста пневмококков, Н. influenzae и других микроорганизмов нами разработана питательная среда, условно названная "средой ВНИИП", со следующим соотношением компонентов в весовых процентах:
гидролизат Хоттингера или казеина (180-200 мг% аминного азота)
Читайте также: