Могут ли анализы на инфекции быть ошибочными

К сожалению, такие ситуации вполне возможны, причем старые методы – микроскопическое исследование мазка, бакпосевы – ошибаются гораздо чаще современных ПЦР и ИФА. Но и при применении новых методик могут быть единичные ложноположительные или ложноотрицательные результаты. Причины этого явления – неправильная подготовка к сдаче и погрешности при проведении анализа.

Причины ошибок при микроскопическом исследовании мазка

Этот анализ на ЗППП проводится довольно просто – берется мазок из половых путей, который окрашивается и осматривается. Метод был достаточно информативным много лет назад, когда выявлялись инфекции, вызываемые микробами и простейшими.

Однако со временем количество венерических инфекций увеличилось, и теперь они вызываются не только микробами, но и вирусами, определить которые с помощью мазка невозможно. Поэтому герпес, папилломавирус и цитомегаловирус такой анализ не покажет.

Однако и традиционные инфекции в мазках выявляются далеко не всегда. Например, если мужчина помочится перед обследованием, он смоет всех возбудителей из мочеиспускательного канала, и в мазке их не будет. Такая же ситуация произойдет, если женщина перед сдачей анализов проспринцуется. Ложноотрицательный результат регистрируется и на фоне приема антибиотиков.

Плохо определяются скрытые инфекции, не имеющие симптомов, особенно если поражаются глубокие органы, например простата у мужчин или яичники и матка у женщин. При взятии материала вне периода обострения возбудители, скорее всего, не обнаружатся.

Чтобы добиться более достоверных результатов при сдаче мазков, используется метод провокации. Для этого перед анализом с вечера нужно выпить небольшое количество алкоголя, поесть копченой или солёной пищи. Иногда делаются специальные провоцирующие уколы. Как правило, после этого возбудители регистрируются лучше.

Чем обусловлены неправильные результаты бакпосева

Ложноотрицательные результаты в этом случае также получаются при приёме антибиотиков, местном использовании антибактериальных средств и неправильном взятии материала. Некоторые виды возбудителей просто не дают роста.

Ложноположительный результат может регистрироваться при попадании микробов в образец извне – например, при погрешности в проведении анализа.

Ошибки при проведении ИФА-обследования

И при этом обследовании тоже бывают ошибки. Чаще всего их причинами являются:

неправильный забор материала;
нарушение обмена веществ у пациентов;
приём медикаментов, влияющих на работу иммунной системы;
иммунодефицит;
беременность, при которой также меняется работа иммунной системы. Поэтому при положительных результатах обследования назначают другие методы, подтверждающие или опровергающие диагноз.

ПЦР-диагностика – ошибки практически исключены

Самый достоверный метод лабораторных обследований, вычисляющий возбудителей даже по небольшому количеству материала, – ПЦР. Но иногда и он дает ошибки, если, например, забор образцов был проведен неправильно.

Порой возбудители не обнаруживаются, поскольку их просто нет в выделениях, а они находятся в более глубоких тканях, например внутри простаты у мужчин или в яичниках и матке у женщин. В этом случае делается мазок с провокацией. Если в качестве образца используется кровь, провоцирование не проводится. В результате точность обследования при проведении ПЦР-реакции доходит до 100%.

Точность лабораторной диагностики также зависит от применяемого оборудования и реактивов. Поэтому сдавая анализы в современной клинике или диагностическом центре, пациенты значительно уменьшают вероятность ложноположительного или ложноотрицательного результата.

Что такое бактериурия и когда она возникает

Бактериурией называется наличие бактерий в урине. Часто это состояние не вызывает клинических симптомов, проявляясь случайно при сдаче анализов мочи. Присутствие микроорганизмов в мочевыводящих путях всегда говорит о серьезном воспалительном или инфекционном процессе.

Причины бактериурии

Инфекции, в том числе ЗППП. В этом случае в урине обнаруживаются бактерии, попавшие из мочевого пузыря и уретры.
Односторонний или двухсторонний пиелонефрит – инфекционное поражение почек.
Острые и хронические воспалительные заболевания женской половой сферы. При этих патологиях микробы проникают в мочеполовую систему с током лимфы или крови.
Камни, возникающие примочекаменной болезни, затрудняющие отток урины и провоцирующие застойные явления в мочеполовой системе.
Гломерулонефрит – в этом случае поражается гломерулярный фильтр и бактерии попадают с током крови в мочу.
Новообразования предстательной железы, мешающие оттоку мочи и провоцирующие размножение бактериальной флоры.
Прямокишечные свищи, при которых в мочу проникают микроорганизмы из кишечника.

Типы бактериурии

Бессимптомная, при которой, кроме появления микроорганизмов в урине, ничего не беспокоит.
Истинная – сопровождается затрудненным болезненным мочеиспусканием. Урина вытекает мутная, с хлопьями, гноем, иногда примесью крови. Наблюдается повышение температуры, боль в пояснице, озноб. У мужчин может наблюдаться выделение гноя из уретры.
Восходящая – бактерии проникают из нижних отделов мочевыводящих путей в верхние. Часто наблюдается при ЗППП.
Нисходящая – в этом типе бактериурии микробы проходят из почек вниз по мочеточникам, попадая в мочевой пузырь и уретру. Такая ситуация возникает при пиелонефрите и закупорке мочевых путей камнем.

Какие микроорганизмы чаще всего обнаруживаются в моче

Стрептококки появляются в анализах урины после перенесенных ангины, бронхита, пневмонии, скарлатины. В мочевыводящую систему они чаще всего проникают с током крови. Состояние обычно провоцируется низким иммунитетом.

Кишечная палочка проникает в мочевыделительную систему при несоблюдении правил гигиены и кишечных свищах. Колибациллярная бактериурия часто регистрируется при снижении защитных сил организма, вызванных диабетом и иммунными нарушениями.

Гонококк – при гонорее в моче обнаруживаются гонококки. Если заболевание перешло в хроническую форму, симптомы инфекции могут отсутствовать.

Брюшнотифозные сальмонеллы – при брюшном тифе в 30% случаев у больных наблюдается бессимптомное выделение микробов с мочой. Это состояние может сохраняться и после выздоровления.

Бактерии бруцеллеза – у 10% больных наблюдается выделение этого микроба с мочой. При этой инфекции часто наблюдается бессимптомная форма бактериурии.

Как проводится лечение

При регистрации микроорганизмов в моче делается ее посев с определением типа микроорганизмов и их чувствительности к антибиотикам.

Выясняются причины бактериурии. Пациентам назначается УЗИ почек, предстательной железы, малого таза, показывающее состояние этих органов. Дается направление на биохимический и общий анализы крови.

Назначается трехстаканная проба мочи. Урина собирается в три стакана и по повышенному количеству лейкоцитов в одной из проб судят о месте, где возникла инфекция:

в первой пробе – поражён мочеиспускательный канал;
в третьей – причина кроется в предстательной железе;
во всех трёх – инфекция находится в почках;
в первой и третьей – возможен простатит и уретрит, а также сочетание двух заболеваний.

Пациенты сдают анализы на половые инфекции – мазки из половых путей и предстательной железы, бакпосев, ПЦР, ИФА.

Делается ПСА-тест – анализ на рак предстательной железы. Этот маркер появляется в самом начале заболевания, поэтому выявлять злокачественные опухоли можно до начала клинических симптомов.

Для лечения назначаются антибиотики, противовоспалительные препараты, обезболивающие средства, инстилляции (введение антисептических растворов в уретру через мочевой пузырь). При обнаружении свищевых ходов показано хирургическое лечение.

При подозрении на носительство бактерий, вызванное инфекцией, больного направляют к врачу-инфекционисту, а при обнаружении опухолей – к онкологу.

Бактериурия – опасный симптом, говорящий о возможных тяжелых заболеваниях. Поэтому при появлении бактерий в моче нужно обратиться к урологу, обследоваться и вылечить выявленные патологии.

О враче

Запишитесь на прием к врачу урологу-андрологу высшей категории - Клокову Андрею Николаевичу уже сегодня. Мы сделаем все, чтобы принять вас как можно быстрее. Клиника Радуга расположена в Выборгском районе Санкт-Петербурга, всего в нескольких минутах ходьбы от станций метро Озерки, Проспект Просвещения и Парнас. Смотрите карту проезда.

Специфические лабораторные методы применяются для диагностики гепатита С. К ним относятся иммунохимические, молекулярно-биологические анализы распознавания РНК-содержащего вируса (ВГС).

Интерпретация полученных данных зависит от:

Чувствительности применяемого метода. Это способ определения минимального компонента в величине разведения — антител, антигенов, нуклеиновых кислот. Выражается в количественных единицах — титрах.
Специфичности конкретного метода, способного выявить ВГС и антитела к нему

Цель работника лаборатории заключается в разграничении ложноположительных анализов на гепатит С и обнаружение вируса и антител к нему.

О чем я узнаю? Содержание статьи.

Анализы на гепатит С

Постановка диагноза HСV-инфекции происходит с помощью вирусологических (ПЦР) и серологических тестов (ИФА).Симптоматика острой фазы заболевания практически отсутствует, но уже в первые 7-14 дней после инфицирования диагностировать этот период гепатита С можно при обнаружении РНК методом ПЦР.

Применение ИФА в этой стадии не результативно, так как антитела вырабатываются через несколько недель. Изобретение тестовых систем 3 поколения способствует определению IgM в ранние сроки. Метод используют в лабораториях, но он не отвечает целям полной диагностики и оценки эффективности лечения.

Метод иммуноферментного анализа разработан в трех вариантах: иммуноферментный, радиоиммунный, флюороиммунный. Востребован твердофазный ИФА. В постановке реакции он прост, высокочувствителен и относительно не дорог.

В зависимости от агента, который определяют – антиген или антитело, ИФА представляет разную ценность в диагностике. Верные результаты получаются при выявлении вирусных антигенов. Это также не является критерием постановки диагноза, так как часть антигенов расположена только в печеночной ткани и в крови обнаружить их не возможно. Поэтому нужно применять ИФА с определением сразу двух видов вирусных антигенов.

При обнаружении антител к ВГС нельзя говорить о присутствии вируса. Выявлены случаи когда анализ ИФА оказывается ложноположительным у обследуемого. Это указывает на иммунологическую память ранее присутствующего вируса в организме.

В проведенных исследованиях 957 проб с положительным ИФА потребовались другие арбитражные методы — ПЦР. В итоге у 36,6% РНК не обнаружилось, что свидетельствует о получении ложноположительного ответа.

Разработанные за последнее десятилетие новые тестовые системы способны одновременно определять антитела и антигены к вирусу гепатита С.

Этот метод детекции — полимеразная цепная реакция, создан для обнаружения вирусной РНК в образце сыворотки крови. Исследование заключается в многоцикловом процессе, который состоит из переходящих друг в друга этапов.

С помощью применения обратной транскриптазы (фермента) образуются молекулы ДНК вируса гепатита С. Итоговый результат — выделение вирусной рибонуклеиновой кислоты. Количественный вариант ПЦР используют для определения концентрации РНК. Исследуется количество копий в 1 мл. Выражается в логарифмических выражениях (log10).

Для прогнозирования эффективности лечения важным является выяснение принадлежности гепатита С к генотипу. В проведении генотипирования используют типоспецифические праймеры, в методах основанных на методике ПЦР.

Может ли анализ на гепатит С быть ошибочным?

На сегодня по-прежнему остается шанс получения ложноположительного результата на наличие анти-ВГС. При определенных обстоятельствах искаженные данные получаются при проведении ИФА и ПЦР.

Доля ошибочных ложноположительных результатов составляет 10-20%.

Для уточнения нахождения вируса в крови обследуемого человека применяют метод обнаружения РНК совместно с другими чувствительными методами. Однако получение отрицательного ответа не свидетельствует о ложноположительном ответе. В случаях полного выздоровления пациентов (10-15%) в крови возможно присутствие анти-ВГС.

Получение ложноположительного результата зависит от естественных причин:

появление мутантных штаммов;
репродукции антител и антигенов возбудителя.

Причины ложноположительного анализа

Ошибочный анализ регистрируется в виде ложнонегативных и ложнопозитивных результатов.

Ложноположительный ответ получается при:

смешении исследуемого образца с предыдущим через лабораторное оборудование или аэрозоли;
соединение между пробами при работе с реакционной смесью.

Ложноотрицательные ответы определения РНК получаются при:

нарушениях правил перевозки клинических образцов;
несоблюдении теплового режима образцов крови;
распад РНК при подготовке к пробе;
поэтапное прохождение ПЦР нарушает гепарин и высокий уровень криоглобулинов;
присутствие в сыворотке белковых, химических субстанций.

Распространенные причины ошибок анализов связаны с:

иммунодефицитными состояниями;
онкологией;
аутоиммунными заболеваниями (синдром Рейно, полинейропатия, узелковый периартериит и другие);
поражениями системы крови (тромбоцитопения, гемолитическая анемия);
глистными инвазиями;
сифилисом.

Ошибка в анализе возможна с учетом действия работников, участвующих в процессе, с процедурного кабинета и до клинической лаборатории.

Человеческий фактор возможен при:

нарушении нумерации пробирок в момент забора крови;
указании ошибочного ответа;
неправильных действиях лаборанта в ходе подготовки образца;
проведении пробы в условиях повышенной комнатной температуры;
неопытности молодого специалиста;
изготовлении некачественных диагностических препаратов.

Моментом, который способен искажать данные исследований является алкоголь. Это своеобразный антидепрессант, который воздействует на диагностику гепатита С. У пьющих людей с хронической формой выявляться HCV РНК при отсутствии антител и наоборот.

Установленный гепатит С ложноположительный у беременной женщины может быть связан с физиологическими изменениями происходящими в организме в период вынашивания плода:

выработку характерных гестационному периоду белков;
полную перестройку гормональной системы;
повышение концентрации противовоспалительных цитокининов;
изменение биохимических показателей;
присоединение инфекций бактериального и вирусного генеза.

Инфекционные заболевания протекают с выделением антител (защитные факторы крови) в ответ на антигены (болезнетворные возбудители). Работа иммунитета человека заключается в выработке иммуноглобулинов в ответ на проникновение чужеродных агентов.

Одновременное выделение иммуноглобулинов при инфекционном процессе в сочетании с гепатитом С искажает результаты анализов ИФА, что ведет к возрастанию количества ложноположительных и ложноотрицательных результатов.

Лабораторная диагностика гепатита С при коинфекции с ВИЧ затруднена. Ложноотрицательный ИФА по выявлению анти-ВГС связан с формированием иммунодефицита у человека. Поэтому всегда проводится исследование РНК методом ПЦР.

Как избежать ложноположительного результата?

Исключить ложноположительный результат возможно при проведении дополнительных (supplemental) тестов. Это препараты, созданные специально для определения антител к конкретным белкам, кодированных разными зонами вирусной РНК.

Внедрение новых методик лабораторного исследования вирусного гепатита С обеспечивает раннюю диагностику заболевания и сводит к минимуму появление ложных результатов. Это мера способствует своевременно начатому лечению, которое заканчивается выздоровлением.

Мировая статистика насчитывает боле 38 миллионов человек с ВИЧ-инфекцией. Как бы страшно не звучали эти цифры – с каждым годом болезнь поддается лечению. Средства защиты, профилактики, специальные препараты обеспечивают счастливую и длинную жизнь ВИЧ-инфицированному населению. Больше всего болезнь превалирует в странах со средним и низким уровнем жизни. В ВИЧ рейтинг входят государства Центральной Азии, Восточной Европы, Африки, Ближнего Востока.

Некоторые люди, узнав о том, что заражены ВИЧ инфекцией совершают самоубийства. Бывают случаи, когда человек еще точно не знает, болен он или нет, но уже приговаривает себя к смерти.

Но каждый должен знать: жизнь одна и со всем можно и нужно бороться.

Часто даже самые лучшие приборы, клиники и специалисты могут допустить погрешность. Поэтому вероятность ошибки анализа на ВИЧ – есть.

Если вы собрались сдать анализы вместе со своим половым партнером, то вам необходимо знать информацию указанную в статье. Сегодня мы дадим ответ на следующие вопросы:

Что влияет на анализы ВИЧ. Как подготовиться к сдаче?
Статистика ложноположительных анализов на ВИЧ.
Ложный анализ на ВИЧ причины.
ВИЧ положительный, что это значит?
Ложный анализ на ВИЧ, кто виноват?

Врачи считают, что к ключевым группам ВИЧ больных относятся:

«Геи, трансгенедеры, наркоманы, заключенные тюрьмы. Люди, работающие в сфере секс услуг. Как правило, они совершенно не соблюдают гигиену. Да и про какую гигиену может идти речь, если мозг решает только потребность влечения. От ВИЧ эпидемии страдают женщины и подростки африканских стран. Поскольку уровень держав не позволяет проводить должное лечение. Статистика умирающих от ВИЧ растет.

Могут ли быть ошибочные анализы на ВИЧ?

Чтобы не допустить ложный анализ на ВИЧ, к исследованию надо правильно подготовиться. Нередко результаты могут шокировать пациента, без видимых причин и показать, что он является ВИЧ-инфицированным. Такая ошибка называется ложноположительный анализ. Есть 2 метода сдачи показателей на ВИЧ. Каждый имеет свою статистику ошибочных результатов.

Иммуннохроматографический – тест полоски. Допустимость погрешности или ошибки 5%.
ИФА – 0.8-0.9 %.

Конечно процент, что это промах – невысок. Тем не менее, такое случается. Врачи рекомендуют следовать нескольким правилам, чтобы точно уберечь себя от лишних переживаний и депрессии.

Первая процедура - это сдача венозной крови. Вам обработают место, откуда будут брать кровь, введут пипеточный шприц и заберут нужное количество крови. Кровь могут взять, как из локтевой ямы, так и из предплечья. Не многие знают, что перед забором крови кушать категорически нельзя. Почему? – микроэлементы пищи всасываются в тонкий кишечник. От этого меняется состав крови. Стоит также отказаться от жирной еды в вечернее время, если утром на анализ. Жиры делают кровь мутнее, и возникает хилез. Меняется и уровень гормонов, который очень влияет на результат. Постарайтесь не кушать за 8-14 часов до процедуры, а пить можно в обычном режиме. После сдачи угостите себя шоколадкой.

Ложноположительная реакция на ВИЧ может возникнуть из-за вирусных болезней: ОРВИ, грипп. В организме происходит синтез антител. Именно антитела в борьбе против вируса могут распознаваться, как бактерии против ВИЧ-инфекции. Не проходите исследование, если заболели или болеете. После болезни сдать кровь на ВИЧ можно через 1 неделю.

Моральный страх будет. Когда вопрос касается серьезного заболевания, нам становится страшно. Люди откладывают обращение к врачу и еще больше рискуют своей жизнью. Поэтому если у вас есть подозрения, что инфекция оказалась в организме – забудьте про все и срочно сдайте анализы. Если никаких предпосылок волноваться нет, то спокойно, ради уверенности пройдите обследование.

Статистика, результаты ИФА на ВИЧ

Реакция на ВИЧ у каждого проявляется по-разному. Иногда, люди годами могут не знать о тяжелом заболевании, а после оно резко бьет по иммунной системе.

Неутешительная статистика все больше пугает здоровую часть мирового населения, поскольку с каждым годом растет.

Африканский регион ВОЗ имеет 25.7 миллионов граждан, которые являются переносчиками ВИЧ. Это 2/3 инфицированных от всех болеющих.
Оценивая статистику 2018 года: только 79% людей знали о болезни. 62% проходили лечение и антивирусную терапию. У 53% вирус удалось ослабить и избежать риска заражения других людей.
На 2019 год антивирусную терапию использовали 24.5 миллион человек.
С 2000 по 2018 год смертность от ВИЧ снизилась на 45%. Тем не менее, АРТ спасло 13.6 миллионов граждан различных стран.
Ложноположительный результат на ВИЧ случается в 5% случаев, если это тест полоски. Если это ИФА, то процент снижается до 1.

Ошибочный результат на ВИЧ, причины

Современная медицина с каждым годом совершенствуется и не дает шансы иметь место ошибкам. Но по ряду различных причин ошибки случаются, при этом очень пугают, а после и радуют пациентов. Результаты анализов зависят от:

Человека, который сдает тест на ВИЧ.
От работы лаборатории и опыта врачей.
От аппаратной техники.

Иногда, виной появлению седых волос становятся технические ошибки. Неопытные медсестры и работники клиник могут не соблюдать режим хранения и транспортировки крови, взятой на анализ. Но такое случается все реже

Ложноположительный анализ у женщин может появляться из-за беременности. Если у беременной анализ показал положительный статус, ей необходимо встать на учет в СПИД-диспансер. Там проведут обследование и повторную сдачу. Через 3 месяца после первой сдачи крови, проводится вторая. Если показатели антител растут, значит это ВИЧ. Остается прежним – последствия беременности, и бояться нечего.

Сахарный диабет, коллагеноз – тоже причины неправильных показателей. На правильность результатов повлияет наличие онкологии или аутоиммунные болезни.

Ложный результат ВИЧ бывает и у детей. Женщины, которые имеют инфекцию, могут родить здорового ребенка. НО. Первые 18 месяцев в его крови будет повышенный показатель антител. Если дальше показатели пойдут на спад – ВИЧ нет.

На причины ложноположительного анализа на ВИЧ может повлиять еще несколько факторов:

Стресс, переутомление.
Неправильное питание, а как последствие – нарушение гормонального фона.
Тяжелая физическая нагрузка вызывает синтез гормона стресса. Перед исследованием стоит воздержаться от спорта.

Может ли анализ на ВИЧ быть ложноположительным и когда его надо сдавать?

Сдать анализ и остаться анонимным пациентом, человек имеют право в любое время. Но с такой осторожностью к своему здоровью относится совсем маленький процент людей. Чаще всего, мы бежим лечиться, когда уже заболели. Но есть ряд ситуаций, которые обязывают пройти проверку для уверенности и своевременного назначения лечения.

Сдавайте кровь перед запланированной беременностью.
Перед любой хирургической операцией.
После проколов кожи или сомнительных, нестерильных инъекций.
После полового контакта с малознакомым мужчиной/женщиной.
Если чувствуете себя намного хуже, чем обычно, но видимых причин не находите.

Более того, все клиники, всех стран проводят анализ совершенно бесплатно. Врачи и медицинские учреждения приветствуют ответственных молодых людей.

Также, вы имеете право рассчитывать на полную конфиденциальность. Вы можете не называть своего имени, или назвать только имя. В первом случаи вам вручат порядковый номер. Результаты анализов будут выданы только вам. Разглашение показателей анализа, считается нарушением врачебной тайны. Строго карается увольнением и полным отстранением от врачебной работы. Поэтому анонимность – точно обеспечена.

Мы рекомендуем проходить проверку 2 раза в год. Обращать внимание на общее физическое и психологическое состояние. Быть ответственным за свое здоровье, использовать методы контрацепции. Будьте здоровы и счастливы!

Все большее развитие получает лабораторная диагностика на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) благодаря своей скорости и высокой чувствительности. Однако, несмотря на простоту и удобство метода, существует ряд условий, невыполнение которых может привести к получению недостоверного или ложного результата.

Простой на первый взгляд метод имеет ряд "подводных камней", с которыми так или иначе приходится сталкиваться практически каждому специалисту лаборатории. К различным ошибкам могут приводить как отсутствие опыта в использовании данной методики, так и стереотипы мышления персонала, ранее работавшего в биохимических или бактериологических лабораториях, где иные требования к работе. В результате таких ошибок могут быть получены ложноположительные, ложноотрицательные или недостоверные результаты анализов.

С точки зрения получения ложноотрицательного или ложноположительного результата особенно опасны ошибки, контроль которых невозможно осуществить во время проведения ПЦР-анализа, - прежде всего, связанные с нарушением правил взятия, хранения и транспортировки клинического материала. Однако при диагностике могут допускаться и другие ошибки, которые могут быть не замечены сотрудником КДЛ при анализе результатов.

Все ошибки, допускаемые в лабораторной практике, можно разделить на три класса:

ошибки преаналитического этапа;

ошибки аналитического этапа;

ошибки постаналитического этапа.

1.Ошибки преаналитического этапа ПЦР-диагностики

Операции преаналитического этапа ПЦР-диагностики выполняются вне ПЦР-лабораторий, однако ошибки, допускаемые на этом этапе, оказывают едва ли не самое существенное влияние на результат исследования. Большинство этих ошибок невозможно выявить в ходе исследования, и, следовательно, существенно возрастает риск получения ложного результата. В связи с этим необходима совместная работа с различными подразделениями ЛПУ по разработке алгоритма взятия биоматериала и контроль его выполнения.

Взятие биологического материала.

Первой и самой существенной ошибкой преаналитического этапа ПЦР-диагностики является неправильный выбор места взятия биологического материала для исследования. Поскольку метод ПЦР является прямым, т. е. позволяет непосредственно выявить причину заболевания, а данном случае обнаружить патогенный микроорганизм, то биоматериал необходимо брать непосредственно в месте предполагаемой локализации инфекционного процесса. Исследование некоего "универсального материала", как, например, крови, не позволит определить наличие в организме патогена во всех случаях, за исключением тех, при которых возбудитель локализован именно в крови. В первую очередь это относится к патогенам, которые могут поражать многие органы и ткани, таким как, например, Chlamydia trachomatis или Мусоbасterium tuberculosis.

Chlamydia trachomatis могут поражать эпителий слизистой оболочки урогенитального тракта, эпителий конъюнктивы глаза и синовиальной полости. Следовательно, при подозрении на урогенитальный хламидиоз материалом для исследования должен служить соскоб из урогенитального тракта, при поражении глаз у новорожденного - соскоб из конъюнктивы глаза, при хламидийном артрите - пунктат синовиальной жидкости.

Мусоbасterium tuberculosis могут поражать практически любой орган и ткань организма человека, т. е. материал для исследования не должен быть одним и тем же при разных формах патологического процесса.

Таким образом, если у ребенка хламидиоз глаз, а для исследования взят образец из урогенитального тракта, а при туберкулезе почек для исследования берется мокрота, отрицательный результат не будет исключать факта инфицирования пациента.

Вторая ошибка на преаналитическом этапе - неправильное взятие материала на исследование.

Общими требованиями к биологическому материалу являются максимальная концентрация микроорганизмов в образце, а также отсутствие нежелательных примесей, ингибирующих ПЦР.

Например, Chlamydia trachomatis - облигатные внутриклеточные паразиты, следовательно, исследуемый материал должен содержать большое количество клеток эпителия . То есть при взятии материала для выявления этих микроорганизмов необходимо делать соскоб, а не мазок, поскольку в мазке Chlamydia trachomatis не будут обнаружены, даже если находятся в организме в значительном количестве.

При взятии материала из урогенитального тракта необходимо избегать ингибирующих примесей, таких как слизь, кровь или гной. Для этого соскобы берут не ранее, чем через два часа после мочеиспускания, у женщин учитывают дни цикла. Избыток слизи или гноя необходимо удалить стерильным ватным тампоном непосредственно перед взятием биоматериала. Забирать материал желательно специальными пластиковыми зондами, что снижает вероятность появления крови в образце, к тому же они, в отличие от ватных, не сорбируют транспортную среду и исследуемый материал.

Обработка биологического материала.

Правильное взятие урогенитального соскоба - процедура болезненная для лиц мужского пола и детей, поэтому для исследования можно использовать первую порцию утренней мочи, содержащую максимальное количество эпителия. В последующем для работы необходимо получить клеточный осадок мочи. Однако следует учитывать, что осадок содержит большое количество солей и мочевины, которые при использовании технологий флуоресцентной детекции денатурируют зонды, что может привести к ложноположительным результатам. Поэтому клеточный осадок мочи необходимо в обязательном порядке промывать физиологическим раствором.

Следующая ошибка преаналитического этапа - неправильная обработка взятой крови. Для предотвращения свертываемости крови в процессе доставки необходимо использовать антикоагулянты. Во многих лабораториях в качестве антикоагулянта используется гепарин. Однако гепарин достаточно сильно ингибирует ПЦР, и независимо от используемой тест-системы и способа пробоподготовки все результаты для образца, его содержащего, окажутся недостоверными в случае наличия внутреннего контроля ПЦР или отрицательными, независимо от реального положения вещей в случае, если внутреннего контроля нет .

Хранение биологического материала.

Необходимо помнить о температуре хранения биологического материала, а также сроках и способах его доставки в ПЦР-лабораторию в случае, если транспортировка требует значительного времени. При нарушении сроков хранения или транспортировки биоматериала ДНК или РНК возбудителя может разрушаться, что приведет к ложноотрицательным результатам. Образцы рекомендуется хранить при температуре от 2 до 8°С в течение нескольких часов, для более длительного хранения необходимо замораживание. Единственное исключение - кровь, поскольку цельную кровь замораживать нельзя! Необходимо получить плазму и уже ее замораживать. Заморозка должна быть однократной, в противном случае происходит разрушение нуклеиновых кислот.

2.Ошибки аналитического этапа ПЦР-диагностики

Ошибки в работе.

Ошибки аналитического этапа, как правило, связаны с невнимательным чтением инструкции, прилагаемой к набору для проведения ПЦР-анализа.

Одной из таких ошибок является неправильный выбор системы пробоподготовки. Менее опасно применение экспресс-методов дли сложных биоматериалов - таких как, например, плазма крови, потому что в этом случае наиболее вероятно получение недостоверных результатов из-за оставшихся в пробе ингибиторов ПЦР, что, в свою очередь, вынудит специалиста КДЛ повторить эксперимент и выяснить причину неудачи. Гораздо опаснее, если из-за неправильно выбранной тест-системы в процессе пробоподготовки теряется часть или вся ДНК или РНК возбудителя - в этом случае есть риск получения ложноотрицательного результата.

Вторая ошибка - неправильно приготовленные фоновые пробирки для тест-систем с флуоресцентной детекцией но конечной точке. Чаще всего это связано с тем, что сотрудник лаборатории забывает их менять при появлении новой серии реактивов или не делает этого из соображений экономии. Возможно, что одни и те же компоненты реакционной смеси едва ли будут иметь различный уровень флуоресценции, однако в разных сериях реактивов могут отличаться концентрации компонентов и поэтому высока вероятность различного уровня флуоресценции. Таким образом, ошибка, влияние которой в некоторых случаях можно не заметить, в других может обусловить большое количество недостоверных результатов.

Еще одной ошибкой, связанной с неправильным приготовлением фоновых пробирок, является добавление в них полимеразы. Это может произойти как случайно, так и вследствие того, что лаборант не до конца понимает, почему полимеразу добавлять не нужно. Здесь могут быть два варианта развития событий: если в тест-систему не входит внутренний контроль или в качестве отрицательного контрольного образца используется буфер, не прошедший выделения, и если в тест-систему входит внутренний контроль, который находится под парафином, и/или отрицательный образец проходит стадию выделения. В первом случае добавление полимеразы может существенно не сказаться на результате, однако и в этом случае есть риск контаминации как положительным, так и внутренним контролем. Во втором случае все отрицательные значения оказываются недостоверными. Обнаружить ошибку не представляется проблемой, поскольку нормировочные значения оказываются очень высокими, близкими к 10', а значения флуоресценции в некоторых пробирках существенно ниже 1.

Проблема контаминации возникает при неправильной организации работы лаборатории или при неаккуратном обращении с положительными образцами. Так, при использовании гель-электрофореза в качестве метода детекции комната для его проведения обязательно должна иметь отдельный вход и систему вентиляции. В противном случае вероятность того, что ампликоны из открывающихся пробирок будут попадать в другие помещения, очень высока. Это может привести к тому, что со временем все больше исследуемых образцов на часто встречающиеся инфекции будут оказываться положительными. При этом на первых этапах такого загрязнения отрицательный контроль может оставаться чистым, поскольку появление ложноположительных результатов носит статистический характер.

В случае флуоресцентной детекции пробирка не открывается и теоретически вероятность контаминации близка к нулю, однако возможность ее открытия не исключена. Поэтому лучше, если амплификация и детекция будут проводиться в отдельной комнате, тогда в случае непредвиденной ситуации контаминированной окажется одна комната.

Еще одна ошибка, приводящая к контаминации образцов, связана с неаккуратным обращением как с клиническими пробами, так и с положительными контрольными образцами и стандартами. Некоторые специалисты лаборатории с целью экономии при внесении в большое количество пробирок одного и того же вещества используют один наконечник. Это возможно, если пробирки пустые или их содержание одинаково (подготовка амплификационных пробирок). Однако, если в пробирке находится образец, как, например, при пробоподготовке, то при внесении даже одного и того же раствора в разные пробирки увеличивается риск переноса ДНК - так называемая кросс-контаминация. С целью предотвращения кросс-контаминации также рекомендуется для внесения образцов, потенциально содержащих ДНК, использовать наконечники с фильтрами.

Помимо этого при неаккуратной работе есть риск внести в пробу ингибиторы (например, тальк с перчаток).

Ошибки при интерпретации результата

Говоря об ошибках при интерпретации результатов, имеет смысл рассмотреть различные способы детекции.

При детекции с использованием гель-электрофореза есть риск принять неспецифические фрагменты за специфичные, если они близки по длине и нет возможности четко и однозначно сравнить с положительным контролем и, в идеале, с маркером длин.

В случае нарушений правил работы существует риск контаминации уже на этапе детекции. Такого рода контаминация отслеживается в случае, если полоса наблюдается в заведомо отрицательной пробе, однако она неотличима от контаминации в лаборатории и требует повторной проверки всех образцов.

Одной из ошибок интерпретации, связанной с использованием метода флуоресцентной детекции по конечной точке, является невнимательное отношение к нормировочным значениям фоновых пробирок и к значениям флуоресценции в отрицательных пробах. Так, при неправильном хранении зонды в фоновых пробирках могут разрушаться, и нормировочные значения существенно увеличиваются (от нескольких часов до нескольких дней), при этом значения флуоресценции в образцах оказываются в большей или меньшей степени занижены. Главным критерием достоверности полученных результатов в данном случае могут служить отрицательные пробы. При отсутствии расхождений между фоновыми и амплификационными пробирками отрицательные образцы имеют значения флуоресценции близкие к единице или, в редких случаях, чуть выше. Если значения флуоресценции в одном или нескольких образцах или отрицательном контроле существенно ниже единицы, с большой долей вероятности можно утверждать, что фоновые пробирки не соответствуют данному исследованию, в этом случае необходимо их поменять.

Помимо вышеприведенного примера, может случиться так, что фоновая флуоресценция возрастает в амплификационных пробирках, в то время как в фоновых пробирках флуоресценция остается неизменной. Такая ситуация может возникнуть когда амплификационные пробирки хранятся при комнатной температуре. В этом случае будет увеличиваться содержание положительных результатов с низкими значениями флуоресценции. Результаты при этом получаются такие же, как при контаминации в лаборатории, однако в данном случае все низкие значения флуоресценции будут примерно одинаковы, что ц случае контаминации встречается достаточно редко, поскольку маловероятно, что во все отрицательные пробирки попадет равное количество постороннего материала. Подобного легко избежать, если менять фоновые пробирки раз в месяц-полтора, в этом случае, как правило, не успевает появиться достаточно большая разница между уже готовыми фоновыми и амплификационными пробирками.

Наиболее частая ошибка при исследовании методом ПЦР с де
текцией результатов в режиме реального времени связана с прибором, который при больших колебаниях флуоресценции может зафиксировать ложноположительные результаты.

В связи с этим необходимо проводить анализ индивидуальной кривой. Пороговая линия должна пересекать индивидуальную кривую и области начала экспоненциального роста, и это не один из множества пиков колебания флуоресценции. Также прибор может выдать ложноотрицателъный результат в случае, если на первых циклах ПЦР по каким-то причинам произошло существенное уменьшение флуоресценции. Эту ошибку можно обнаружить при анализе исходных кривых флуоресценции. Если образец положительный, то на исходной кривой будет виден четкий экспоненциальный рост. Для большей достоверности можно сравнить такую сомнительную кривую с кривой заведомо положительной. Все положительные кривые имеют сходный угол наклона, и уровень флуоресценции при выходе на плато заметь" но отличается от колебаний и отрицательных образцах.

3.Ошибки постаналитического этапа ПЦР-диагностики

Ошибки на завершающем, постаналитическом этапе связаны с неверной интерпретацией врачом результатов ПЦР-анализа вследствие ошибочных представлений об инфекционном агенте или о возможностях метода.

Например, контрольное исследование на хламидиоз через 1 неделю после окончания курса антибиотиков даст положительный результат. Врач сделает вывод о неэффективности проведенной терапии. Однако окончательный вывод можно сделать не ранее чем через 4-6 недель, после того, как сменится эпителиальный слой, в котором паразитирует данный микроорганизм. Более ранняя диагностика может показать неверный результат, поскольку в клетках эпителия еще сохраняются погибшие микроорганизмы. Важно учитывать специфичность используемых тест-систем. Так, например, пациент с предполагаемым диагнозом "респираторный хламидиоз" направляется на исследование. При постановке ПЦР используется видоспецифическая тест-система для выявления ДНК С. Trachomatis- результат исследования отрицательный. Однако врач не должен снимать предполагаемый диагноз, поскольку инфекция может быть вызвана другими видами хламидий, например С. рneumoniа, С. ресоrum, С. psitaci,которые не диагносцируются данной тест-системой. То есть при назначении ПЦР-исследования врач должен очень четко представлять границы специфичности применяемых тест-систем.

Вместе с тем несовпадение результатов различных методов исследования не говорит об ошибке. Зачастую ПЦР-исследование дает положительный результат, в то время как ИФА - отрицательный. Несовпадение результатов исследований может объясняться, например, периодом "серологического окна".

В случае обратных результатов исследований возможен "иммунологический след" - остаточный уровень антител, который у некоторых людей может сохраняться многие месяцы и даже годы после выздоровления, либо при проведении ПЦР не учитывается видоспецифичность тест-систем.

Приведенные примеры показывают, что для получения качественных результатов исследований необходимо четкое выполнение правил работы на всех этапах клинической лабораторной диагностики и тесная взаимосвязь специалистов ПЦР-лаборатории с врачами-клиницистами.

Читайте также: