Окраска костной ткани по шморлю

Содержание темы

В гистологии, цитологии и эмбриологии существует много методов исследования.

Здесь рассматриваются лишь те, которые связаны со световой и электронной микроскопией мёртвых (фиксированных) клеток и тканей .

1.1. Световая микроскопия

1.1.1. Устройство микроскопа

1. Оптическая система включает объектив и окуляр.

а ) Объектив (1) - это система линз, вставляемая в тубус (2) снизу и непосредственно направляемая на объект (отсюда - и название).

Схема - строение светового микроскопа.

в) Результирующее увеличение микроскопа - произведение увеличений объектива и окуляра, например:

г) Таким образом, функция оптической системы -

а) Источник света (4) может быть встроен в микроскоп, а может находиться и вне микроскопа (пример - обычная настольная лампа).

в) Конденсор (6) состоит из линз, которые фокусируют лучи света на препарате. Поднимая и опуская конденсор (с помощью винта), можно настраивать фокусировку лучей.

г) Диафрагма (7) вмонтирована в конденсор; это система непрозрачных пластинок с отверстием посередине.

а) С колонкой связаны макро- и микрометрический винты .

1.1.2. Приготовление гистологического препарата

а) срезы органов (толщиной 5-15 нм),
б) мазки (крови, костного мозга и т.д.) и отпечатки (напр., селезёнки),
в) плёнки (брюшины, мягкой мозговой оболочки), или тотальные препараты

Чаще всего используются срезы.

2. Приготовление препарата обычно включает 4 следующих этапа:

а) взятие и фиксация материала,
б) обезвоживание и уплотнение материала,
в) приготовление срезов,
г) окрашивание препаратов и заключение в консервирующую среду.

1.1.2.1. Взятие и фиксация материала

2. Фиксация производится для предупреждения процессов аутолиза (самопереваривания) тканей.
Это достигается путём денатурации (коагуляции) белков .

1.1.2.2. Обезвоживание и уплотнение материала

2. Предварительно образцы обезвоживают (иначе гидрофобный уплотнитель не сможет проникнуть в ткань).

а) Для этого их “проводят” по батарее спиртов -

б) Т.к. парафин не растворим и в этаноле, образцы выдерживают потом в смеси этанол-ксилол и в чистом ксилоле.

3. Заливка : помещают образцы в смесь ксилол-парафин и затем в жидкий парафин

1.1.2.3. Приготовление срезов

1. Кубики вставляют в специальный прибор - микротом , - служащий для приготовления срезов.

2. а) С помощью микрометрической механической системы объектодержатель вместе с кубиком перемещается за каждый шаг на определённое расстояние (напр., 10 мкм).

б) А микротомный нож, направляемый под углом к поверхности парафинового блока, срезает с него тонкой слой органа (срез) заданной толщины.

1.1.2.4. Окрашивание препаратов и заключение в консервирующую среду

(Этот ряд кончается водой в том случае, если затем используется водорастворимый краситель.)

2. Для окрашивания предметные стёкла со срезами

1.1.2.5. Мазки и тотальные препараты: особенности приготовления

2. В подобных случаях, а также при приготовлении мазков, из 4-х перечисленных в п. 1.1.2. этапов опускаются два -

1.1.3. Методы окрашивания гистологических препаратов

1.1.3.1. Типы красителей

Все красители, используемые в гистологической технике, подразделяются на 3 типа.-

Существует большое количество различных способов окраски.
Те из них, которые встречаются в нашем курсе, перечислены ниже.

1.1.3.2. Общие методы окраски

б) Сочетает основной и кислый красители.

в) Поэтому позволяет выявить почти все клетки и многие неклеточные структуры.

2. Ядра пр иобретают сине-фиолетовый цвет,
цитоплазма - желтовато-розовый цвет.

2. Структуры приобретают коричневато-серый цвет.

3. Хорошо выявляются

1.1.3.3. Выявление неклеточных структур соединительной ткани

а) Краситель - смесь растворов пикриновой кислоты и кислого фуксина.

1. Краситель является трёхцветным: это смесь

а также двух кислот.

2.а ) Коллагеновые волокна соединительной ткани окрашиваются в тёмно-синий цвет ;

1. а) Препарат обрабатывают аммиачным раствором серебра, а затем - восстановителями.

б) В итоге, выделяющееся серебро осаждается на определённых волокнах соединительной ткани. –

1. Используется для окраски костей и дентина.

б) Краситель - раствор тионина.

3 . а) Стенки костных полостей и канальцев (выстланные сетью коллагеновых волокон) окрашиваются в тёмно-коричневый цвет;

1.1.3.4. Окраска клеток соединительной ткани и крови

б) Отличия же от приготовления срезов таковы:

1.1.3.5. Выявление элементов нервной системы

2. При окрашивании срез последовательно обрабатывают растворами

1.1.4. Гистохимические методы исследования

а) Гистохимические методы основаны на специфической реакции между химическим реактивом и определённым компонентом препарата.
б) Образующийся продукт реакции имеет окраску, отличную от окраски исходного реактива.

1. Реактив (как отмечалось, - смесь двух красителей:
метилового зелёного и пиронина.

2. а ) А. Пиронин специфически окрашивает РНК в красный цвет .
Б. Поэтому на препарате ядрышки (в составе ядра) и рибосомбогатые участки цитоплазмы имеют красный цвет.

б) Другие структуры ядра (помимо ядрышек) - зелёные .

1. Основной реактив - фуксинсернистая кислота (реактив Шиффа).

1. Реактив - Ш ифф-пер и одная к ислота (выделенные буквы и составляют аббревиатуру ШИК ).

2. Периодат способствует образованию в субстрате альдегидной группы, которая взаимодействует с реактивом Шиффа.

1. При взаимодействии толуидинового синего с веществами, содержащими много кислотных групп, наблюдается метахромазия

- изменение окраски с синей на фиолетовую и красную.

2. Подобным свойством обладают, в частности, компоненты аморфного вещества соединительной ткани - гликозамингликаны

(являющиеся, как известно, гетерополисахаридами с высоким содержанием кислотных радикалов).

1.1.5. Просмотр препаратов

1.1.5.1. Срез; окраска гематоксилин-эозином

1. На снимке мы видим внутреннюю поверхность тонкой кишки с находящимися на ней кишечными ворсинками ( 1).

2. а) Ядра клеток (2) - базофильны и окрашены гематоксилином в фиолетовый цвет.

1.1.5.2. Тотальный препарат: окраска судан III - гематоксилином

1. а) Препарат является тотальным.

б) Это означает, что перед нами - не срез органа, а участок сальника, растянутого на предметном стекле.

1.1.5.3. Срез после декальцинации; окраска по Шморлю

1. В процессе изготовления препарата костный материал подвергнут декальцинации (п. 1.1.3.3).

2. Применённый метод окраски позволяет выявить
стенки костных полостей (1) и канальцев (2) , окрашивающиеся в тёмно-коричневый цвет благодаря высокому содержанию здесь коллагеновых волокон.

1.1.5.4. Срез; окраска по Маллори

1. В методе Маллори используются 3 красителя (п. 11.3.3), что делает картину многоцветной.

2. На снимке - женская половая клетка (ооцит), находящаяся в фолликуле яичника.

3. Цитоплазма (1) клетки окрашена в розовый ,

окружающая её блестящая оболочка (2 ) - в голубой ,

1.2. Электронная микроскопия

Если в световом микроскопе увеличение составляет 100-1000 раз,
то в электронном микроскопе - 10.000 –100.000 раз (и выше), т.е. примерно в 100 раз больше .

1.2.1. Принцип работы электронного микроскопа

1.2.1.1. Особенности:
электронная волна, электромагнитные "линзы"

1.2.1.2. Ход лучей

1. а) Источником электронов служит катод (1) ,

а движущей силой - разность потенциалов между катодом и анодом (2).

б) Анод расположен вблизи катода и имеет отверстие посередине, через которое проскакивают электроны.

б) вторая катушка (5) - в качестве объектива (принимает лучи, расходящиеся от образца),

1.2.2. Особенности приготовления препарата

2. а) Заливку производят в специальных формах,

б) затвердевание смеси происходит путём её полимеризации в термостате,

б) Эти соли осаждаются на фосфолипидах мембран и поглощают электроны.

Обработка и окрашивание костной ткани

для гистологических исследований.

Декальцинация.

Прежде чем приступить к декальцинации, кость, как и любую ткань, необходимо подвергнуть фиксации. Выбор фиксатора зависит от целей и характера исследования. Так, для озорных препаратов и выявления фибриллярных компонентов костной ткани применяют чистый формалин (15-20% Раствор), в то время как для цитологических исследований предпочтительней сложные фиксаторы, также содержащие формалин, ибо он уменьшает степень набухания волокнистых структур, при последующей обработке ткани ( например , фиксатор Штиве: насыщенный водный раствор дихлорида ртути - 76мл, формалин 20 мл, ледяная уксусная кислота- 4 мл)

Для фиксации следует выпиливать лобзиком небольшие кусочки кости (толщиной 0.5-1 см), так как из-за высокой плотности ткани фиксатор проникает медленно. Срок фиксации зависит от толщины кусочка (не менее 48 часов)

При окончании фиксации объект тщательно промывают в проточной водопроводной воде или спирте (например, после сложных фиксаторов, содержащих дихлорид ртути), так как при последующей обработке кислотами могут образоваться труднорастворимые осадки. После этого с целью обезжиривания препарата проводят через ряд спиртов повышающейся концентрации (50, 70 и 96%), а затем доводят до воды через спирты нисходящей концентрации.

Декальцинация достигается обработкой костной ткани с помощью декальцинирующих жидкостей, обладающих свойствами растворять неорганические соли, не повреждая структурные элементы кости.

При декальцинации следует придерживаться следующих основных правил:

1. Применять большое количество декальцинирующей жидкости и сменять ее ежедневно (объем жидкости должен превышать объем объекта не менее чем в 50-70 раз);

2. Декальцинируемый объект помещать в верхним слое жидкости, чтобы обеспечить опускание на дно растворяющихся солей (подвешивание кусочков на нитке или стеклянном сите);

3. Проводить декальцинацию до полного удаления минеральных солей (но не передерживать материал в жидкостях, так как это приводит к набуханию фибрилл и ухудшению окрашиваемости структур)

Декальцинация считается полной тогда, когда объект становиться мягким и режется ножом легко и без хруста. Ход процесса можно проверить по степени погружения в объект препаровальной иглы. Сгибать препарат и надавливать на него не рекомендуется, так как это приводит к повреждению тонких структур кости.

Декальцинация в в одном растворе АЗОТНОЙ КИСЛОТЫ (5-7,5 %) ЯВЛЯЕТСЯ НАИБОЛЕЕ РАСПРОСТРАНЕННЫМ СПОСОБОМ. Для приготовления рабочего раствора в мерную колбу наливают 5-7,5 мл химически чистой концентрированной азотной кислоты (плотность 1,40) и доливают до 100 мл дистиллированной воды (раствор можно готовить в прок в больших количествах, рассчитав общую потребность). Применять более низкие и более высокие концентрации растворов для декальцинации кости не рекомендуется, так как первые вызывают набухание, а вторые- повреждение клеточных структур. Более высокие концентрации (до10%) используют лишь для декальцинации зубов.

Налив нужное количество жидкости в подходящий стеклянный сосуд, в нее подвешивают подготовленный к декальцинации кусочек кости. Раствор меняют ежедневно до наступления полной декальцинации. Срок декальцинации зависит от свойств объекта (плотность, величина) и концентрация азотной кислоты. Средняя продолжительность декальцинации небольших кусочков компактной костной ткани 10-12 суток.

По окончании декальцинации для устранения набухания волокнистых структур препарат подвешивают на 24 часа в 5% раствор СУЛЬФАТА НАТРИЯ Na2SO4 или ЛИТИЯ Li2SO4 ( в случае отсутствия таких солей кость следует поместить в 96% спирт) и лишь после этого тщательно промывают в течение 1-2 суток в проточной водопроводной воде.

Можно сократить срок получения декальцинированной кости, поместив выпиленный кусочек непосредственно в 5% раствор трихлоруксусной кислоты, содержащий 10-20% формалина. Эта смесь одновременно фиксирует и декальцинирует. Маленькие кусочек средней плотности можно декальцинировать за 3-5 дней. После декальцинации после декальцинации промывают в спирте (НИВКОЕМ СЛУЧАЕ НЕ В ВОДЕ. )

Существует ряд других способов декальцинации, но все они основаны на одном и том же принципе и требуют соблюдение изложенных выше общих правил.

После декальцинации костную ткань можно резать на замораживающем микротоме, а также заливать в целлоидин или целлоидин - парафин обычным путем. Заливка в парафин не рекомендуется, так как он плохо пропитывает декальцинированную кость.

Наиболее распространенный метод окрашивания срезов декальцинированной костной ткани –по Шморлю (ТИОНИНПИКРИНОВАЯ КИСЛОТА).

А- насыщенный раствор тионина в 50% спирте.

Б-1% водный раствор фенола.

В- насыщенный раствор пикриновой кислоты.

Перед употреблением сливают 1 часть раствора (А) с 10 частями раствора (Б). Находящееся в воде срезы переносят на 10 мин в полученную смесь, после чего споласкивают в дистиллированной воде и помещают на 30-60 с в насыщенный раствор пикриновой кислоты. Затем срезы вновь споласкивают в дистиллированной воде и дифференцируют в 70% спирте до получения темно-красной окраски. После этого их переносят в 96% спирт, в котором продолжают дифференцировку (под контролем микроскопа до тех пор, пока общий фон среза не приобретет коричневый (или болотный) цвет, а костные клетки и их отростки - красный. Окрашенные срезы затем проводят через 96% и абсолютный спирт, карбол - ксилол, ксилол и заключают в полистирол.

Если срезы плохо окрашивается из-за длительной декальцинации в азотной кислоте, его нужно предварительно поместить на 2 3 ч в о,5% аммиачную воду, после чего хорошо промыть, в дистиллированной воде и затем окрасить.

Этот метод наиболее простой, но окрашивание эластических волокон менее интенсивное, чем другими красителями.

Приготовление красителя

1 г орсеина растворяют в 100 мл 98 % или 100 % спирта и добавляют 1 мл крепкой (молекулярная масса 1,15 — 1,19) соляной кислоты. Краситель можно хранить 1 — 2 мес.

Или 1 г орсеина на 100 мл 70 % спирта нагревают до 60 С, после охлаждения добавляют 1 мл крепкой соляной кислоты и фильтруют.

Методика окраски

1. Ополаскивают в 70 % спирте.

2. Окрашивают орсеином в течение 30 — 80 мин при 37 С (в термостате) или 18 — 24 ч при комнатной температуре.

3. Дифференцируют в 1 % солянокислом спирте (под контролем микроскопа) до просветления фона и выявления эластических волокон, обычно от нескольких секунд до 2 — 3 мин.

4. Промывают водой, проводят через спирты и ксилол.

Результат

Эластические волокна буро-красные, коричневые, остальные структуры - слабо-розовые. Иногда коллагеновые волокна окрашиваются слишком интенсивно, а при дифференцировке ослабляется окраска эластических волокон. В этих случаях следует уменьшить концентрацию орсеина (растворяют до 0,4 г на 100 мл спирта) и РН раствора путем добавления нескольких капель соляной кислоты, что позволяет усилить избирательность окрашивання.

Метод окраски Шморля

Метод выявления остеоцитов путем окраски препаратов костной ткани тионином с пикриновой или фосфорно-вольфрамовой кислотой после декальцинации кости.

Этапы

· Фиксация материала в формалине, заливка парафином и получение срезов в микротоме.

· Промывание срезов в дистиллированной воде.

· Помещение срезов на 5 — 20 мин в реакционную смесь.

· Промывание срезов в проточной воде.

· Окраска по Ван Гизону (противоокраска).

· Быстрое обезвоживание в спиртах возрастающей концентрации, проведение через ксилол, заключение в канадский бальзам.

Краситель – раствор тионина - основной тиазиновый краситель, хорошо растворимый в спирте, хуже в воде; применяется для окраски нервной ткани по Нисслю, для выявления клеточных ядер.

Результат

Стенки костных полостей и канальцев (выстланные сетью коллагеновых волокон) окрашиваются в тёмно-коричневый цвет, остальной фон - светло-коричневый.

Окраска клеточных структур

Окрашивание мазков по Романовскому

В красящих смесях Романовского и сходных с ним прописей Гимзы, Райта, Лейшмана в качестве ядерных краси телей используют тиазины. В их ряду - тионин-анилиновый краситель и его моно-, ди-, три- и тетраметилпроизводные азур С, азур А и азур В, метиленовый синий - широко применяются в цитологических исследованиях как ценные ядерные красители со свойством метахромазии для эксфолиативной и пункционной цитологии, для клеток крови, костного мозга, окрашивания бактерий. Сочетание тиазинов с красителями эозиновой группы дает известную много вариантность методов. Красители типа Романовского, названные по именам авторов, которые стремились добиться стабильности состава тиазинов (Гимза, Лейшман, Дженнер, Май-Грюнвальд, Мак Нил, Райт и др.), в принципе дают сходные результаты окрашивания.

Краситель: азур 2 - эозин

Фиксацию мазков проводят чистым метанолом, окрашивание продолжают всего 30-45 мин, для заключения под покровное стекло используют кедровое масло.

Результаты

Цитоплазма лимфоцитов окрашивается в светло-синий цвет, их ядра - в цвета от интенсивно пурпурного до фиолетового, ядра моноцитов в более светлый пурпурно-красный, их цитоплазма в мутный голубовато-серый, грануломеры тромбоцитов в красный, гиаломеры - в голубой, гранулы базофилов - в интенсивный сине-фиолетовый цвет, гранулы эозинофилов - в оранжево-розовый, а нейтрофильных лейкоцитов - в цвета от пурпурного до фиолетового.

Референтным признается метод Романовского, состоящий из азура В и эозина Y. Азур-эозиновые красители позволяют четко определять ранние некробиотические изменения в клетках, поскольку обычный светло-голубой оттенок цитоплазмы резко меняется на светло-розовый. В синий цвет обычно окрашиваются ядра, бактерии, риккетсии, тигроид и рибонуклеопротеиды, в голубовато-фиолетовый - гранулы тучных клеток и базофилов, цитоплазма зрелых клеток - от голубого до фиолетового и бледно-лилового цвета. цитоплазма клеток в состоянии некроза и некробиоза - ярко-розовая, секреторные гранулы ацинарных клеток (под желудочной железы, слюнных желез) от розового до красного. Амилоид, фибрин окрашиваются в розовый цвет, цитоплазма мышечных волокон, коллоид щитовидной железы - в серовато-синий, кератин - ярко-голубой. Эритроциты оранжево-красного цвета. Методы на основе азур-эозина широко используются для идентификации клеток воспалительного экссудата.

Заключение

На данный момент известно огромное количество методов окраски. Я рассказал в своем реферате об основных методах (по ван Гизону, по Маллори, импрегнация серебром, орсеином, по Шморлю, азур2 – эозином и по Романовскому). Остальные, являются их модификациями, заключающихся в замене того или иного красителя на более современный, что позволяет лучше окрасить определенные структуры или же ускорить время приготовления препарата.
Список литературы

· “Руководство-атлас по гистологии, цитологии и эмбриологии” - С. Л. Кузнецов, Н. Н. Мушкамбаров, В. Л. Горячкина

Информация о документе
Дата добавления:
Размер:
Доступные форматы для скачивания:

1.1.3. Методы окрашивания гистологических препаратов

1.1.3.1. Типы красителей

Все красители, используемые в гистологической технике, подразделяются на 3 типа.-

Кислоты и кислые соли :

эозин (искусственная краска; название - от греч. эос - заря);

а) Окрашиваемые структуры называются оксифильными (имеющими сродство к кислым красителям).

б) Это белковые компоненты цитоплазмы и неклеточные структуры (коллагеновые волокна).

гематоксилин
(точнее, продукт его окисления - гематеин);

а) Красящиеся структуры -
базофильные (сродство к основным красителям).

б) Это структуры, богатые нуклеиновыми или иными кислотами -
ядра,
рибосомы,
аморфный компонент межклеточного вещества.

Смесь двух красителей:

основного (азур 2) и
кислого (эозин).

а) Структуры, воспринимающие кислые красители, окрасятся эозином;
пример - специфические гранулы в эозинофильных лейкоцитах.

б) Ядра всех клеток окрашиваются азуром 2.

Судан III,
судан IV

Суданом окрашиваются жировые капли (в которых он растворяется).

1.1.3.2. Общие методы окраски

1. Окраска
гематоксилин -эозином

1.а) Самый распространённый метод окраски.
б) Сочетает основной и кислый красители.
в) Поэтому позволяет выявить почти все клетки и многие неклеточные структуры.

2. а) Ядра приобретают сине-фиолетовый цвет,
б) цитоплазма - желтовато-розовый цвет.

3. Замечание: используемый гематоксилин готовится по методу Эрлиха: окисляется до гематеина калийными квасцами.

2. Окраска железным
гематоксилином
(по методу Генденгайна)

1. Препарат предварительно обрабатывают (протравляют) железноаммиачными квасцами, а потом обрабатывают гематоксилином.

2. Структуры приобретают коричневато-серый цвет.

3. Хорошо выявляются
структуры ядра,
границы клеток,
мышечные волокна.

1.1.3.3. Выявление неклеточных структур соединительной ткани

1. Окраска по методу ван Гизона

а) Краситель - смесь растворов пикриновой кислоты и кислого фуксина.
б) Коллагеновые волокна (содержащиеся в межклеточном веществе соединительной ткани) окрашиваются в ярко-красный цвет,
а элементы других тканей (напр., мышечные волокна) - в жёлтый цвет.

2. Окраска по методу Маллори

1. Краситель является трёхцветным: это смесь кислого фуксина, анилинового синего, оранжевогo G, а также двух кислот.

2.а) Коллагеновые волокна соединительной ткани окрашиваются в тёмно-синий цвет ;
б) многие другие структуры (ядра, мышечные волокна, эритроциты) - в оранжевый или красный цвет.

1. а) Препарат обрабатывают аммиачным раствором серебра, а затем - восстановителями.
б) В итоге, выделяющееся серебро осаждается на определённых волокнах соединительной ткани. –

2 . а) Ретикулярные (аргирофильные) волокна приобретают чёрный цвет,
б) коллагеновые волокна - коричневый ,
в) ядра клеток - светло-коричневый .

4. Окраска орсеином

а) Эластические волокна соединительной ткани окрашиваются в тёмно-красный цвет ;
б) остальные структуры - в слабо-розовый цвет.

5. Окраска
гематоксилин-
пикрофуксином

а) Эластические волокна окрашиваются пикриновой кислотой в жёлтый цвет ,
б) коллагеновые волокна - в красный цвет,
в) ядра клеток - окрашиваются гематоксилином в тёмно-фиолетовый цвет.

6. Окраска
по методу
Шморля

1. Используется для окраски костей и дентина.

2. а) Предварительно кусочки материала подвергают декальцинации (с помощью кислоты),
а затем выдерживают в растворе алюмокалиевых квасцов.
б) Краситель - раствор тионина.

3. а) Стенки костных полостей и канальцев (выстланные сетью коллагеновых волокон) окрашиваются в тёмно-коричневый цвет;

б) остальной фон - светло-коричневый.

1.1.3.4. Окраска клеток соединительной ткани и крови

1. Окраска азур 2 – эозином

а) Базофильные элементы окрашиваются азуром 2 в тёмно-синий,
б) а оксифильные - в светло-красный цвет.

2. Окраска мазков по методу Романовского

1. а) Краситель - тот же, что и в предыдущем случае (азур 2 – эозин).

б) Отличия же от приготовления срезов таковы:

А. фиксацию мазков проводят чистым метанолом;
Б. окрашивание продолжают всего 30-45 мин, а не 12-14 ч;
В. для заключения под покровное стекло используют кедровое масло, а не канадский бальзам.

2. а) Эритроциты приобретают бледко-красный цвет,
б) цитоплазма лейкоцитов - голубой или синий цвет,
в) цитоплазматические гранулы окрашиваются в зависимости от их природы.

1.1.3.5. Выявление элементов нервной системы

1.Импрегнация
нитратом
серебра

1. Особенности предварительной обработки препарата.-
а) Фиксацию материала в формалине проводят
не менее 7 дней .
б) Уплотнение образца осуществляют не путём заливки в парафин (или целлюлозу),
а путём замораживания .
III. Срез готовят на специальном замораживающем микротоме.

2. При окрашивании срез последовательно обрабатывают растворами
азотнокислого серебра,
формалина,
аммиачного серебра.

3. а) Элементы нервной системы (волокна, клетки и т.д.) окрашиваются в чёрный цвет,
б) окружающие ткани - в светло-коричневый цвет.

2. Окраска
толуидиновым
синим по методу Ниссля

1. Толуидиновый синий окрашивает умеренно базофильные соединения в синий цвет .

2. С его помощью в цитоплазме нервных клеток обнаруживаются глыбки базофильного вещества (т.н. субстанция Ниссля).

3. Окраска
метиловым зелёным- пиронином по методу Браше

1. Метод служит для выявления РНК.

2. а) Как и предыдущий метод, относится к гистохимическим методам исследования.
б) Поэтому подробней описывается ниже.

1.1.4. Гистохимические методы исследования

1. Реактив (как отмечалось, - смесь двух красителей:
метилового зелёного и пиронина.

2. а) А. Пиронин специфически окрашивает РНК в красный цвет.
Б. Поэтому на препарате ядрышки (в составе ядра) и рибосомбогатые участки цитоплазмы имеют красный цвет.

б) Другие структуры ядра (помимо ядрышек) - зелёные.

3. Обычно делают и контрольный препарат, который перед окрашиванием обрабатывают рибонуклеазой.

1. Основной реактив - фуксинсернистая кислота (реактив Шиффа).

2. ДНК-содержащие структуры окрашиваются в пурпурно-красный цвет.

Используются различные реакции; в том числе:

а) с бромфеноловым синим (у белков - тёмно-фиолетовая окраска);
б) со смесью нингидрин-реактив Шиффа (белки приобретают красный цвет).

1. Реактив - Шифф-периодная кислота (выделенные буквы и составляют аббревиатуру ШИК).

3. На препарате ШИК-положительные компоненты (например, гранулы гликогена) имеют тёмно-красный цвет.

3б)
Гликозамин-
гликаны

Реакция с толуидиновым синим.

1. При взаимодействии толуидинового синего с веществами, содержащими много кислотных групп, наблюдается метахромазия - изменение окраски с синей на фиолетовую и красную.

2. Подобным действием обладают, в частности, компоненты аморфного вещества соединительной ткани - гликозамингликаны.

4. Нейтральный
жир

Реакция с суданом III (о которой уже упоминалось).

Капли жира в жировой клетке окрашиваются в яркий оранжево-красный цвет благодаря растворению в них красителя.

1.1.5. Просмотр препаратов

1. Препарат - тонкая кишка собаки.
Окраска гематоксилин-эозином.

1. На снимке мы видим внутреннюю поверхность тонкой кишки с находящимися на ней кишечными ворсинками (1).

2. а) Ядра клеток (2) - базофильны и окрашены гематоксилином в фиолетовый цвет.

б) Цитоплазма (3) оксифильна и окрашена эозином в розовый цвет.

2. Препарат - белая жировая ткань.
Тотальный препарат сальника. Окраска судан III -гематоксилином.

1. а) Препарат является тотальным.
Это означает, что перед нами - не срез органа, а участок сальника, растянутого на предметном стекле.

б) Таким образом, из 4-х перечисленных в п. 1.1.2. этапов приготовления препарата в данном случае опускаются два -

уплотнение материала и
приготовление среза (с последующим освобождением от уплотнителя).

в) Остаются фиксация, окраска и заключение в консервирующую среду.

2. а) Жировые клетки на препарате заполнены крупными каплями жира (1), которые окрашены суданом Ш в ярко-оранжевый цвет.

б) Клеточные ядра (2), окрашенные гематоксилином в фиолетовый цвет, оттеснены к периферии клетки.

3. Препарат - пластинчатая костная ткань. Поперечный срез трубчатой кости. Окраска по методу Шморля.

1. В процессе изготовления препарата костный материал подвергнут декальцинации (п. 1.1.3.3).

2. Применённый метод окраски позволяет выявить
стенки костных полостей (1) и канальцев (2), окрашивающиеся в тёмно-коричневый цвет благодаря высокому содержанию здесь коллагеновых волокон.

3. В костных полостях находятся тела костных клеток (остеоцитов), а в канальцах - отростки этих клеток.

4. Препарат - срез яичника кролика. Окраска по методу Маллори.

1. В методе Маллори используются 3 красителя (п. 11.3.3), что делает картину многоцветной.

2. На снимке - женская половая клетка (ооцит), находящаяся в фолликуле яичника.

3.а) Цитоплазма (1) клетки окрашена в розовый,
б) окружающая её блестящая оболочка (2) - в голубой,
в) а ядра фолликулярных клеток (3) - в фиолетовый цвет.

1.2. Электронная микроскопия

1.2.1. Принцип работы электронного микроскопа

1. В электронном микроскопе образец облучается не видимым светом, а пучком
электронов.
Длина же электронной волны значительно меньше, чем световой.
Соответственно, такая волна “чувствует” меньшие препятствия: разрешающая способность микроскопа оказывается выше.

2. Конструктивная же особенность состоит в том, что в электронном микроскопе в качестве линз используются электромагнитные катушки.

Схема - ход лучей в световом (I) и электронном (II) микроскопе. Внешний вид электронного микроскопа (III).

3. Ход лучей в электронном микроскопе, в принципе, таков же, как в световом.-

а) Источником электронов служит катод (1),

а движущей силой - разность потенциалов между катодом и анодом (2).

б) Анод расположен вблизи катода и имеет отверстие посередине, через которое проскакивают электроны.

в) Чтобы их поток далее не ослабевал, в тубусе микроскопа создаётся высокий вакуум.

4. а) Одна электромагнитная катушка (3) служит в качестве конденсора (фокусирует пучки на образце (4)),
б) вторая катушка (5) - в качестве объектива (принимает лучи, расходящиеся от образца),
в) а третья катушка (6) - в качестве окуляра, или проекционной линзы.

5. Лучи, проходящие через последнюю катушку, попадают далее на люминесцентный экран (7) и вызывают его свечение в месте падения электронов.

1.2.2. Особенности приготовления препарата

1. Взятие материала и
фиксация

Материал берут очень маленькими кусочками (порядка 1 мм 3 ),
а фиксацию осуществляют обычно в 2 стадии:

а) вначале глутаральдегидом (стабилизация белков),
б) затем - четырёхокисью осмия (стабилизация фосфолипидов и контрастирование ткани).

2. Уплотнение материала

1. Образцы, как обычно, обезвоживают,
а для их дальнейшего уплотнения используют эпоксидные смолы .

2. а) Заливку производят в специальных формах,
б) затвердевание смеси происходит путём её полимеризации в термостате,
в) и затвердевшие блоки имеют вид маленьких свечей.

3. Приготовление
срезов

1. Срез делают с помощью ультратома;
их толщина - 30-50 нм (ср. с микротомными срезами - 10.000 – 20.000 нм).

2. Затем их переносят на сеточки (играющие роль предметного стекла).

4. Окрашивание
срезов

1. а) Окрашивание срезов сводится к их контрастированию с помощью солей тяжёлых металлов (свинца, вольфрама, урана).
б) Эти соли осаждаются на фосфолипидах мембран и поглощают электроны.

2.Поэтому соответствующие места клетки выглядят более тёмными.

Читайте также: