Организация работы при исследованиях методом пцр материала инфицированного

1.1 . Настоящие методические указания устанавливают требования к помещениям лабораторий и порядку проведения в них работ с патогенными биологическими агентами (ПБА) III - IV групп патогенности с использованием методов, основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР).

1.2 . Методические указания регламентируют выполнение исследований методом ПЦР с применением оборудования и тест-систем, разрешенных к применению на территории Российской Федерации в установленном порядке.

1.3 . Методические указания определяют принципы организации работы лабораторий, использующих метод полимеразной цепной реакции, на этапах выполнения ПЦР-анализа.

3.1 . Полимеразная цепная реакция представляет собой процесс многократного увеличения числа копий (амплификация) фрагмента ДНК-мишени (кДНК), катализируемый in vitro термостабильной ДНК-полимеразой, и позволяет обнаружить специфичный участок генома биологического агента.

3.2 . ПЦР обладает высокой чувствительностью, специфичностью, обеспечивает возможность работы практически с любым видом биологического материала и объектами окружающей среды, позволяет выполнять анализ в течение 4 - 8 ч. Аналитическая чувствительность тест-систем для выявления ДНК (РНК) микроорганизмов методом ПЦР составляет 1 ´ 10 2 - 1 ´ 10 4 м.к. (геномэквивалент/мл), специфичность - 85 - 100 %.

3.3 . По результатам анализа выдают предварительный ответ о наличии в пробе специфических участков (фрагментов) ДНК или РНК, имеющих гомологию с определенным участком генома возбудителя того или иного инфекционного заболевания, а также о наличии в исследуемом материале генетических маркеров или генетически модифицированных ДНК.

3.4 . Проведение исследований методом ПЦР сопряжено с необходимостью обеспечения соблюдения правил биологической безопасности, а также определенных требований к организации и проведению анализа с целью предотвращения контаминации исследуемых проб нуклеиновыми кислотами и получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов.

4.1.1 . Работу с ПБА III - IV групп патогенности методом ПЦР проводят только при наличии в организации лицензии на деятельность, связанную с использованием возбудителей инфекционных заболеваний человека, и санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения соответствующих работ в лаборатории, выданных в установленном порядке.

4.1.3 . В лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения работ с ПБА III группы патогенности, допускается проведение исследований методом ПЦР (без предварительного накопления возбудителя) с целью диагностики бруцеллеза, парентеральных вирусных гепатитов, ВИЧ-инфекции, возбудители которых относятся ко II группе патогенности.

4.2 . Требования к помещениям ПЦР-лаборатории

4.2.3 . ПЦР-лаборатория должна включать следующий минимальный набор рабочих зон:

• приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала;

• приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР;

• детекции продуктов амплификации методом электрофореза или ГиФА.

4.2.4 . В ПЦР-лабораториях необходимо также предусмотреть наличие вспомогательных помещений: комнаты ведения учетных документов или ординаторской (комнаты персонала) * ; кабинета заведующего лабораторией * ; раздевалки для сотрудников ** ; комнаты приема пищи ** ; туалета ** ; подсобных (складских) помещений ** .

* Помещения могут быть объединены.

** Помещения могут быть общими с другими подразделениями учреждения.

4.2.5 . Необходимо наличие автоклавной комнаты для обеззараживания исследуемого материала. Она может быть общей с другими подразделениями учреждения при условии соблюдения требований биологической безопасности.

4.2.6 . Помещения для выполнения работ на этапах ПЦР-анализа должны быть боксированными (боксы с предбоксами).

4.2.7 . В зоне приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала проводят прием ПБА, пробоподготовку (сортировку, маркировку, центрифугирование и др.), хранение и первичную инактивацию остатков биоматериала дезинфицирующими средствами. Зону приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала располагают в комнате приема материала или в отдельном боксированном помещении. Здесь же можно проводить прием и обработку проб для исследования другими методами (бактериологическими, вирусологическими, иммунологическими и т.д.), при условии выделения отдельного оборудованного рабочего места для ПЦР-анализа.

4.2.8 . Зону выделения нуклеиновых кислот размещают в отдельном помещении. При организации ПЦР-лаборатории на базе действующей микробиологической лаборатории допускается выделение НК в помещениях, в которых проводят другие виды исследований, кроме генно-инженерных работ и работ по накоплению ПБА. В этом случае в помещении организуют рабочую зону для выделения нуклеиновых кислот (НК), в которой располагают ПЦР-бокс или бокс биологической безопасности. В ПЦР-боксе (или боксе биологической безопасности) для выделения НК не допускается проведение других работ.

4.2.9 . В зоне приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР производят приготовление ПЦР-смеси, внесение в пробирку для ПЦР выделенных препаратов ДНК или кДНК, обратную транскрипцию РНК и амплификацию ДНК или кДНК. Помещение для приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР должно быть отдельным. Приготовление реакционных ПЦР-смесей проводят в ПЦР-боксе.

4.2.10 . При необходимости этап выделения НК может быть совмещен в одном помещении с этапом приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР при наличии в нем отдельных ПЦР-боксов (боксов биологической безопасности) - для подготовки реакционных ПЦР-смесей и для выделения НК.

4.2.11 . Зону детекции продуктов амплификации располагают в отдельном помещении, по возможности оснащенном ПЦР-боксом.

4.2.12 . При необходимости одновременного использования для детекции продуктов амплификации метода электрофореза и метода гибридизационного анализа следует выделить в помещении детекции отдельную рабочую зону для проведения гибридизационного анализа. В этом случае оборудование и принадлежности для каждого вида детекции маркируют применительно к каждой зоне. Не допускается использовать для проведения гибридизационного анализа пипетки и посуду, предназначенные для электрофореза.

4.2.13 . Планировочные решения и размещение оборудования должны обеспечивать поточность движения исследуемого материала. Следует полностью исключить воздухообмен между помещением детекции продуктов амплификации и другими помещениями.

4.2.15 . При строительстве новых или реконструкции имеющихся ПЦР-лабораторий помещения оборудуют приточно-вытяжной или вытяжной вентиляцией. Разница в давлении воздуха в помещениях ПЦР-лаборатории достигается за счет различий в кратности воздухообмена в них. Кратность воздухообмена должна соответствовать значениям, приведенным в таблице.

[youtube.player]

Проведение исследований методом ПЦР допускается на базе действующих лабораторий при условии организации в лаборатории самостоятельных или выделенных в составе других функциональных помещений рабочих зон, соответствующих этапам ПЦР-анализа.

ПЦР-лаборатория должна включать следующий минимальный набор рабочих зон:

• приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала;
• выделения ДНК/РНК;
• приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР;
• детекции продуктов амплификации методом электрофореза или ГиФА.

Важно отметить, что в случае применения метода ПЦР в режиме "реального времени" (real-time PCR) нет необходимости в детекции продуктов амплификации методом электрофореза. Следовательно, рабочую зону в помещении лаборатории для электрофореза можно не выделять.

В ПЦР-лабораториях необходимо также предусмотреть наличие вспомогательных помещений: архив (для учетных документов), комнату для персонала, кабинет заведующего, раздевалки для сотрудников, комнаты приема пищи, санитарных комнат (туалет), подсобных помещений (склад).

В идеальном варианте необходимо иметь автоклавную комнату для обеззараживающего исследуемого материала. Она может быть общей с другими подразделениями учреждения при условии соблюдения требований биологической безопасности.

Помещения для выполнения работ на этапах ПЦР-анализа должны быть боксированными (боксы с предбоксами). В зоне приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала проводят прием материала, пробоподготовку (сортировку, маркировку, центрифугирование и прочее), хранение и первичную инактивацию остатков биоматериала дезинфицирующими средствами. Зону приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала располагают в комнате приема материала или в отдельном боксированном помещении. Здесь же можно проводить прием и обработку проб для исследования другими методами (иммунология, например), при условии выделения отдельного оборудованного рабочего места для ПЦР-анализа.

Зону выделения ДНК/РНК размещают в отдельном помещении. При организации ПЦР-лаборатории на базе действующей лаборатории допускается выделение ДНК/РНК в помещениях, в которых проводят другие виды исследований, кроме генно-инженерных работ. В этом случае в помещении организуют рабочую зону для выделения ДНК/РНК, в которой располагают ПЦР-бокс или бокс биологической безопасности. В ПЦР-боксе для выделения ДНК/РНК не допускается проведение других видов работ!

В зоне приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР производят приготовление ПЦР-смеси, внесение в пробирку для ПЦР выделенных препаратов ДНК/РНК или кДНК, обратную транскрипцию РНК и амплификацию ДНК или кДНК. Помещение для приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР должно быть отдельным. Приготовление реакционных ПЦР-смесей проводят в ПЦР-боксе.

При необходимости этап выделения ДНК/РНК может быть совмещен в одном помещении с этапом приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР при наличии в нем отдельных ПЦР-боксов - для подготовки реакционных ПЦР-смесей и для выделения ДНК/РНК.

Зону детекции продуктов амплификации располагают в отдельном помещении, по возможности оснащенном ПЦР-боксом. При необходимости одновременного использования для детекции продуктов амплификации метода электрофореза и метода гибридизационного анализа следует выделить в помещении детекции отдельную рабочую зону для проведения гибридизационного анализа. В этом случае оборудование и принадлежности для каждого вида детекции маркируют применительно к каждой зоне. Не допускается использовать для проведения гибридизационного анализа пипетки и посуду, предназначенные для электрофореза.

Планировочные решения и размещение оборудования должны обеспечивать поточность движения исследуемого материала. Следует полностью исключить воздухообмен между помещением детекции продуктов амплификации и другими помещениями.

ПЦР-лабораторию оборудуют водопроводом, канализацией, электричеством и отоплением. Все помещения ПЦР-лаборатории обеспечивают достаточным естественным и искусственным освещением.

При строительстве новых или реконструкции имеющихся ПЦР-лабораторий помещения оборудуют приточно-вытяжной или вытяжной вентиляцией. Разница в давлении воздуха в помещениях ПЦР-лаборатории достигается за счет различий в кратности воздухообмена в них. Кратность воздухообмена должна соответствовать значениям, приведенным в таблице:

Кратность воздухообмена (м³/час)
Наименование помещения	приток	вытяжка
зона приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала	5	6
зона выделения ДНК/РНК	5	6
зона приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР	5	5
зона детекции продуктов амплификации	5	7

При необходимости в ПЦР-лаборатории могут быть установлены кондиционеры.

Внутреннюю отделку помещений выполняют в соответствии с их функциональным назначением. Поверхности стен, пола и потолка в лабораторных помещениях должны быть гладкими, без щелей, легко обрабатываемыми, устойчивыми к действию моющих и дезинфицирующих средств. Полы не должны быть скользкими. Лабораторная мебель должна иметь покрытие, устойчивое к действию моющих и дезинфицирующих средств. Поверхность столов не должна иметь трещин и швов. Помещения лаборатории должны быть непроницаемы для грызунов и насекомых. ПЦР-лабораторию обеспечивают средствами пожаротушения.

Помещения на всех этапах ПЦР-анализа оборудуют бактерицидными лампами в соответствии с "Методическими указаниями по применению бактерицидных ламп для обеззараживания воздуха и поверхности в помещениях". Бактерицидные лампы в помещениях ПЦР-лаборатории устанавливают из расчета 2,5 Вт/куб.м.

[youtube.player]

УСТРОЙСТВО И ПРАВИЛА РАБОТЫ ПЦР-ЛАБОРАТОРИИ

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

1.ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать;

2.два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента;

дезоксинуклеотидтрифосфаты (A, G, C, T);

4.ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы;

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1°C. Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Обычно при проведении ПЦР выполняется 20 - 35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94 - 96°C (или до 98°C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5 - 2 минуты, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией — разрушаются водородные связи между двумя цепями. Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2 - 5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров. Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от праймеров и обычно выбирается на 4 - 5°С ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5 - 2 минут. ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы наиболее активны при 72°C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 10 - 15 мин. Для успешного проведения анализа важно правильно собрать материал у пациента и правильно провести его подготовку. Известно, что в лабораторной диагностике большинство ошибок (до 70%) совершается именно на этапе пробоподготовки.

Требования к организации помещений для лаборатории ПЦР

Проведение исследований методом ПЦР допускается на базе действующих лабораторий при условии организации в лаборатории самостоятельных или выделенных в составе других функциональных помещений рабочих зон, соответствующих этапам ПЦР-анализа. ПЦР-лаборатория должна включать следующий минимальный набор рабочих зон:

1.Приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала;

3.Приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР;

4.Детекции продуктов амплификации методом электрофореза или ГиФА.

Важно отметить, что в случае применения метода ПЦР в режиме "реального времени" (real-time PCR) нет необходимости в детекции продуктов амплификации методом электрофореза. Следовательно, рабочую зону в помещении лаборатории для электрофореза можно не выделять.

В ПЦР-лабораториях необходимо также предусмотреть наличие вспомогательных помещений: архив (для учетных документов), комнату для персонала, кабинет заведующего, раздевалки для сотрудников, комнаты приема пищи, санитарных комнат (туалет), подсобных помещений (склад).

Помещения для выполнения работ на этапах ПЦР-анализа должны быть боксированными (боксы с предбоксами). Зону выделения ДНК/РНК размещают в отдельном помещении. При организации ПЦР-лаборатории на базе действующей лаборатории допускается выделение ДНК/РНК в помещениях, в которых проводят другие виды исследований. Помещение для приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР должно быть отдельным. Приготовление реакционных ПЦР-смесей проводят в ПЦР-боксе. ПЦР-лабораторию оборудуют водопроводом, канализацией, электричеством и отоплением. Внутреннюю отделку помещений выполняют в соответствии с их функциональным назначением. Поверхности стен, пола и потолка в лабораторных помещениях должны быть гладкими, без щелей, легко обрабатываемыми, устойчивыми к действию моющих и дезинфицирующих средств. Полы не должны быть скользкими. Лабораторная мебель должна иметь покрытие, устойчивое к действию моющих и дезинфицирующих средств. Поверхность столов не должна иметь трещин и швов. Помещения лаборатории должны быть непроницаемы для грызунов и насекомых. ПЦР-лабораторию обеспечивают средствами пожаротушения. Бактерицидные лампы в помещениях ПЦР-лаборатории устанавливают из расчета 2,5 Вт/куб.м [2].

[youtube.player]

Высокотехнологичные лабораторные методы диагностики дают возможность выявить множество заболеваний на самых ранних стадиях. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) — один из самых новых и точных способов диагностики. За его разработку ученый Кэри Муллис получил в 1993 году Нобелевскую премию. Сегодня этот метод хотя и считается экспериментальным, но уже широко и успешно применяется в медицине.

ПЦР-диагностика: суть подхода

Метод ПЦР использует принципы молекулярной биологии. Его суть заключается в применении особых ферментов, которые многократно копируют фрагменты РНК и ДНК возбудителей болезни, которые находятся в пробах биоматериала, например в крови.

После этого работники лаборатории сверяют полученные фрагменты с базой данных, выявляют тип возбудителя болезни и его концентрацию.

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, охлаждающем и нагревающем пробирки с пробами биоматериала. Нагрев и охлаждение необходимы для проведения репликации. Точность температурного режима влияет на точность результата.

Диагностические возможности метода ПЦР огромны, с его помощью можно выявить самые разные инфекции. Чаще всего ПЦР-метод применяют для диагностики:

• ВИЧ;
• герпеса;
• различных половых инфекций, в частности хламидиоза, уреаплазмоза, гарднереллеза, микоплазмоза и трихомониаза;
• кандидоза;
• гепатитов;
• мононуклеоза;
• листериоза;
• цитомегаловируса;
• туберкулеза;
• вируса папилломы человека;
• клещевого энцефалита.

Это далеко не полный список, метод ПЦР-анализа используется в разных областях медицины.

У диагностики методом ПЦР много плюсов:

Высокая чувствительность. Метод позволяет выявить возбудителя болезни даже при наличии нескольких молекул его ДНК, то есть на очень ранних стадиях, при хронической форме заболевания, а так же в случаях, когда болезнь никак себя не проявляет, протекая латентно.

Универсальность. Для проведения ПЦР анализа подходит почти любой биоматериал — от крови и слюны до клеток кожи.

Широкий охват. Исследование одного образца может выявить сразу нескольких возбудителей болезни.

Оперативность. Результат, как правило, готов через 5–7 часов, то есть получить заключение можно уже на следующий день после забора биоматериала.

Точность. Метод ПЦР практически никогда не дает ложноположительных или ложноотрицательных результатов, если была соблюдена технология проведения этого анализа.

Невысокая стоимость. По цене ПЦР-анализ сравним с любыми другими лабораторными анализами крови.

Однако следует понимать, что совершенных методов анализа не бывает. У ПЦР есть и минус — высокие требования к соблюдению технологии и к профессионализму лаборантов. Если образец был загрязнен, анализ может дать ложный результат. Поэтому проводить ПЦР-диагностику лучше только в самых лучших лабораториях, где внедрены системы контроля качества работы.

Для ПЦР-диагностики заболеваний на анализ берут разные виды биоматериала. Выбор зависит от типа инфекции. При анализе на ЗППП методом ПЦР берут соскоб или мазок из шейки матки или уретры, а также мочу. Для выявления герпеса, цитомегаловируса, гепатита, токсоплазмоза и ВИЧ на анализ берут кровь. При анализе на мононуклеоз и цитомегаловирус берут мазок из зева. Спинномозговая жидкость используется для анализа при поражениях нервной системы, для диагностики внутриутробных инфекций исследуются ткани плаценты, для выявления легочных инфекций — мокрота или плевральная жидкость.

Подготовка к ПЦР-диагностике напрямую зависит от типа биоматериала. Кровь сдается натощак утром. Моча также сдается утром, в лабораторных условиях, в стерильный контейнер. Перед сдачей мазка или соскоба из урогенитальной области нельзя вступать в половые контакты за несколько дней до исследования, не следует проводить спринцевания. Мазок или соскоб нельзя сдавать во время менструации и в течение 2-х дней после ее окончания.

Существует немало различных методик ПЦР-диагностики: ПЦР в реальном времени, секвенирование, пиросеквенирование, микрофлюидные технологии. Сейчас наиболее распространенным способом проведения анализа является ПЦР в реальном времени — этот метод практически не допускает ложноположительных результатов, к тому же срок обработки образцов при исследовании таким способом сокращается — результат можно получить уже через час.

Для пациента результат ПЦР-анализа может быть либо положительным, либо отрицательным. Отрицательный означает, что следов враждебной ДНК не обнаружено и человек здоров. Положительный подразумевает наличие фрагментов ДНК возбудителя болезни — это значит, что человек заражен и ему требуется лечение.

Нередко ПЦР-диагностика дает положительный результат, но пациент не чувствует никакого недомогания, а признаки болезни отсутствуют. Однако это означает не ошибку, а очень раннюю стадию заболевания. В этом случае необходимы дополнительные исследования и лечение. Если заболевание было диагностировано на столь ранней стадии, следует начинать терапию как можно скорее, ведь чем дальше зайдет болезнь, тем сложнее будет ее вылечить.

ПЦР-диагностика инфекций невероятно точна — она позволяет обнаружить возбудителя болезни, даже если в пробе находится всего одна-единственная молекула его ДНК. Именно это качество сделало ПЦР-анализ одним из эффективнейших диагностических инструментов как для определения наличия инфекции, так и для контроля за ходом лечения.

[youtube.player]