Риккетсии окраска по романовскому гимзе

Техника. Препарат обрабатывают I N рас­твором НС1 7 мин при подогревании до 60С. После про­мывания мазок окрашивают по Романовскому.

Микроскопическая картина. Ядерные эле­менты темно-красные, цитоплазма розовая.

Окраска риккетсий Метод Романовского-Гимза

Окраска по Романовскому-Гимза является одним из ос­новных методов при изучении морфологии риккетсий, хламидий, спиро­хет, простейших, а также при исследовании форменных элементов крови.

Техника. Краситель Романовского-Гимза состоит из азура, эозина и метиленового синего. Непосредственно перед упот­реблением к 10 мл дистиллированной воды нейтральной реакции прибавляют 10 капель краски и тотчас же наливают на препа­рат, предварительно фиксированный жидким фиксатором, на один час. Затем краску сливают, препарат промывают водой, высуши­вают на воздухе и микроскопируют. Окрашивание происходит бы­стрее (30-40 минут), если препарат с краской поместить в термостат при 37С. К 10 мл дистиллированной воды нейтраль­ной или слабо щелочной реакции непосредственно перед окра­ской препарата прибавляют 10 капель краски и тот час же на­ливают на фиксированный препарат (или погружают препарат в стаканчик с краской). Через 1 час краску сливают, препарат промывают водой, высушивают на воздухе и исследуют. Если по­местить препарат с краской в термостат при 37º, то окрашива­ние происходит быстрее (30-40 минут).

Результаты окрашивания зависят от свойства воды, поэтому следует проверять ее реакцию.

Микроскопическая картина. Риккетсии окрашиваются в ро­зово-красный цвет, ядра эукариотических клеток – в красно-фиолетовый, а цитоплазма – в голубой.

Метод Здродовского

Техника. Препарат тонким слоем наносят на стекло, фик­сируют на пламени и окрашивают разведенным карболовым фуксином (10-15 капель фуксина на 10 мл дважды дистиллиро­ванной воды) в течение 5 минут; затем препарат слегка обес­цвечивают погружением на 1-3 секунды в слабую (0,01%) соля­ную кислоту, промывают водой и докрашивают в течение 30 секунд 1% раствором водного метиленового синего. Тонкий мазок фиксируют на пламени горелки. Окраску производят разведенным карболовым фуксином (10-15 капель фуксина на 10 мл дис­тиллированной воды) в течение 5 минут. Окрашенный препарат промывают водой, а затем обесцвечивают в растворе органиче­ской или минеральной кислоты (0,5% лимонная кислота, 0,01% соляная кислота) в течение 2-3 секунд. Затем препарат про­мывают водой и докрашивают 0,5% раствором метиленовой синьки в течение 0,5 минуты.

Микроскопическая картина. Риккетсии окрашиваются в ру­биново-красный цвет, в то время как клетки хозяина обес­цвечиваются кислотой и дополнительно окрашиваются в голубой (протоплазма) или синий (ядра) цвет (рис.20).

Окраска хламидий

Микроскопическая картина. На разных стадиях развития способность воспринимать окраску у хламидий меняется:

- “Элементарные тельца” (инфекционные частицы) окрашива­ются краской Гимза в пурпурный цвет.

- “Первоначальные тельца” (неинфекционные частицы) окра­шиваются по Гимза в синий цвет.

- Полностью сформировавшиеся зрелые внутриклеточные включения окрашиваются краской Гимза в пурпурный цвет (рис.21).

Микроскопическая картина. Окраска по Граму дает вариа­бельные результаты. Поэтому не имеет диагностического значения.

Окраска водным разбавленным раствором Люголя

Придает внутриклеточным формам хламидий коричневый цвет из-за гликогеноподобной оболочки частиц.

Микроскопическая картина. Исследование нативных препа­ратов не дает результата. Окрашивают препарат из куль­туры после агаровой фиксации: кусочек среды с колонией по­мещают на предметное стекло и накрывают покровным стеклом с каплей спиртового раствора метиленового синего и азура, за­тем препарат высушивают.

Методы окраски спирохет делятся на две группы: методы позитивной окраски, когда окрашивается сама клетка, и методы негативной окраски, когда окрашивается фон препарата, а спирохета остается бесцветной.

Из методов позитивной окраски наиболее употребителен метод Романовского-Гимза.

Техника. См. выше. Особенностью техники окрашивания препаратов спирохет является длительность окраски – в течение 12-15 часов.

Микроскопическая картина. Трепонемы окрашиваются в бледно-розовый, лептоспиры – розово-красный, а боррелии – сине-фиолетовый цвет.

Ускоренная модификация Шерешевского

Техника. 15-20 капель красителя Романовского-Гимза разводят в 10 мл 0,5-1% раствора глицерина в воде, разливают в 4-5 пробирок, каждую из которых последовательно нагревают на пламени горелки. Горячий раствор красителя наливают на препарат на 2 минуты, после чего краситель сливают и препарат заливают свежей порцией горячего раствора из следующей пробирки. Вся окраска занимает 8-10 минут.

Микроскопическая картина. См. метод Романовского-Гимза.

Окраска разведенным фуксином

Используется для окраски боррелий.

Реактив: фуксин Циля разводят 1:4 или 1:5. Краситель наносят на фиксированный мазок на 1-2 минуты.

Микроскопическая картина. В мазках крови боррелии окрашиваются в розово- красный цвет, эритроциты – в ярко-красный.

Серебрение по Морозову

Техника. См. выше.

Микроскопическая картина. Спирохеты окрашиваются в буро-черный цвет (рис.22).

Для негативной окраски спирохет используют несколько методов.

Негативный метод Бурри

Техника. См. выше.

Микроскопическая картина. На темно-сером тушевом фоне – бесцветные клетки.

Негативная окраска колларголом

Этот метод отличается простотой, доступностью и хорошей эффективностью.

Техника. На фиксированный мазок наливают на 3 минуты 2% раствор колларгола. После этого препарат ставят в наклонное положение (водой не смывают) и подсушивают.

Микроскопическая картина. На золотисто-оранжевом фоне отчетливо контурируется бесцветная спирохета.

Негативный метод Бурри

Техника. См. выше.

Микроскопическая картина. На темно-сером тушевом фоне – бесцветные клетки.

Техника. См. выше.

Микроскопическая картина. Клеточная цитоплазма окрашивается в голубой цвет, а ядра клеток и жгутики – в красно-фиолетовый цвет (рис.23).

Реактивы. Способ приготовления: 1% раствор щелочного метиленового синего на 0,5% растворе двууглекислого натрия наливают в сосуд таким образом, чтобы высота слоя жидкости не превышала 6 см, и нагревают при 100 С в течение часа. Затем жидкость охлаждают и фильтруют. Охлажденный фильтрат в тонком слое при искусственном освещении должен иметь пурпурно-красный оттенок. К 100 мл фильтрата добавляют 500 мл 0,1% водного раствора эозина. При смешивании обеих жидкостей образуется обильный осадок; последний отфильтровывают и высушивают. Полученный таким образом краситель растворяют в ступке в метиловом спирте в соотношении 0,1:60,0.

На сухой нефиксированный мазок наливают несколько капель красителя. Спустя 1 минуту прибавляют столько же капель дистиллированной воды. Через 2-3 минуты препарат промывают в воде около 0,5 минуты, пока он в тонком слое не приобретет розоватого оттенка.

Микроскопическая картина. Ядра простейших окрашиваются в вишнево-красный цвет, цитоплазма – в голубоватый, жгутики – в красный цвет.

Что такое риккетсии

К одним из самых маленьких по размеру бактерий относятся риккетсии (латинское название Rickettsia). Они могут выглядеть как кокковидные, палочковидные или полиморфные клетки.

В это семейство входят как бактерии-сапрофиты, так и микроорганизмы, способные вызывать специфические заболевания.

Общая характеристика риккетсий:

• являются облигатными внутриклеточными паразитами, биологически связаны с членистоногими;
• не растут на бесклеточных питательных средах, чем отличаются от большинства бактерий;
• характеризуются рядом отличий и особенностей во всех сферах жизнедеятельности в сравнении с другими бактериями;
• заболевания, чаще всего лихорадочные, вызываемые этими микроорганизмами, имеют специфическую клиническую картину;
• даже методы изучения эти бактерии имеют особенные – риккетсиологические.

По своим свойствам риккетсии занимают промежуточное положение между бактериями и фильтрующимися вирусами:

• по строению, ферментной активности и чувствительности к антибиотикам близки к бактериям;
• по способности существовать только как внутриклеточный паразит – к вирусам.

К риккетсиям относят 29 видов (май 2017 г.) микроорганизмов, и в большей своей части они не патогенны для млекопитающих. К наиболее известным патогенным видам относятся Rickettsia prowazekii (возбудитель сыпного тифа), Rickettsia conorii (возбудитель марсельской лихорадки) и другие.

Таксономия и классификация

Согласно современной классификации, таксономическое положение этих бактерий выглядит следующим образом: они принадлежат к домену Бактерии, типу Протеобактерии, классу Альфа-протеобактерии, порядку Rickettsiales, семейству Rickettsiaceae, к которому относятся три рода, содержащие виды, патогенные для млекопитающих.

К ним относятся:

Согласно общепринятой систематике, виды бактерий входят в состав рода.

К роду Rickettsia относятся восемь видов микроорганизмов, их принято подразделять на следующие группы.

Вшиво-блошиные сыпные тифы:

• Rickettsia prowazekii (риккетсии Провачека);
• Rickettsia typhi, Ber; H. Mooser (риккетсии Музера).

Клещевые пятнистые лихорадки:

• Rickettsia rickettsia;
• Rickettsia conorii;
• Rickettsia australis;
• Rickettsia sibirica;
• Rickettsia akari.

Японская речная лихорадка: Rickettsia tsutsugamushi (R. orientalis) – возбудитель лихорадки цуцугамуши (краснотелково-клещевая лихорадка).

Род Rochalimaea включает в себя Rickettsia quintana, возбудитель траншейной лихорадки.

К роду Coxiella относят Coxiella burnetii (риккетсии Бернета), вызывающие Ку-лихорадку.

Описание и морфология

Морфология риккетсий достаточно разнообразна, так как они относятся к плеоморфным бактериям – микроорганизмам, обладающим морфологической изменчивостью. Внешние условия способны оказывать большое влияние не только на размеры, но и на форму бактерий.

При благоприятных условиях риккетсии соизмеримы с крупными вирусами и имеют характерную палочкообразную форму (например, риккетсии Бернета) с размерами:

• ширина в среднем 0,5 мкм;
• длина от 0,4 до 2,0 мкм.

При наступлении неблагоприятных условий микробы могут изменять форму на кокки, нитевидные или клетки неправильного вида.

Строение клетки риккетсий соответствует нормам клеточного строения типичных прокариотов. В ней присутствует клеточная оболочка, протоплазма, ядерный материал. Как и все микробы, риккетсия не имеет ядра, а содержит ДНК, рибосомы и РНК. Наличие спор и капсул у этих бактерий не выявлено.

Нехарактерным для грамположительных, но типичным для грамотрицательных микроорганизмов принято считать наличие у бактерий (например, Rickettsia conorii) трехслойной мембраны и поверхностного микрокапсулярного слоя.

Характерная окраска – общая характеристика патогенных риккетсий:

• окрашивание по Граму отрицательное;
• окраска по Здродовскому насыщенно окрашивает микробы в рубиновый цвет, что позволяет легко их обнаружить на фоне синего клеточного ядра или голубой цитоплазмы;
• по Романовскому-Гимзе микроорганизмы окрашиваются в сиреневый цвет.

Исследования при помощи электронного микроскопа позволили выявить у некоторых видов рода Rickettsia волосовидные фимбрии (ворсинки на поверхности клетки), роль которых в физиологии этих микроорганизмов не выяснена.

Для морфологии и ультраструктуры риккетсий характерны ряд особенностей, отличающие их от других прокариотов:

• Клеточные стенки имеют капсулообразный слизистый покров.
• Наличие в значительном количестве ненасыщенных жирных кислот в составе мембраны, что нехарактерно для бактерий.
• В состав нуклеоида входит кольцевая хромосома.
• Хотя все риккетсии – внутриклеточные паразиты (ни о каком симбиозе или мутуализме нет и речи), их метаболизм независим от обменных процессов, протекающих в клетке-хозяине.
• Способность к индукции фагоцитоза посредством клеток эукариотов.
• Клетки бактерий обладают адгезивными свойствами, что способствует их креплению и колонизации чужого организма.
• Источником энергии для микробов является глутамат.

Риккетсии с вирусами и другими бактериями имеют как сходные черты, так и различия. Микробиологи считают их переходным звеном от вирусов к бактериям.

Биохимическая активность

Биохимическая активность риккетсий не выявлена. Реакция агглютинации риккетсий представляет собой специфическое взаимодействие агглютининов (антител) с целой клеткой, с образованием осадка (агглютината). Данная реакция применяется при серологическом методе исследования инфекционных болезней, а также при определении антигенной структуры микроба.

У бактерий выявлено два антигена:

• термостабильный групповой;
• термолабильный специфический.

Реакция пассивной гемагглютинации (непрямой РНГА), с использованием сухого антигена из риккетсий Провачека, является более чувствительной – в ней используют фиксацию антител на обработанных формалином эритроцитах.

Первым тестом при серодиагностике риккетсиозов была реакция агглютинации с протеями (Вейля-Феликса), исключение составляет лихорадка Скалистых гор, вызванная Rickettsia rickettsia.

Бактериальным токсином риккетсий является термолабильный эндотоксин. Ферментативные и биохимические свойства бактерий рода Rickettsia не выражены.

Особенности дыхания и питания

Группа микроорганизмов рода Риккетсии (Rickettsia conorii) по типу дыхания является аэробной и может развиваться только при наличии кислорода, в отличие от анаэробов, которым кислород для жизнедеятельности не нужен.

По типу питания представители рода Rickettsia являются хемоорганотрофами, облигатными (нежизнеспособными вне организма-хозяина) паразитами.

Для этих микроорганизмов характерен тип питания, при котором источником энергии для бактериальной клетки служат химические соединения, а углеводы она получает из органических веществ.

Рост и размножение

Ростом клетки называют согласованное воспроизведение клеточных компонентов, приводящее к увеличению клеточной массы. Чаще всего бактерии растят на различных питательных средах, но, являясь внутриклеточными паразитами, риккетсии размножаются и растут только внутри клетки-хозяина.

Размножением бактерий принято называть увеличение количества клеток внутри одной популяции. Размножение риккетсий происходит посредством простого бинарного деления, и оно случается в значительной степени благодаря получению паразитами от клеток-хозяев насыщенных энергией соединений.

Весь жизненный цикл риккетсий состоит из двух стадий:

Являясь облигатными паразитами, риккетсии способны размножаться, только (за малым исключением) находясь в живых тканях. Единственным известным видом, способным к внеклеточному росту, является возбудитель траншейной лихорадки Rickettsia quintana.

Покоящаяся форма бактерий обеспечивает им наилучшую сохранность в окружающей среде.

Культивирование

В связи с паразитарной природой культивирование риккетсий, которые способны к росту исключительно внутри живой клетки, осуществляют на следующих препаратах:

• различных тканях;
• живых лабораторных животных;
• курином эмбрионе.

Особенности культивирования риккетсий связаны с тем, что микроорганизмы – облигатные паразиты, не осуществляют рост ни на каких бесклеточных питательных средах.

• Выращивание микроорганизмов с использованием методов культивирования осуществляют на переживающих (временно сохранена клеточная жизнеспособность) материалах. Они представляют собой мелкодисперсную взвесь тканей или частей органов в солевом (возможно, в питательном) растворе.
• Хорошо показал себя метод выращивания микробов на двенадцатидневном курином эмбрионе, с поддержанием температурного оптимума роста (37°С) в течение шести дней. Метод прекрасно зарекомендовал себя для приготовления диагностических препаратов и получения вакцин из риккетсий.
• Успешно культивируют микробы в организме живых белых мышей – наибольшее количество бактерий собирается в легких грызунов.
• Микроорганизмы культивируют, инфицируя вшей дисперсной взвесью активных микробов (метод Вейгля-Мосинга), а также выращивают на их личинках (Пшеничнов-Райхер).

Где обнаруживаются риккетсии

В естественных условиях микроорганизмы, не вызывая заболеваний, обитают в клеточных тканях членистоногих, таких как:

• клещи преимущественно из рода Dermacentor;
• блохи;
• вши.

Основываясь на природе переносчика бактерий, все риккетсиозы делят на две большие группы, к ним относятся:

• клещевая пятнистая лихорадка;
• сыпной тиф.

Иксодовые клещи, преимущественно из рода Dermacentor, являются основными переносчикам возбудителей заболеваний группы клещевой пятнистой лихорадки. Инфекция передается через слюну во время укуса. В обеих Америках клещи видов D. andersonii и D. variabilis являются основными переносчикам Пятнистой лихорадки. В Сибири иксодовые клещи видов D. nuttali и D. silvarum разносят Rickettsia sibirica – причину заражения человека сибирским (североазиатским) риккетсиозом.

Платяная вошь переносит риккетсии, вызывающие сыпной тиф (Rickettsia prowazekii), и выделяет эти микроорганизмы с фекалиями. Способ передачи возбудителя – трансмиссивный, через контаминацию (заражение через втирание фекалий в момент расчесывания укусов).

Возбудители риккетсиоза успешно размножаются в клетках любых позвоночных – грызунов, овец, крупного рогатого скота и человека.

Эпидемиология

Передача инфекции в человеческий организм происходит по трансмиссивному пути. Попадая в организм, патогенные риккетсии вызывают протекающие в тяжелой форме риккетсиозы.

В истории человечества переоценить значение риккетсиозов невозможно. Только от сыпного тифа, возбудителем которого является R. prowazekii, человечество страдало многие века, а число жертв исчислялось миллионами. Во время военных действий эпидемия тифа (его еще называли военной лихорадкой) зачастую оказывала решающее влияние на исход военных действий.

У больных тифом быстро развивалось недомогание и поднималась высокая температура с ознобом и тошнотой. При проявлении лихорадки платяная вошь сразу покидает хозяина и переходит к другому – таким образом переносчик разносит инфекцию.

Типичным представителем трансмиссивного пути передачи инфекции посредством инокуляции (заражение здорового человека при укусе инфицированным насекомым) является марсельская лихорадка. Марсельская, или средиземноморская, лихорадка (возбудитель Rickettsia conorii) является острым зоонозным риккетсиозом. Переносчиком инфекции является собачий клещ, резервуаром считают собак, шакалов, различных грызунов и ежей.

Марсельская лихорадка характеризуется спорадическим (случайным) и ярко выраженным сезонным характером (май-октябрь). Географически марсельская лихорадка отмечалась на Черноморском побережье, в Средиземноморье и Индии. В Астраханской области отмечается астраханская риккетсиозная лихорадка, которую считают подвидом марсельской.

Бактерии в организме клеща способны сохраняться долго – 1,5 года. Кусая животных, клещи выделяют бактерии со слюной и с фекалиями.

В чем опасность для человека

Инфекционные заболевания, вызываемые патогенными для человека риккетсиями, носят название риккетсиозы. Чаще всего причиной являются укусы клещей или вшей. У человека риккетсиозы протекают в виде лихорадок различной степени тяжести.

Патогенез (механизм возникновения и развития патологии) различных риккетсиозов по своей сути сходен:

• Возбудитель проникает через кожные покровы и начинает размножаться вблизи места проникновения, вызывая в этом месте воспалительную реакцию.
• Далее поражаются сосуды. Для болезней, вызванных возбудителями риккетсиоза, типично появление кожных высыпаний.
• К опасным и вредным факторам следует отнести поражение сердца и головного мозга.
• У больных, перенесших риккетсиоз, формируется специфический иммунитет, однако некоторые риккетсии (Rickettsia prowazekii) способны спустя много лет спровоцировать повторное заболевание.

Поэтому создание вакцины из инактивированных микробов имеет большое положительное значение для жизни человека.

Наиболее распространенные заболевания, вызываемые риккетсиями

Эпидемический сыпной тиф и болезнь Брила Rickettsia prowazekii Эндемический блошиный сыпной тиф Rickettsia typhi Лихорадка цуцугамуши Rickettsia tsutsugamushi Клещевые пятнистые лихорадки (марсельская) Rickettsia conorii Ку-лихорадка Coxiella burnetii

Тяжело протекает пятнистая лихорадка Скалистых гор, лихорадка цуцугамуши и сыпной тиф. Ку-лихорадка может протекать в латентной форме и не иметь симптомов риккетсиоза вообще.

Микробиологическая диагностика

Лабораторная диагностика различных инфекций, вызванных риккетсиями, основывается на выделении возбудителя. Наиболее эффективны исследования будут в острый период, до начала приема антибиотиков.

Патогенные риккетсии, вызвавшие заболевание, исследуют методами лабораторной диагностики. Используют несколько методов:

• серологические (РНГА, РСК, ИФА и другие);
• культуральные;
• молекулярно-генетические (ПЦР, изучение нуклеотидных последовательностей генов).

В результате исследования образцов в мазке может быть поставлен правильный диагноз, позволяющий исключить наличие других риккетсиозов и назначить правильное лечение.

Возможность изучать столь мелкие бактерии, как риккетсии, возникла только с появлением электронного микроскопа. История изучения этих микроорганизмов только начинается, и микробиологи открывают новые виды и новые свойства.

Образование высшее филологическое. В копирайтинге с 2012 г., также занимаюсь редактированием/размещением статей. Увлечения — психология и кулинария.

Готовят фиксированный препарат риккетсий, окрашивают в течение 5 минут разведенным фуксином Циля (10–15 капель на 10 мл дистиллированной воды), промывают водой. Затем мазок обрабатывают 0,5 % раствором лимонной кислоты или 0,01 % раствором хлористоводородной кислоты, промывают водой. Далее препарат окрашивают метиленовым синим в течение 1 минуты, промывают водой и высушивают. Риккетсии окрашиваются в красный цвет, цитоплазма клеток, в которых они паразитируют – в голубой, а ядра – в синий.

1. Какие морфологические особенности актиномицетов позволяют дифференцировать их от микроскопических грибов?

2. Какие методы окрашивания используют при микроскопировании актиномицетов?

3. Какие методы микроскопического исследования используют при изучении материала, содержащего спирохеты?

4. Какие морфологические особенности обуславливают тинкториальные свойства спирохет?

5. Какой краситель позволяет дифференцировать спирохеты разных родов?

6. Какие методы микроскопирования используют при изучении хламидий и риккетсий и почему?

1.4 Морфологические особенности и ультраструктура
микроскопических грибов и простейших

Познакомиться с особенностями морфологии и ультраструктуры микроскопических грибов и простейших, а также с особенностями приготовления и окрашивания их препаратов.

Микроскопические грибы (предмет изучения микробиологов) объединяют представителей трех классов: Zygomycetes, Ascomycetes и Deuteromycetes (включенные в отдел Eumycota). Определяют микроскопические грибы по способу спороношения и морфологии спороносцев. Спороношение лучше наблюдать в чашках Петри, рассматривая более тонкие части колоний при малом увеличении микроскопа в проходящем свете при опущенном конденсоре. Материал для микроскопического исследования (приготовления нативного препарата) осторожно переносят иглой с поверхности колонии в каплю воды на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и рассматривают под большим увеличением микроскопа. На препарате находят места, где можно рассмотреть устройство конидиеносцев, форму конидий. При исследовании фиксированных препаратов используют окраску сложными методами (По Романовскому-Гимзе, по Граму). Многие грибы (дрожжевые и дрожжеподобные) хорошо окрашиваются простыми методами анилиновыми красителями. При микробиологической диагностике дерматомикозов исследуемый материал (чешуйки кожи, волосы, соскоб ногтевых пластинок) помещают на предметное стекло в каплю 10% раствора гидроксида натрия и осторожно подогревают над пламенем спиртовки (можно в каплю спирта с глицерином без нагревания). Затем накрывают покровным стеклом и микроскопируют.

Зигомицеты имеют не разделенный на отдельные клетки многоядерный мицелий. К числу зигомицетов относятся мукоровые грибы Rhizopus, Phycomyces, Absidia. При рассмотрении с большим увеличением мицелий мукоровых грибов представляется как одна гигантская ветвистая клетка с большим количеством ядер. Еще более характерно спороношение мукора: приподнимающиеся спорангиеносцы заканчиваются наверху шаровидными образованиями – спорангиями, наполненными эндоспорами. Когда оболочка спорангия лопается, споры высыпаются наружу.

Аскомицеты (сумчатые грибы) образуют гифы, которые, в отличие от зигомицетов, разделены поперечными перегородками. Особенностью этих грибов является характерный орган спороношения – аск, в котором формируются аскоспоры. Значительная часть аскомицетов способна размножаться неполовым путем с помощью конидий. Аскомицетные дрожжи могут размножаться и половым путем, образуя аски с 2–8 спорами. Клетки дрожжей могут иметь овальную, шаровидную или удлиненную форму и достаточно крупные размеры (5–20 мкм). На определенных стадиях развития некоторые дрожжи образуют мицелий или псевдомицелий, на концах которого можно обнаружить споры.

Дейтеромицеты (несовершенные грибы) – разнообразная группа грибов с отсутствующей (или не обнаруженной) половой стадией размножения. К дейтеромицетам относят так называемые плесневые грибы - представителей родов Penicillum и Aspergillus, Trichoderma и некоторые дрожжи – Candida, Rhodotorula. Плесневые грибы имеют ветвящийся многоклеточный мицелий, хорошо различаются они по морфологии спороносных частей мицелия. У леечной плесени (р. Aspergillus) на приподнимающихся неветвистых конидиеносцах образуются бесцветные вздутия, на которых затем вырастают палочковидные клетки (стеригмы), на концах стеригм развиваются цепочками споры (конидиеспоры). У представителей р.Рenicillum (кистевики) конидиеносцы двукратно вилкообразно ветвятся, на концах первичных или вторичных веточек образуются конидиеспоры. Вся спороносящая часть мицелия этих грибов имеет форму кисточек.

Простейшие составляют большую группу одноклеточных гетеротрофных микроорганизмов, широко распространенных в природе. Размножение простейших осуществляется половым и бесполым путями, иногда оба способа воспроизводства составляют стадии единого жизненного цикла организма. Для микроскопического исследования простейших готовят нативные и фиксированные препараты. При прижизненном микроскопировании простейших отмечают характер движения. Фиксируют препараты простейших химическим способом (спирто-эфирной смесью) или в пламени спиртовки, окрашивают обычно по Романовскому-Гимзе или фуксином. При окрашивании по Романовскому-Гимзе ядра клеток окрашиваются в красный цвет, цитоплазма – в голубой или сиреневый.

Содержание лабораторной работы

Дата добавления: 2014-11-10 ; просмотров: 6448 . Нарушение авторских прав

1. Боррелии возвратного тифа в мазке крови больного при окраске по Романовскому-Гимзе на фоне форменных элементов крови выглядят как извилистые фиолетово-сиреневые нити, образующие от 3 до 8 завитков спирали. Завитки неравномерные, глубокие, шаги между завитками разные.

2. Бледная трепонема – возбудитель сифилиса – имеет вид спирали, напоминающей слегка растянутую пружину, имеющую от 6 до 14 завитков. Амплитуда завитков средняя, равномерная, шаг между завитками одинаковый. На концах пружина растянута, как бы, сильнее. При окраске по Романовскому-Гимзе окрашиваются в бледно-розовый цвет.

3. Лептоспиры имеют вид тонкой сильной закрученной пружины, имеют 14-22 витка спирали. Концы часто загнуты в виде крючков (завитки второго порядка), что может им придавать С- или S-образную форму.

4. При микроскопии окрашенных мазков из чистой культуры обратить внимание на сплетение тонких нитей (гифов) и их истинное ветвление. Переплетение гифов – мицелий.

В гистологическом срезе из органа при актиномикозе центральная часть друзы актиномицета представляет сплетение тонких нитей, окрашенных в темно-фиолетовый цвет. Отходящие на периферию концевые нити образуют колбовидные вздутия, окрашенные в розовый цвет.

5. В каплю вода на предметном стекле вносят небольшую частицу гриба и накрывают покровным стеклом. При микроскопии со слабой и сильной сухими системами обратить внимание на строение мицелия и органов плодоношения. Мицелий у мукора одноклеточный, несептированный, а у аспергилла и пеницилла - многоклеточный. Органы плодоношения: большой спорангиеносец с эндоспорами у мукора; конидиеносцы несептированные в виде лейки у аспергилла, септированные в виде кисти рук у пеницилла.

6. В препарате-мазке, окрашенном метиленовым синим, обратить внимание на форму дрожжевых клеток, наличие почковидных выпячиваний, а также на внутреннее строение клеток.

7. Дрожжеподобные грибы рода Candida являются одноклеточными микроорганизмами. Диаметр клеток варьирует в пределах 2-15 мкм. Клетки дрожжеподобных грибов одеты отчетливо заметной оболочкой, имеют цитоплазму, компактное ядро, вакуоли и разнообразные включения. Почкование является единственной формой размножения этих грибов. Форма почек округлая или слегка грушевидная.

Наружных спор типа конидий и внутренних типа аскоспор дрожжеподобные грибы не образуют, чем и отличаются от истинных дрожжей, аскомицетов и конидиальных организмов. Некоторые виды рода Candida образуют хламидоспоры, диаметр их достигает 10-20 мкм, форма округлая, оболочка толстая, двуконтурная. Хламидоспоры возникают на концах псевдомицелия из укрупненных клеток, называемых протохламидоспорами.

Настоящего мицелия дрожжеподобные грибы также не имеют. Образование нитей (филаментация) происходит за счет удлинения клеток и расположения их в длинные цепочки. Такие нити называются псевдомицелием и отличаются от истинного мицелия тем, что не имеют общей оболочки и перегородок, а состоят из длинных клеток, образующихся путем последовательного бокового или концевого почкования.

8. Патогенные простейшие – жгутиконосцы.

8.1. Трипаносомы являются патогенными простейшими, относящимися к типу Sarcomastigophora, имеющими очень характерную морфологию. В мазке крови больного африканской сонной болезнью при окраске по Романовскому-Гимзе имеют размеры 15-30 мкм в длину и 1,4-3,0 мкм в ширину, длина жгутика колеблется от 12 до 42 мкм. Удлиненно-овальное ядро лежит почти в середине клетки, на заднем конце располагается блефаропласт, от которого отходит жгутик. Последний волнообразно изогнут, между ним и телом трипаносомы натянута прозрачная ундулирующая мембрана. От противоположного конца клетки жгутик продолжается на некотором расстоя­нии свободно.

8.2. Лейшманиальная форма (амастигота, тканевая форма) обнаруживается в патологическом материале в сво­бодных макрофагах или клетках системы мононуклеарных фагоцитов. Амастиготы представляют собой мелкие овальные клетки размером 1-3 × 2-6 мкм с располо­женным сбоку овальным ядром и хорошо видимым палочковидной формы кинето-пластом. В просвете кишечника переносчика-москита и в культуре на питательной среде безжгутиковые формы превращаются в подвижные жгутиковые промастиготы (лептомонадная форма). Они имеют веретенообразную вытянутую форму, размеры 4-6 × 10-20 мкм и жгутик, отходящий от кинетопласта. При окра­ске по Романовскому-Гимзе цитоплазма амастиготы и промастиготы окрашивается в голубой или голубовато-фиолетовый цвет, а ядро, кинетопласт и жгутик – в крас­ный или красно-фиолетовый цвет.

9. В препаратах из крови больных трехдневной малярией найти различные стадии развития малярийного плазмодия: молодые шизонты кольцевидной формы с вакуолью в центре; зрелые шизонты неправильной амебовидной формы без вакуоли; делящиеся шизонты - в стадии меруляции; макфо- и микрогаметоциты правильной овальной формы. Обратить внимание на форму и размеры эритроцитов.

10. Токсоплазмы имеют форму полумесяца или напоминают доль­ки апельсина. Один конец токсоплазмы заострен, а другой - закруглен. Размеры их следующие: длина 4-7 микронов, ширина – 2-4 мкм. При окраске по методу Романовского-Гимзе цитоплазма токсоплазм окрашивается в голубой цвет; ядро, имеющее вид скопления гранул и сети, - в рубиново-красный цвет. Ядро располагается, как правило, в центре паразита, занимая около 1/4 части его тела.

11. Основной диагностический признак амёбиаза – обнаружение в испражнениях больного цист. Цисты правильной шаровидной формы, иногда слегка вытянуты, диаметр 8-15 мкм. Хорошо заметна бесцветная оболочка. Зрелые цисты содержат 4 ядра, незрелые цисты имеют од­но, два, три ядра и вакуоль, содержащую гликоген. В свежем препарате ядра едва за­метны; они хорошо выявляются при обработке препарата раствором Люголя.

12. Риккетсии – грамотрицательные прокариоты, не растущие на питательных средах, имеют мелкие размеры, форму палочек, кокковидную, иногда нитевидную. Жизненный цикл риккетсии зависит от жизнедеятельности клетки-хозяина и складывается из 2 ста­дий — вегетативной и покоящейся. Риккетсии, находящиеся в вегетативной стадии, имеют палочковидную форму, активно размножаются путем бинарного деления и обладают активной подвижностью. Риккетсии покоящейся стадии имеют сферическую форму и не размножа­ются. Обнаруживаются внутриклеточно окраской по Здродовскому.

1)элементарные тельца – мелкие (0,2-0,5 мкм) электронно-плотные шаровид­ные структуры, имеющие компактный нуклеоид и ригидную трехслойную клеточ­ную стенку;

2)инициальные (исходные), или ретикулярные, тельца – большие (0,8-1,5 мкм в диаметре) сферические образования, имеющие сетчатую структуру с тонкой кле­точной стенкой и фибриллярным нуклеоидом;

3)промежуточные тельца — промежуточная стадия между элементарными и ре­тикулярными тельцами.

Вегетативные формы размножаются путем бинарного деления внутриклеточно, но не инфекционны, когда выделяются из клетки-хозяина. Для микроскопического обнару­жения хламидии в инфицированных клетках (тканях) применяют различные спосо­бы окрашивания: Романовского-Гимзы, Кастенады, Маккиавелло и др. При окра­шивании по Романовскому-Гимзе они приобретают голубой или фиолетовый цвет. Однако хламидии хорошо видны и в неокрашенном состоянии при фазовоконтрастной микроскопии влажных препаратов под стеклом.

14. Микоплазмы – мелкие грамотрицательные прокариоты, лишённые клеточной стенки. Морфология их различна – шаровидные, вакуолизированные, нитевидные (нередко ветвящиеся), гранулярные (элементарные тельца) структуры. Обычно непо­движные, но некоторые виды обладают скользящей подвижностью.

Контрольные вопросы

Какое место занимают спирохеты в системе микроорганизмов?

Дайте классификацию спирохет.

Какое строение имеют спирохеты?

Какие метода микроскопии применяются для изучения морфологии спирохет?

Какой принцип микроскопии в темном поле?

Какое место занимают актиномицеты в системе микроорганизмов?

Как устроена друза актиномицета?

Каковы особенности морфологии актиномицетов?

Что такое спорангий, гифы, мицелий, конидии?

Чем отличаются мицелий и органы плодоношения мукоровых, аспергилловых и пеницилловых плесеней?

Чем отличаются споры грибов от спор бактерий?

Каковы строение и способы размножения дрожжей?

Каковы морфологические отличия дрожжеподобных грибов от дрожжей?

Почему дрожжеподобные грибы относятся к категории несовершенных грибов?

Какие грибы используются как продуценты антибиотиков?

Какова роль дрожжевых и дрожжеподобных грибов в медицине и промышленности?

Что такое хламидоспоры? Псевдомицелий?

У каких грибов имеет место их образование?

Дайте классификацию простейших.

Назовите патогенных представителей из каждого класса простей­ших.

Какое строение имеют трипаносомы?

Что такое блефаробласт, ундулирующая мембрана?

Какое строение имеют лейшманин?

Чем отличается лептомонадная форма лейшманий от лейшманиальной?

Какова классификация возбудителей малярии?

Какие отличительные признаки имеет комар - переносчик возбудители малярии?

Какие циклы развития имеет малярийный плазмодий?

Как и где протекает спорогония?

Как и где протекает шизогония?

Какова морфологии молодых и зрелых шизонтов, микро- и макро-гаметоцитов и стадии меруляции у возбудителя 3-х дневной малярии?

Каковы отличительные особенности возбудителей 4-дневной и тропической малярии?

Как изменяются эритроциты при различных формах малярии?

Какое строение имеет токсоплазма?

Что такое риккетсии, их морфологические и биологические особенности?

Что такое хламидии, их морфологические и биологические особенности?

Что такое микоплазмы, их морфологические и биологические особенности?

Приложение к ЗАНЯТИЮ 2.

Для дифференциации малярийных плазмодиев необходимо учитывать следующие признаки:

1. Размеры, форма и количество молодых шизонтов;

2. Размеры и форма зрелого шизонта;

3. Количество мерозоитов на стадии меруляции;

4. Размеры поражённых эритроцитов;

5. Морфология половых клеток - гаметоцитов.

При всех формах малярии молодой шизонт имеет форму "голубого перстня с рубиновым камнем". При тропической малярии в одном эри­троците может быть иногда 2-3 молодых шизонта одновременно, при остальных формах - только один.

При 3-дневной и тропической малярии зрелый шизонт имеет амёбовидную форму с зернистостью, при 4-дневной - лентовидную форму с узким ядром в виде рубиновой полосы сбоку.

На стадии меруляции при 3-дневной малярии в пораженном эритроците 16-20 мерозоитов, при 4-дневной – 6-8, при тропической – до 30.

Пораженный эритроцит увеличен в диаметре в 1,5-2 раза по сравнению с нормальным только при 3-дневной малярии.

Гаметоциты при 3-х и 4-дневной малярии крупные, занимают почти всю площадь эритроцита, у макрогамет ядро крупнее, у микрогамет – мельче. При тропической малярии гаметоциты имеют серповидную форму.

З А Н Я Т И Е3

Тема: Микроскопический метод диагностики инфекционных заболеваний. Морфология и ультраструктура микроорганизмов.

План занятия:

1. Знакомство с основными анилиновыми красителями и приготов­лением их растворов для окрашивания микроорганизмов.

2. Приготовление препарата-мазка, фиксирование его, окрашивание и микроскопия.

3. Сложные методы окраски микробов. Окраска по Граму с применением контролей и без них.

4. Включения у бактерий. Окраска зерен волютина по Нейссеру и по Лёффлеру.

5. Капсула у бактерий. Окраска капсул в препаратах-мазках из культуры палочки Фридлендера по методу Бурри-Гинса.

6. Споры у бактерий. Исследование спор в неокрашенных препа­ратах (раздавленная капля) и в препаратах-мазках, окрашенных вод­ным фуксином и по Клейну.

7. Изучение клеточных ультраструктур по электронограммам.

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет