Современные взгляды на дисбактериоз

В статье представлен современный взгляд на проблему дисбактериоза кишечника у детей, методы диагностики и их трактовка. Представлены собственные исследования характера микрофлоры кишечника по содержанию Ig-расщепляющей (протеолитической) активности фекалий у 133 детей с хронической гастродуоденальной патологией. Показано, что метод может быть полезным для характеристики кишечной микробиоты.

The article presents a modern approach to the problem of intestinal dysbiosis in children, methods of diagnosis and treatment. Presented own research into the nature of intestinal microflora on the content of Ig-cleaving (proteolytic) activity of fаeces in 133 children with chronic gastroduodenal pathology. It is shown that the method may be useful for the characterization of intestinal microbiota.

В настоящее время не вызывает сомнений тот факт, что изменение количественного и качественного состава микрофлоры кишечника практически всегда сопровождает любое неблагополучие в пищеварительной системе. Не отвечая критериям самостоятельной нозологической единицы, дисбактериоз кишечника является как следствием, так и одним из звеньев патогенеза патологии желудочно-кишечного тракта. С одной стороны, дисбактериоз кишечника всегда вторичен, поскольку возникает при любом изменении внутренней среды кишки вследствие действия патогенных факторов или прямого влияния на кишечную микрофлору. С другой стороны, дисбактериоз кишечника сам может приводить к повреждению кишечного эпителия, тем самым нарушая процессы пищеварения и усугубляя клиническое течение заболеваний желудочно-кишечного тракта.

В настоящей статье мы коснемся преимущественно диагностики нарушений микроэкологии толстого кишечника.

Толстая кишка представляет собой биотоп с высокой степенью обсемененности. В ней обнаружено более 400 видов микроорганизмов. Показано преобладание анаэробной микрофлоры, представленной на 90% бактероидами и бифидобактериями (главная флора). Аэробы составляют 10% — кишечные палочки, лактобациллы, энтерококки и др. (сопутствующая флора). Остаточная флора, составляющая менее 1% от общего количества микроорганизмов, представлена клебсиеллами, протеем, дрожжами, клостридиями, энтеробактером и цитробактером и др. Необходимо отметить одну особенность микрофлоры толстого кишечника — по мере продвижения от проксимальных отделов к дистальным увеличивается ее обсемененность. В проксимальном отделе общее число микроорганизмов составляет 10 8 -10 9 , а в прямой кишке — 10 11 -10 12 в 1 г кала. Более 90% массы кала приходится на бактерии. Нормальная микрофлора кишечника колонизирует как просвет кишечного тракта, так и поверхность слизистой оболочки кишки, формируя при этом пристеночную или мукозную микрофлору (М-микрофлора) и полостную микрофлору (П-микрофлора). Основную защитную функцию выполняет мукозная микрофлора [1, 2, 3, 4].

На сегодня существуют следующие методы лабораторной диагностики дисбактериоза кишечника [2, 4]:

1. Бактериологический анализ (определение состава фекальной микрофлоры, отражающей микробный состав лишь дистальных отделов кишечника — наиболее доступный метод, однако недостаточно точный).

2. Биохимический экспресс — метод определения протеолитической активности супернатантов фекалий.

3. Высоковольтный электрофорез на бумаге для обнаружения β-аспартилглицина, β-аспартиллизина, β-аланина, 5-аминовалериановой и γ-аминомасляной кислот и др.

4. Ионная хроматография, определяющая в фекалиях биогенные амины, желчные и карбоновые кислоты, ароматические соединения.

5. Газожидкостная хроматография для определения в фекалиях летучих жирных кислот.

6. Микроскопия фекального мазка.

В результате многолетнего изучения кишечной микрофлоры Р.В. Эпштейн-Литвак и Ф.Л. Вильшанская (1970) разработали методы лабораторной диагностики дисбактериоза, основанные на бактериологическом исследовании кала. Эти методы до сих пор существуют практически в неизмененном виде и широко применяются. Но у данного метода есть недостатки. Бактериологическое исследование кала отражает микробный состав полостной флоры лишь дистальных отделов кишечника. Обычно метод предоставляет информацию о 15-20 видах микробов. Число культивируемых кишечных анаэробных бактерий не превышает 7-50% от предполагаемого их истинного количества. В тени остается около 500 видов анаэробов и состав тонкокишечной микрофлоры. Невозможно идентифицировать бактериологическим методом простейших, грибы и вирусы. К тому же данный метод не дает качественной характеристики микробиоценоза. Хочется отметить, чтобы выделить всеми доступными современной медицине методами все возможные виды микрофлоры и составить их развернутую бактериологическую характеристику, потребовалось бы не менее одного года [5, 6]. В литературе также имеются сообщения, подтверждающие низкую диагностическую ценность исследования кала на дисбактериоз [7].

Ниже приведена классификация дисбактериоза кишечника, предложенная И.Б. Куваевой и К.С. Ладодо в 1991 году [8]. Данная классификация базируется на данных бактериологического исследования кала и клинической симптоматике, которая, как правило, неспецифична.

Классификация дисбактериоза кишечника по И.Б. Куваевой и К.С. Ладодо (1991)

Первая степень	Латентная фаза дисбиоза: проявляется только в снижении на 1-2 порядка количества защитной микрофлоры — бифидобактерий, лактобацилл, а также полноценных кишечных палочек — до 80% от общего количества. Остальные показатели соответствуют физиологической норме (эубиозу). Как правило, начальная фаза не вызывает дисфункций кишечника и возникает как реакция организма практически здорового человека на воздействие неблагоприятных факторов, таких как, например, нарушение режима питания и др. В этой фазе возможно вегетирование в кишечнике незначительного количества отдельных представителей условно-патогенной флоры. Клинических проявлений дисбактериоза в этой фазе нет.
Bторaя степень	Пусковая фаза более серьезных нарушений характеризуется выраженным дефицитом бифидобактерий на фоне нормального или сниженного количества лактобацилл или сниженной их кислотообразующей активности, дисбалансом в количестве и качестве кишечных палочек, среди которых нарастает доля лактозонегативных или цитрат-ассимилирующих вариантов. При этом на фоне дефицита защитных компонентов кишечного микробиоценоза происходит размножение либо плазмокоагулирующих стафилококков, либо протеев, либо грибов рода Candida. Вегетирование в кишечнике протеев или плазмокоагулирующих стафилококков в этой фазе развития дисбактериоза чаще транзиторное, чем постоянное. Функциональные расстройства пищеварения выражены неотчетливо — спорадически жидкий стул зеленоватого цвета с неприятным запахом, со сдвигом рН в щелочную сторону, иногда, напротив, задержка стула, иногда отмечается тошнота.
Третья степень	Фаза агрессии аэробной флоры характеризуется отчетливым нарастанием содержания агрессивных микроорганизмов — при этом размножаются до десятков миллионов в ассоциации золотистые стафилококки и протеи, гемолитические энтерококки, наблюдается замещение полноценных эшерихий бактериями родов Klebsiella, Enterobacter и др. Эта фаза дисбактериоза проявляется дисфункциями кишечника с расстройствами моторики, секреции ферментов и всасывания. У больных отмечается учащенный разжиженный стул, часто зеленого цвета, снижение аппетита, ухудшение самочувствия, дети становятся вялыми, капризными.
Четвертая степень	Фаза ассоциативного дисбиоза характеризуется глубоким разбалансированием кишечного микробиоценоза с изменением количественных соотношений основных групп микроорганизмов, изменением их биологических свойств, накоплением токсических метаболитов. Характерно вегетирование энтеропатогенных серотипов E.coli, сальмонелл, шигелл и других возбудителей острых кишечных инфекций. Возможно размножение клостридий. Эта фаза дисбиоза характеризуется функциональными расстройствами пищеварительной системы и нарушениями общего нутритивного статуса, дефицитом массы тела, бледностью кожных покровов, снижением аппетита, частым стулом с примесью слизи, зелени, иногда крови, с резким гнилостным или кислым запахом.

Несмотря на введение в микробиологическую практику новых усовершенствованных методов исследования, до сих пор четкой границы между микробиоценозом кала здоровых и больных лиц так и не выявлено. Каловый микробиоценоз является сложным и динамичным. Состав и количество бактерий широко варьируют.

В последних исследованиях, посвященных анализу микробиоценоза кала, используется метод флуоресцентной гибридизации ДНК in situ (FISH). Количественный анализ бактериального состава и интенсивности свечения в центральных участках образца фекалий, на поверхности и в слизи позволили различить особенности биологической структуры кала здоровых и больных. Особенностью данных исследований является то, что исследуются не гомогенизированные образцы, а цилиндрические образцы кала, полученные от больных, так как при гомогенизации бактерии равномерно распределяются в образце, чего не бывает в естественных условиях [9].

Существуют и другие методы диагностики дисбактериоза кишечника, основанные на определении метаболитов кишечной микрофлоры [2]. Эти соединения разделены на 4 группы. В первую группу входят индикан, n-крезол, фенол. Индикан расщепляется индол-положительными микробами, n-крезол, фенол — анаэробными и аэробными микроорганизмами. Вторая группа включает H₂, СН₄, СО₂, С₂-С₆ жирные кислоты. Это метаболиты строгих анаэробов. Третью группу составляют деконъюгированные желчные кислоты — метаболиты бактероидов, бифидобактерий, клостридий, стрептококков и энтеробактерий. Аммиак входит в четвертую группу, является метаболитом грамположительных и грамотрицательных анаэробов, энтеробактерий и стрептококков.

Для определения метаболитов кишечной микрофлоры используются такие методы, как газо-жидкостная, высокоэффективная жидкостная хроматография, к сожалению, не всегда доступные в повседневной клинической практике.

В настоящее время идентифицирован ряд факторов кишечной микрофлоры, обеспечивающих персистенцию и колонизацию симбионтной и условно-патогенной микрофлоры. К таким факторам относятся ферменты, которые формируют устойчивость некоторых представителей кишечной микрофлоры к действию секреторных антител [10]. Накоплены данные о том, что ферменты, способные расщеплять секреторные иммуноглобулины слизистых оболочек, способствуют колонизации эпителия патогенными бактериями. В связи с этими фактами в последнее время были предложены и апробированы скрининговые биохимические методы оценки состояния микробиоценоза кишечника по уровню протеолитической, Ig-расщепляющей активности супернатантов фекалий [6, 11, 12]. Эти методы диагностики дисбиоза основаны на том, что различные таксономические виды бактерий, колонизирующие разные отделы кишечника, обладают неодинаковой протеолитической способностью. Как правило, индигенная микрофлора кишечника человека и его фекалий, в частности бифидо- и лактофлора, обладает выраженной сахаралитической, нежели протеолитической активностью. Возрастание суммарной протеолитической активности супернатантов фекалий тесно связано с увеличением количественного содержания многих видов условно-патогенных бактерий в кишечнике или с возрастанием доли бактерий, продуцирующих протеолитические энзимы, колонизирующих стенку кишечника. IgА-протеазы — секретируемые факторы бактериальной природы. Они представляют собой специфические энзимы, расщепляющие IgА на классические Fab- и Fc-фрагменты, лишая его тем самым антительных свойств [10].

Протеолитическая активность, в том числе иммуноглобулин-расщепляющая активность, выявлена у многих видов патогенных и условно-патогенных бактерий, грибов и простейших, способных колонизировать кишечник. Выделены IgA-протеиназы у представителей семейства энтеробактерий: Proteus spp, Serratia marcescens, Klebsiella ozaenae, Klebsiella pneumonie, E. Coli, Shigella spp., Salmonella spp. Грамположительная кокковая микрофлора кишечника — S. aureus, S. epidermidis, Enterococcus faecalis — также способна к продукции Ig-расщепляющих протеиназ [12, 13]. IgA-протеиназы индуцируют грибы рода Candida. Изучены протеолитические ферменты, являющиеся факторами вирулентности, у таких простейших, как Lamblia intestinalis [14]. Некоторые представители фекальной микрофлоры здоровых людей: Streptococcus faecalis, Staphyloccocus spp. Propionibacterium acnes, Cl. perfringens, Cl. bifermentas, Cl. sporogenes, Cl. ramnosum, Bacteroides spp. Bifidobacterium spp. — также обладают протеолитической активностью [12, 13]. Вероятно, эта способность вносит свой вклад в вирулентность нормальной микрофлоры, которая, как известно, появляется при дисбактериозе кишечника наряду со снижением антагонистических свойств.

Возрастание суммарной протеолитической активности тесно связано с увеличением количественного содержания многих видов условно-патогенных бактерий в кишечнике и/или с возрастанием доли бактерий, продуцирующих протеолитические энзимы, колонизирующих стенку кишечника [11, 12].

Способность продуцировать IgА протеиназы характерна в основном для патогенных микроорганизмов и является тем условием, которое обеспечивает существование микробов на слизистых поверхностях [10].

Патогенность микробных протеиназ обусловлена не только их деградирующей активностью в отношении антител, но и способностью непосредственно повреждать эпителиальные клетки слизистых оболочек и активировать гемокоагуляционные механизмы в очаге воспаления [15, 16, 17]. Некоторые из бактериальных протеиназ способны снижать жизнеспособность энтероцитов кишечника и повреждать защитный барьер слизистых [18, 19]. Протеолитическая активность исследовалась при патологических состояниях. Так, изучен протеолитический потенциал фекалий при колитах, болезни Крона, в детском возрасте — при кишечной инфекции и дисбактериозах [11, 12, 20, 21, 22, 23]. Было показано, что положительные протеолитические (казеинолитические) пробы, причем высокой степени активности, чаще выявлялись в группе детей с превалирующим выделением различных видов условно-патогенных бактерий и выраженными изменениями микроэкологии кишечника [11]. Протеолитическая активность фекалий нарастала с увеличением содержания в фекалиях гемолитических E. Coli, бактерий рода Proteus, Staphyloccocus и их ассоциаций с псевдоманадами, клебсиеллами, серрациями, гафниями и грибами рода Candida. Во всех случаях, когда в микрофлоре находили бактерии рода Proteus в количестве 5 lg КОЕ/г и выше, протеолитическая активность супернатантов была высокой.

Особый интерес представляет исследование, в котором изучалась Ig-расщепляющая активность микрофлоры кишечника по профилю протеиназ в норме и при патологических состояниях [12]. Выявлено, что условно-патогенная микрофлора обладает более выраженным агрессивным потенциалом, обусловленным Ig-протеолитической активностью по сравнению с бифидофлорой. Уровень иммуноглобулин — расщепляющей активности фекалий у детей с нарушениями микроэкологии кишечника — был выше, чем у детей с эубиозом.

Таким образом, методы, позволяющие оценить уровень протеолитической активности фекалий, косвенно характеризуют возникающий дисбаланс в составе не только фекальной, но и пристеночной тонко- и толстокишечной микрофлоры, показывают ее качественные изменения.

Нами проведено исследование Ig-расщепляющей (протеолитической) активности фекалий у 133 детей с хронической гастродуоденальной патологией. Для изучения активности протеиназ, дети были разделены на 3 группы. Первую группу (55 больных) составили дети с неэрозивными гастродуоденитами, вторую группу (31 больной) — больные эрозивными гастродуоденитами, третью — дети с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки (33 человека). Результаты представлены в таблице 2.

Активность протеолитических ферментов у детей с гастродуоденальной патологией

Протеоли-тическая активность ферментов

Группы детей с гастродуоденальной патологией

При рождении ребенка происходит переход от стерильных условий внутриутробного развития к существованию с первых же минут жизни в разнообразном мире микроорганизмов. Интенсивная колонизация кожных покровов и слизистой оболочки органов, соприкасающихся с внешней средой, ведет к формированию микроэкологической системы человека.

Сегодня под этим термином понимается состояние динамического равновесия, которое определяется, с одной стороны, физиологическими и иммунобиологическими особенностями организма хозяина, а с другой - видовым и количественным составом микробных ассоциаций и разнообразием их биохимической активности [1].

Согласно современным воззрениям нормальная микрофлора толстой кишки человека представляет собой некий "экстракорпоративный орган", состоящий из огромного числа микроорганизмов, объединенных в единую экологическую систему. Количество микробных клеток, присутствующих на коже и слизистых макроорганизма, контактирующих с внешней средой, превышает число клеток всех его органов и тканей вместе взятых.

Микробные ассоциации (микробиоценозы), занимающие ту или иную экологическую нишу в организме хозяина, характеризуются сложной иерархической структурой, различными межвидовыми отношениями и многоступенчатыми метаболическими процессами, конечным результатом которых являются биологически активные соединения - микробные метаболиты [2].

На значение микробной флоры для здорового человека впервые обратил внимание в 1914 г. И.И.Мечников [3]. Микробная флора участвует во многих жизненно важных процессах макроорганизма, внося определенный вклад в поддержание гомеостаза организма хозяина, который является для нее средой обитания .

Одна из основных функций нормальной микрофлоры - защитная, так как бактерии - симбионты человека - обладают выраженной антагонистической активностью по отношению к патогенным и оппортунистическим микроорганизмам. Так, например, бифидобактерии образуют в процессе своей жизнедеятельности молочную, уксусную, муравьиную и янтарную кислоты, создающие кислую среду в кишечнике и препятствующие колонизации его посторонними микроорганизмами, попавшими сюда извне. Лактобактерии в процессе брожения молочной кислоты образуют антибиотические вещества - лактолин, лактоцидин, ацидофилин.

Следовательно, представители нормальной микрофлоры кишечника тормозят рост и размножение условно-патогенных микроорганизмов - энтеропатогенных кишечных палочек, клебсиелл, протеев, некоторых видов сальмонелл и шигелл, золотистого стафилококка и др.

Участие нормальной микрофлоры кишечника в обменных процессах организма хозяина определяется, с одной стороны, утилизацией ею непереваренных пищевых соединений и инактивацией биологически активных веществ, выделяющихся с пищеварительными соками, а с другой - синтезом представителями нормальной флоры кишечника витаминов группы B, витамина К, никотиновой и фолиевой кислот, различных биологически активных соединений: эстрогенов, промазина, морфина, колхицина, диэтилбестрена, дигоксина и др. [4].

Еще одной важной функцией нормальной микрофлоры человека является ее участие в формировании иммунобиологической реактивности организма хозяина. Показано, что в результате антигенной стимуляции микроорганизмами иммунной системы организма человека у него создается и поддерживается общий пул иммуноглобулинов [1].

Таким образом, нормальная микрофлора человека с ее специфическими функциями микроорганизма - защитной, обменной, иммуноиндуцирующей и др. - определяет микробную экологию пищеварительного тракта и участвует в поддержании гомеостаза макроорганизма. Нарушение любой из функций приводит к нарушению различных видов метаболизма, возникновению дефицита микронутриентов: витаминов, микроэлементов, минеральных веществ в организме человека, снижению его иммунного статуса.

Было показано, что нарушения состава и количественного соотношения в микробиоцинозах кишечника, определяемые термином "дисбактериоз", возникают от разнообразных причин: характера питания, возраста, проведения антибактериальной, гормональной, лучевой и/или химиотерапии, наличия хронических заболеваний пищеварительного тракта и др., а в основе их развития лежит изменение условий обитания в биотопе, в результате чего популяции одного или нескольких видов, составляющих микробиоценоз, или видов, занесенных из других биотопов хозяина или внешней среды, получают преимущества для роста и размножения перед своими конкурентами и приобретают несвойственное им доминирующее положение в микробиоценозе [5 , 6].

Новые количественные и качественные соотношения только тогда станут дисбактериозом, когда нарушаются механизмы аутостабилизации, присущие всем эволюционно сложившимся системам.

Видовой состав "патологического" микробиоценоза, так же как и скорость колонизации, и продолжительность персистирования составляющих его микроорганизмов в кишечнике индивидуальны, зависят от состояния микроэкологической системы и организма хозяина.

Бактерии, в норме не характерные для данного микробного сообщества, кроме повышенной инвазивной способности отличаются от аутофлоры и тем, что способствуют возникновению различных нарушений в нормальном протекании метаболических процессов в кишечнике. Они также не способны осуществлять ряд важных физиологических функций, присущих представителям нормальной микрофлоры.

Следовательно, изменения в микробиоценозах пищеварительного тракта, как правило, служат предвестником отклонений в клинико-физиологическом статусе организма хозяина. Со временем дисбактериоз проявляет себя клиническими местными симптомами, а затем и общими нарушениями, которые отягощают течение различных заболеваний человека и затрудняют их лечение.

Гастриты, дуодениты, язвенная болезнь, изменения моторной и пропульсивной способности кишечника (колиты с диареей или запором, энтериты с синдромом мальабсорбции), коагулопатии, гипер- и гипохолестеринемия, острая мезентериальная ишемия, ревматоидный артрит, злокачественные новообразования толстой кишки и молочных желез, нарушение менструального цикла, кариес, мочекаменная болезнь, портальная системная энцефалопатия, заболевания печени, анемия новорожденных и т.д. - вот неполный перечень тех нозологических форм и клинических синдромов патологии человека, в которых дисбиотические изменения в кишечнике и других биотопах организма человека являются одним из патогенетических факторов заболевания.

Следовательно, прежде чем лечить человека от той или иной болезни, надо сначала оздоровить его кишечник.

С этих позиций проблема борьбы с дисбактериозом кишечника приобретает большую актуальность для самых различных отраслей клинической медицины и делает необходимым параллельное исследование микробного, иммунного, биохимического и т.д. статуса у определенных контингентов больных.

К таким контингентам или группам "риска", на наш взгляд, можно отнести следующие категории пациентов:

1. Стационарные больные, длительно получающие антибактериальную, гормональную, лучевую и/или химиотерапию.
2. Пациенты с жалобами со стороны органов пищеварения.
3. Больные с проявлениями аллергозов и астеновегетативного синдрома.
4. Дети с патологией различных органов и систем.

Методы лабораторной диагностики дисбактериоза кишечника

В настоящее время основным и наиболее распространенным методом лабораторной диагностики дисбактериоза кишечника остается бактериологическое исследование кала пациента, считающееся классическим методом. Обязательными компонентами данного исследования должны быть количественные методики и многовекторность (направленность на выделение многих видов и вариантов микрофлоры).

Результаты исследования сопоставляют с данными о нормальном составе микрофлоры конкретного биотопа, клинической картиной и возрастом пациента. Следует подчеркнуть, что широкий спектр микробных ассоциаций, исследуемых в фекалиях, необходимость учета их количества и изменений биологических свойств, особенно появление признаков, характеризующих агрессивность условно-патогенных микроорганизмов, - все это привело к созданию различных схем для оценки степени тяжести развившихся дисбиотических нарушений при различных заболеваниях.

В табл. 1 даны современные микробиологические критерии для оценки состояния нормальной микрофлоры толстой кишки. Эти критерии были получены группой авторов, проводивших длительное (в течение 6 месяцев) обследование людей, у которых не было выявлено нарушений в их физиологическом статусе - доноров крови.

Хотелось бы подчеркнуть, что при проведении этого исследования большое внимание уделялось отбору добровольцев, их подготовке к обследованию, а также взятию клинического материала и его доставке в лабораторию. Этим, очевидно, и можно объяснить полученный авторами сравнительно небольшой разброс количественных показателей содержания представителей нормальной микрофлоры в 1 грамме кала [7] в сравнении с данными других публикаций.

Следует учитывать, что кишечная микрофлора человека - весьма лабильная система, подверженная колебаниям в зависимости от многих факторов, как эндогенных (нервный статус, пища, температура тела и т.п.), так и экзогенных (время года, атмосферные колебания и т.п.). Поэтому к оценке полученных результатов следует подходить дифференцированно.

Отличию так называемых "дисбиотических реакций" от истинного дисбактериоза способствует выполнение 2 - 3-кратных исследований с интервалом не менее 14 дней. В первом случае сдвиги в составе микрофлоры кишечника непродолжительны и исчезают через 5 - 7 дней без какого-либо лечения.

Сегодня некоторые хорошо оснащенные лаборатории крупных исследовательских центров для лабораторной диагностики дисбактериоза наряду с бактериологическим методом используют и так называемый экспрессный метод, включающий в себя определение индола, п-крезола, фенола, водорода, метана, короткоцепочечных летучих жирных кислот ряда С2-С6 (лжк), деконъюгированных желчных кислот, меченных радиоактивным углеродом 14, аммиака и ряда других химических соединений, в метаболизме которых в организме человека его микрофлора принимает непосредственное участие.

Достоинство этих методик в том, что они позволяют обнаружить дисбиотические изменения в кишечнике в течение 30-120 мин.

Широкое распространение для определения метаболитов кишечной микрофлоры получил метод газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ). Наиболее часто он применяется для определения экскреции с фекалиями людей таких летучих веществ как летучие жирные кислоты (ЛЖК) и ароматические соединения (фенолы и индолы).

Ограниченность ГЖХ - анализа возможностью определять только летучие вещества успешно компенсируется сочетанием этого метода с методами жидкостной хроматографии, позволяющими проводить детекцию в клиническом материале тех микробных метаболитов, которые не обладают свойством летучести:

Органические карбоновые кислоты (оксо и окси) - метод ионоэксклюзионной хроматографии.
Простые и сложные амины, фенилпропионовая кислота - метод высокоэффективной жидкостной хроматографии [7].

Преимущество “экспрессного” метода перед “классическим” очевидно при диагностике синдрома контаминации толстой кишки как одного из критериев дисбаланса в микроэкологической системе кишечника.

Диагностика этого синдрома бактериологическим способом достаточно сложна, так как требуются специальные зонды для забора материала из просвета и со слизистой оболочки верхних отделов тонкой кишки. При биохимическом методе в фекалиях и моче определяют деконъюгированные желчные кислоты, п-крезол, фенол и индол (индикан), присутствующие в биологических жидкостях больного и являющиеся метаболическими маркерами синдрома контаминации тонкой кишки.

В табл. 2 представлены критерии биохимической активности микроорганизмов т олстой кишки, разработанные группой исследователей, проводивших обследование различных контингентов клинически здоровых людей [7]. Авторы объединили их в формуляр под термином "микробный метаболитный паспорт фекалий" - ММПФ.

Результаты другого исследования продемонстрировали, что изменения в показателях ММПФ больных с различной патологией коррелируют с количественными и качественными изменениями состава их микрофлоры кишечника.

Был сделан вывод, что определение ММПФ является перспективным методом, дающим информативную и быструю (в течение 1 дня) оценку состояния микробной экологии пищеварительного тракта человека. Этот метод был рекомендован к использованию в скрининговых обследованиях и при проведении диагностики патологических состояний, связанных с дисбактериозом кишечника [ 8].

Современная система мониторинга за микробной экологией кишечника человека

Как бактериологический (“классический”), так и биохимический (“экспрессный”) методы лабораторной диагностики дисбактериоза кишечника имеют свои достоинства и недостатки.

К основным недостаткам первого метода лабораторной диагностики дисбактериоза относятся: трудоемкость, высокая стоимость, длительность проведения анализа, относительная субъективность полученных результатов, а главное - недооценка роли многих до настоящего времени не культивируемых представителей микробиоценозов кишечника.

Кроме того, этот метод также грешит возможностью получения несходящихся результатов при повторном обследовании пациента - как следствие различного роста бактерий в условиях организма хозяина (in vivo) и на искусственных питательных средах (in vitro).

Преимуществом классического метода перед экспрессным является то, что это - прямой метод, позволяющий определить в биологических жидкостях организма хозяина состав и количественное содержание микроорганизмов, составляющих микробиоценоз толстой кишки организма хозяина как в норме, так и при различной патологии.

Таблица 1. Частота выделения и среднее количество основных представителей микробиоценоза толстой кишки в 1 г кала практически здоровых людей (M±m)

Аннотация научной статьи по клинической медицине, автор научной работы — Булатов В. П., Камалова Аэлита Асхатовна, Удачина Э. И., Зинкевич О. Д., Сафина Н. А.

В статье представлен современный взгляд на проблему дисбактериоза кишечника у детей , методы диагностики и их трактовка. Представлены собственные исследования характера микрофлоры кишечника по содержанию Ig-расщепляющей (протеолитической) активности фекалий у 133 детей с хронической гастродуоденальной патологией. Показано, что метод может быть полезным для характеристики кишечной микробиоты

Modern methods of diagnostics intestinal dysbiosis

The article presents a modern approach to the problem of intestinal dysbiosis in children , methods of diagnosis and treatment. Presented own research into the nature of intestinal microflora on the content of Ig-cleaving (proteolytic) activity of fаeces in 133 children with chronic gastroduodenal pathology. It is shown that the method may be useful for the characterization of intestinal microbiota.

В.П. БУЛАТОВ, A.A. КАМАЛОВА, Э.И. УДАНИНА, О.Д. ЗИНКЕВИЧ. Н.А. САФИНА, А.Р. ШАКИРОВА

Казанский государственный медицинский университет Казанская государственная медицинская академия Детская республиканская клиническая больница МЗ РТ

Современные методы диагностики дисбактериоза кишечника

ІКамалова Аэлита Асхатовна

кандидат медицинских наук, ассистент кафедры госпитальной педиатрии с курсами

поликлинической педиатрии и последипломного образования Казанского государственного медицинского университета 420138, г. Казань, ул. Дубравная, д. 65, кв. 59, тел. 8-917-272-42-07, e-mail: [email protected]

Ключевые слова: дети, дисбактериоз кишечника, диагностика.

V.P. BULATOV, A.A. KAMALOVA, E.i. UDACHINA, O.D. ZiNKEViCH, N.A. SAFiNA, A.R. SHAKIR0VA

Kazan State Medical University Kazan State Medical Academy Children's Republican Clinical Hospital RT

Modern methods of diagnostics intestinal dysbiosis

The article presents a modern approach to the problem of intestinal dysbiosis in children, methods of diagnosis and treatment. Presented own research into the nature of intestinal micro flora on the content of Ig-cleaving (proteolytic) activity of fаeces in 133 children with chronic gastroduodenal pathology. It is shown that the method may be useful for the characterization of intestinal microbiota. Keywords: children, intestinal dysbiosis, diagnostics.

является как следствием, так и одним из звеньев патогенеза патологии желудочно-кишечного тракта. С одной стороны, дисбактериоз кишечника всегда вторичен, поскольку возникает при любом изменении внутренней среды кишки вследствие действия патогенных факторов или прямого влияния на кишечную

Классификация дисбактериоза кишечника по И.Б. Куваевой и К.С. Ладодо (1991)

Первая степень Латентная фаза дисбиоза: проявляется только в снижении на 1-2 порядка количества защитной микрофлоры — бифидобактерий, лактобацилл, а также полноценных кишечных палочек — до 80% от общего количества. Остальные показатели соответствуют физиологической норме (эубиозу). Как правило, начальная фаза не вызывает дисфункций кишечника и возникает как реакция организма практически здорового человека на воздействие неблагоприятных факторов, таких как, например, нарушение режима питания и др. В этой фазе возможно вегетирование в кишечнике незначительного количества отдельных представителей условно-патогенной флоры. Клинических проявлений дисбактериоза в этой фазе нет.

Вторая степень Пусковая фаза более серьезных нарушений характеризуется выраженным дефицитом бифидобактерий на фоне нормального или сниженного количества лактобацилл или сниженной их кислотообразующей активности, дисбалансом в количестве и качестве кишечных палочек, среди которых нарастает доля лактозонегативных или цитрат-ассимилирующих вариантов. При этом на фоне дефицита защитных компонентов кишечного микробиоценоза происходит размножение либо плазмокоагулирующих стафилококков, либо протеев, либо грибов рода Candida. Вегетирование в кишечнике протеев или плазмокоагулирующих стафилококков в этой фазе развития дисбактериоза чаще транзиторное, чем постоянное. Функциональные расстройства пищеварения выражены неотчетливо — спорадически жидкий стул зеленоватого цвета с неприятным запахом, со сдвигом рН в щелочную сторону, иногда, напротив, задержка стула, иногда отмечается тошнота.

Третья степень Фаза агрессии аэробной флоры характеризуется отчетливым нарастанием содержания агрессивных микроорганизмов — при этом размножаются до десятков миллионов в ассоциации золотистые стафилококки и протеи, гемолитические энтерококки, наблюдается замещение полноценных эшерихий бактериями родов Klebsiella, Enterobacter и др. Эта фаза дисбактериоза проявляется дисфункциями кишечника с расстройствами моторики, секреции ферментов и всасывания. У больных отмечается учащенный разжиженный стул, часто зеленого цвета, снижение аппетита, ухудшение самочувствия, дети становятся вялыми, капризными.

Четвертая степень Фаза ассоциативного дисбиоза характеризуется глубоким разбалансированием кишечного микробиоценоза с изменением количественных соотношений основных групп микроорганизмов, изменением их биологических свойств, накоплением токсических метаболитов. Характерно вегетирование энтеропатогенных серотипов E.coli, сальмонелл, шигелл и других возбудителей острых кишечных инфекций. Возможно размножение клостридий. Эта фаза дисбиоза характеризуется функциональными расстройствами пищеварительной системы и нарушениями общего нутритивного статуса, дефицитом массы тела, бледностью кожных покровов, снижением аппетита, частым стулом с примесью слизи, зелени, иногда крови, с резким гнилостным или кислым запахом.

микрофлору. С другой стороны, дисбактериоз кишечника сам может приводить к повреждению кишечного эпителия, тем самым нарушая процессы пищеварения и усугубляя клиническое течение заболеваний желудочно-кишечного тракта.

В настоящей статье мы коснемся преимущественно диагностики нарушений микроэкологии толстого кишечника.

Толстая кишка представляет собой биотоп с высокой степенью обсемененности. В ней обнаружено более 400 видов микроорганизмов. Показано преобладание анаэробной микрофлоры, представленной на 90% бактероидами и бифидобактериями (главная флора). Аэробы составляют 10% — кишечные палочки, лактобациллы, энтерококки и др. (сопутствующая флора). Остаточная флора, составляющая менее 1% от общего количества микроорганизмов, представлена клебсиеллами, протеем, дрожжами, клостридиями, энтеробактером и цитробактером и др. Необходимо отметить одну особенность микрофлоры толстого кишечника — по мере продвижения от проксимальных отделов к дистальным увеличивается ее обсемененность. В проксимальном отделе общее число микроорганизмов составляет 108 -109, а в прямой кишке — 1011-1012 в 1 г кала. Более 90% массы кала приходится на бактерии. Нормальная микрофлора кишечника колонизирует как просвет кишечного тракта, так и поверхность слизистой оболочки кишки, формируя при этом пристеночную или мукозную микрофлору (М-микрофлора)

и полостную микрофлору (П-микрофлора). Основную защитную функцию выполняет мукозная микрофлора [1, 2, 3, 4].

На сегодня существуют следующие методы лабораторной диагностики дисбактериоза кишечника [2, 4]:

2. Биохимический экспресс — метод определения протео-литической активности супернатантов фекалий.

3. Высоковольтный электрофорез на бумаге для обнаружения р-аспартилглицина, р-аспартиллизина, р-аланина, 5-аминовалериановой и Y-аминомасляной кислот и др.

5. Газожидкостная хроматография для определения в фекалиях летучих жирных кислот.

6. Микроскопия фекального мазка.

В результате многолетнего изучения кишечной микрофлоры РВ. Эпштейн-Литвак и Ф.Л. Вильшанская (1970) разработали методы лабораторной диагностики дисбактериоза, основанные на бактериологическом исследовании кала. Эти методы

Активность протеолитических ферментов у детей с гастродуоденальной патологией

Протеолитическая активность ферментов мг/д/час/г кала Группы детей с гастродуоденальной патологией Контрольная группа Р

Неэрозивные гастродуодениты Эрозивные гастродуодениты ЯБДПК

Группа 1 n=55 Группа 2 n=31 Группа 3 n=33 n=14

Общая 9,79 (2,64-21,91) 12,64 (3,178-21,05) 13,31 (5,363-28,58) 7,625 (2,386) Р1-К Не можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Нами выявлено, что показатели 1-й группы детей статистически значимо отличаются от 2-й и 3-й групп по общей про-теолитической активности и активности тиоловых ферментов. Также необходимо отметить, что ферменты тиолового типа вносят наибольший вклад в протеолитическую активность фекалий. Таким образом, нами установлено повышение общей протеолитической активности копрофильтратов по мере прогрессирования гастродуоденальной патологии от неэрозивных форм к эрозивно-язвенным поражениям.

На наш взгляд, в плане диагностики дисбиоза кишечника изучение иммуноглобулин-расщепляющей активности микрофлоры представляется перспективным направлением, так как способность продуцировать данные ферменты считается фактором патогенности и может служить качественной характеристикой кишечной микробиоты.

1. Урсова Н.И. Современные технологии в коррекции дисбактериозов кишечника у детей. — Москва, 2003. — 83 с.

2. Минушкин О.Н., Ардатская М.Д., Бабин В.Н., Домарадский И.В., Дубинин А.В. Дисбактериоз кишечника // Российский медицинский журнал, 1999. — № 3. — С. 40-44.

3. Казначеева Л.Ф. и др. Методы коррекции дисбиотических нарушений кишечника у детей в схемах и таблицах. — Новосибирск, 2007. — 48 с.

4. Хавкин А.И. Нарушения микроэкологии кишечника. Принципы коррекции. — Москва, 2004. — 40 с.

54 ПРАКТИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА

'б (45) ноябрь 2010 г.

5. Барановский А. Ю., Кондрашина Э.А. Дисбактериоз кишечника. 3-е изд. — СПб: Питер, 2008. — 240 с.

6. Зинкевич О.Д., Тюрин Ю.А., Сафина Н.А. Скрининговая диагностика дисбактериоза кишечника человека по уровню активности протеолитических ферментов в копрофильтратах // Методические рекомендации — Казань, 2003. — С. 18.

7. Барсук А.Л., Сумина А.В., Кузин В.Б., Козлов РС. Практическое обоснование низкой диагностической ценности микробиологического исследования кала на дисбактериоз // Вопросы диагностики в педиатрии, 2009. — № 2. — С. 7-11.

8. Куваева И.Б., Ладодо К.С. Микроэкологические и иммунные нарушения у детей. — М., 1991.

9. Swidsinski A. et al. Структура микробиоценоза кала у больных с хронической идиопатической диареей и у здоровых лиц // Клиническая гастроэнтерология и гепатология. Русское издание. — 2009. — Т. 2. — № 4. — С. 302-313.

10. Агапова О.В., Бондаренко В.М. Бактериальные IgA про-теазы // Журн. микробиол., 1998. — № 2. — С. 121-125.

11. Горская Е.М., Бондаренко В.М., Шогенова Ю.С., Лыкова Е.А., Мазанкова Л.Н., Волосникова И.В., Бродинова Н.С., Изачик Н.А. Протеолитическая активность содержимого толстой кишки в норме и при микроэкологических нарушениях // Журн. микробиол., 1995. — № 3. — С. 116-120.

12. Тюрин Ю.А. Протеиназная активность микрофлоры кишечника при острых кишечных инфекциях у детей.: Автореф. дисс. . канд. мед. наук. — Казань, 2003.

13. Зинкевич О.Д., Анохин В.А., Тюрин Ю.А. Роль протеолитических ферментов в норме и патологии человека // Инфекции и иммунитет. Сборник статей. — Казань, 2003. — С. 15-18.

14. Williams A.G., Coombs G.H. Multiple protease activities in Giardia intestinalis trophozoites // Int. J. Parasitol. — 1995 — Vol. 25 (7) — Р 771-778.

15. Azghani A.O., Gray L.D., Johnson A.R. A bacterial protease perturbs the paracellular barrier function of transporting epithelial monolayers in culture // Infect Immun. — 1993. — Vol. 61. — No 6. — P. 2681-2686.

16. Holder I.A., Wheeler R. Experimental studies of the pathogenesis of infections owing to Pseudomonas aeruginosa: elastase, an IgG protease // Can J Microbiol. — 1984. — Vol. 30. — No 9. — P. 1118-1124.

17. Mintz C.S., Miller R.D., Gutgsell N.S., Malek T Legionella pneumophila protease inactivates interleukin-2 and cleaves CD4 on human T cells //Infect Immun. — 1993. — Vol. 61. — No 8. — P. 3416-3421.

18. Бондаренко В.М., Шахмарданов М.З. Шигеллезы: теория и практика. — М., 2002. — С. 44-58.

19. Hutton D.A., Pearson J.P, Allen A., Foster S.N. Mucolysis of the colonic mucus barrier by faecal proteinases: inhibition by interacting polyacrylate// Clin Sci (Colch). — 1990. — Vol. 78. — № 3. — P. 265-271.

20. Tarlton J.F., Whiting C.V., Tunmore D., Bregenholt S., Reimann J., Claesson M.H., Bland PW. The role of up-regulated serine proteases and matrix metalloproteinases in the pathogenesis of a murine model of colitis // Am. J. Pathol. 2000. — Vol. 157 (6). — Р 1927-1935.

21. Ruseler-van Embden J.G., van Lieshout L.M. Increased proteolysis and leucine aminopeptidase activity in faeces of patients with Crohn's disease. Digestion // 1988. — Vol. 40 (1). — Р 33-40.

22. Bohe M. Pancreatic and granulocytic endoproteases in faecal extracts from patients with active ulcerative colitis// Scand J Gastroenterol. — 1987. — Vol. 22 (1) — P. 59-64.

23. Кузиков А.Н., Бондаренко В.М., Лыкова Е.А. Особенности казеинолитической активности содержимого толстой кишки при дисбиотических состояниях // Журн. микробиол., 1998. — № 1. — C. 80-83.

КАЗАНСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ ПОРТАЛ

для врачей и медицинских учреждений

бесплатные электронные адреса

с защитой от спама, с доступом с любого компьютера или телефона, с возможностью приема больших файлов, календарем и множеством других функций.

Читайте также: