Трансгенные эукариотические организмы шпоры

Министерство образования Республики Беларусь

Учебно-методическое объединение по естественнонаучному образованию

Первый заместитель Министра образования

Регистрационный № ТД- G . 382 /тип.

Трансгенные эукариотические организмы

для высших учебных заведений по специальности:

1Биология (по направлениям)

направление 1Биология (биотехнология)

СОГЛАСОВАНО

Председатель Учебно-методического объединения по естественно-научному образованию

_28_ ____03____ 2011 г.

СОГЛАСОВАНО

Начальник Управления высшего и

среднего специального образования

_02_ ____11____ 2011 г.

Проректор по учебной и воспитательной

работе Государственного учреждения

_26_ ____06____ 2011 г.

Составитель:

Александр Георгиевич Песнякевич, доцент кафедры микробиологии Белорусского государственного университета, кандидат биологических наук, доцент

РЕКОМЕНДОВАНА К УТВЕРЖДЕНИЮ В КАЧЕСТВЕ ТИПОВОЙ:

Кафедрой микробиологии Белорусского государственного университета

(протокол № 5 от 25 октября 2010 г.);

Научно-методическим советом Белорусского государственного университета

(протокол от 03 ноября 2010 г.);

Научно-методическим советом по специальности 1Биология

Учебно-методического объединения по естественнонаучному образованию

(протокол от 01.01.01 г.)

Ответственный за редакцию: Александр Георгиевич Песнякевич

Ответственный за выпуск: Александр Георгиевич Песнякевич

ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА

В курсе рассматриваются особенности естественной трансформации растительных организмов в ходе их колонизации Agrobacterium tumefaciens , дается характеристика Ti -плазмид и Т-ДНК, описываются созданные на их основе векторные системы для введения генетической информации в геном растений. На конкретных примерах дается представление о выборе генов, предназначенных для получения трансгенных растений и их модификациях, необходимых для оптимального функционирования вводимой генетической информации. Курс включает сведения об особенностях генетической трансформации одноклеточных грибов, основных векторных системах, разработанных для получения трансгенных дрожжей, преимуществах и недостатках использования дрожжей в микробиологической промышленности. Приводятся сведения о потенциальных возможностях получения трансгенных животных и применяемых для этого векторных системах и методах. Обсуждаются экономические и общественно-социальные проблемы, возникшие в результате введения трансгенных эукариот в практику.

Основная задача курса – получение студентами знаний о методических подходах, применяемых для создания трансгенных эукариотических организмов.

В результате изучения дисциплины обучаемый должен:

- структуру Ti -плазмид и функции, определяемые локализованными в них генами; принципы конструирования и примеры коинтегративных и бинарных векторных систем, применяемых для получения трансгенных растений;

- с использованием каких генов были получены гербицидоустойчивые, энтомоустойчивые, устойчивые к стрессовым воздействиям растения, растения с измененными качествами плодов и цветков; перспективы создания трансгенных растений, пригодных для получения фармацевтических и косметических препаратов, улучшенного сырья для текстильной промышленности;

- преимущества использования дрожжевых клеток как продуцентов биологически-активных веществ; структуру и особенности функционирования векторных систем, применяемых для трансформации дрожжей;

- особенности векторных систем на основе бакуловирусов, ретровирусов, аденовирусов, адено-ассоциированных вирусов, герпесвирусов; методы и проблемы получения трансгенных млекопитающих, птиц и рыб;

- суть проблемы биологической безопасности при использовании трансгенных организмов

- использовать полученные в курсе знания в научно-исследовательской работе;

- объяснить особенности создания и использования трансгенных организмов;

- правильно отвечать на вопросы, возникающие у широких слоев населения в связи с расширяющимся использованием трансгенных эукариотических организмов.

При чтении лекционного курса рекомендуется применять технические средства обучения для демонстрации слайдов и презентаций.

Приведенная ниже программа отражает содержание основных тем, включаемых в лекционный курс, и призвана послужить основой для ориентации слушателей в круге рассматриваемых вопросов как в процессе прохождения курса, так и в период непосредственной подготовки к экзамену. Для организации самостоятельной работы студентов по курсу рекомендуется использовать современные информационные технологии: разместить в сетевом доступе комплекс учебных и учебно-методических материалов (программа, методические указания к лабораторным занятиям, список рекомендуемой литературы и информационных ресурсов, задания в тестовой форме для самоконтроля и др.).

Программа рассчитана на 84 часа, в том числе 48 аудиторных часов: 48 – лекционных.

Организм (позднелат. organismus от позднелат. organizo — устраиваю, сообщаю стройный вид, от др.-греч. ὄργανον — орудие) — живое тело, обладающее совокупностью свойств, отличающих его от неживой материи.
Показать полностью…

Как отдельная особь организм входит в состав вида и популяции, являясь структурной единицей популяционно-видового уровня жизни.

Организмы — один из главных предметов изучения в биологии. Для удобства рассмотрения все организмы распределяются по разным группам и категориям, что составляет биологическую систему их классификации. Самое общее их деление — на ядерные и безъядерные. По числу составляющих организм клеток их делят на внесистематические категории одноклеточных и многоклеточных. Особое место между ними занимают колонии одноклеточных.

Формирование целостного многоклеточного организма — процесс, состоящий из дифференцировки структур (клеток, тканей, органов) и функций и их интеграции как в онтогенезе, так и в филогенезе. Многие организмы организованы во внутривидовые сообщества (например, семья или рабочий коллектив у людей)

Записи сообщества

Поиск

Одноклеточные и многоклеточные организмы

Кле́тка — основная единица жизни, реальный носитель её свойств, элементарная единица строения и жизнедеятельности всех живых организмов (кроме вирусов, о которых нередко говорят как о неклеточных формах жизни), обладающая всей совокупностью свойств живого, собственным механизмом обмена веществ, способная к самостоятельному существованию, самовоспроизведению и развитию.
Показать полностью… Все живые организмы либо, как многоклеточные животные, растения и грибы, состоят из множества клеток, либо, как многие простейшие и бактерии, являются одноклеточными организмами. Раздел биологии, занимающийся изучением строения и жизнедеятельности клеток, получил название цитологии. В последнее время принято также говорить о биологии клетки, или клеточной биологии.

Классификация организмов на основании строения клеток
Все клеточные формы жизни на Земле можно разделить на два надцарства на основании строения составляющих их клеток:

прокариоты (доядерные) — более простые по строению и возникли в процессе эволюции раньше;
эукариоты (ядерные) — более сложные, возникли позже. Клетки, составляющие тело человека, являются эукариотическими.
Эукариоты
Эукарио́ты, или я́дерные (лат. Eucaryota от греч. εύ- — хорошо и κάρυον — ядро) — домен (надцарство) живых организмов, клетки которых содержат ядра. Все организмы, кроме бактерий и архей, являются ядерными (вирусы и вироиды также не являются эукариотами, но не все биологи считают их живыми организмами).

Животные, растения, грибы, а также группы организмов под общим названием протисты — являются эукариотическими организмами. Они могут быть одноклеточными и многоклеточными, но объединяет их общий план строения клеток. Считается, что все эти столь несхожие организмы имеют общее происхождение, поэтому группа ядерных рассматривается как монофилетический таксон наивысшего ранга. Согласно наиболее распространённым гипотезам, эукариоты появились 1,5—2 млрд лет назад. Важную роль в эволюции эукариот сыграл симбиогенез — симбиоз между эукариотической клеткой, видимо, уже имевшей ядро и способной к фагоцитозу, и проглоченными этой клеткой бактериями — предшественниками митохондрий и хлоропластов.

Мезокариоты
Мезокариоты (лат. mesocaryota) — организмы с промежуточным между прокариотами и эукариотами типом организации генетического аппарата. К мезокариотам относятся динофитовые водоросли — динофлагеллаты.

Единственная крупная кольцевая (у некоторых видов — линейная) двухцепочечная молекула ДНК, в которой содержится основная часть генетического материала клетки (так называемый нуклеоид) не образует комплекса с белками-гистонами (так называемого хроматина). К прокариотам относятся бактерии, в том числе цианобактерии (сине-зелёные водоросли), и археи. Потомками прокариотических клеток являются органеллы эукариотических клеток — митохондрии и пластиды.

Прокариоты разделяют на два таксона в ранге домена (надцарства): Бактерии (Bacteria) и Археи (Archaea).

Изучение бактерий привело к открытию горизонтального переноса генов, который был описан в Японии в 1959 г. Этот процесс широко распространен среди прокариот, а также у некоторых эукариот. Открытие горизонтального переноса генов у прокариот заставило по-другому взглянуть на эволюцию жизни. Ранее эволюционная теория базировалась на том, что виды не могут обмениваться наследственной информацией. Прокариоты могут обмениваться генами между собой непосредственно (конъюгация, трансформация) а также с помощью вирусов — бактериофагов (трансдукция).

Характерными особенностями прокариотов является: отсутствие четко оформленного ядра; наличие жгутиков, плазмид и газовых вакуолей; структуры, в которых происходит фотосинтез; формы размножения; размер рибосомы (70s)

Ранее археи объединяли с бактериями в общую группу, называемую прокариоты (или царство Дробянки (лат. Monera)), и они назывались архебактерии, однако сейчас такая классификация считается устаревшей[4]: установлено, что археи имеют свою независимую эволюционную историю и характеризуются многими биохимическими особенностями, отличающими их от других форм жизни.

В настоящее время археи подразделяют на 5 типов. Из этих групп наиболее изученными являются кренархеоты (лат. Crenarchaeota) и эвриархеоты (лат. Euryarchaeota). Классифицировать археи по-прежнему сложно, так как подавляющее большинство из них никогда не выращивались в лабораторных условиях и были идентифицированы только по анализу нуклеиновых кислот из проб, полученных из мест их обитания.

Археи и бактерии очень похожи по размеру и форме клеток, хотя некоторые археи имеют довольно необычную форму, например, клетки Haloquadratum walsbyi плоские и квадратные. Несмотря на внешнее сходство с бактериями, некоторые гены и метаболические пути архей сближают их с эукариотами (в частности ферменты, катализирующие процессы транскрипции и трансляции). Другие аспекты биохимии архей являются уникальными, к примеру, присутствие в клеточных мембранах липидов, содержащих простую эфирную связь. Большая часть архей — хемоавтотрофы. Они используют значительно больше источников энергии, чем эукариоты: начиная от обыкновенных органических соединений, таких как сахара, и заканчивая аммиаком, ионами металлов и даже водородом. Солеустойчивые археи — галоархеи (лат. Haloarchaea) — используют в качестве источника энергии солнечный свет, другие виды архей фиксируют углерод, однако, в отличие от растений и цианобактерий (синезелёных водорослей), ни один вид архей не делает и то, и другое одновременно. Размножение у архей бесполое: бинарное деление, фрагментация и почкование. В отличие от бактерий и эукариот, ни один известный вид архей не формирует спор.

Изначально археи считали экстремофилами, живущими в суровых условиях, таких как горячие источники и солёные озёра, однако потом они были обнаружены в самых различных местах, включая почву, океаны, болота и толстую кишку человека. Архей особенно много в океанах, и, возможно, планктонные археи являются самой многочисленной группой ныне живущих организмов. В наше время археи признаны важной составляющей жизни на Земле и играют роль в круговоротах углерода и азота. Ни один из известных представителей архей не является паразитом или патогенным организмом, однако часто они бывают мутуалистами и комменсалами. Некоторые представители являются метаногенами и обитают в пищеварительном тракте человека и жвачных, где очень многочисленны и помогают осуществлять пищеварение. Метаногены используются в производстве биогаза и очистке канализационных сточных вод, а ферменты экстремофильных микроорганизмов, сохраняющие активность при высоких температурах и в контакте с органическими растворителями, находят своё применение в биотехнологии.

Другие виды организмов
Микроорганизм
Микрооргани́змы, (микро́бы) — собирательное название группы живых организмов, которые слишком малы для того, чтобы быть видимыми невооружённым глазом (их характерный размер — менее 0,1 мм). В состав микроорганизмов входят как безъядерные (прокариоты: бактерии, археи), так и эукариоты: некоторые грибы, протисты, но не вирусы, которые обычно выделяют в отдельную группу. Большинство микроорганизмов состоят из одной клетки, но есть и многоклеточные микроорганизмы, точно также как и есть некоторые одноклеточные макроорганизмы, видимые невооружённым взглядом, например Thiomargarita namibiensis, представители рода Caulerpa (являются гигантскими поликарионами). Изучением этих организмов занимается наука микробиология.

Колониа́льный органи́зм — термин, который объединяет две группы организмов:

Целью создания трансгенных организмов является получение организма с новыми свойствами. Клетки трансгенного организма производят белок, ген которого был внедрен в геном. Новый белок могут производить все клетки организма (неспецифическая экспрессия нового гена), либо определенные клеточные типы (специфическая экспрессия нового гена).

Создание трансгенных организмов используют:

в научном эксперименте для развития технологии создания трансгенных организмов, для изучения роли определенных генов и белков, для изучения многих биологических процессов; огромное значение в научном эксперименте получили трансгенные организмы с маркерными генами (продукты этих генов с легкостью определяются приборами, например зелёный флуоресцентный белок, визуализируют с помощью микроскопа, так легко можно определить происхождение клеток, их судьбу в организме и т. д.);
в сельском хозяйстве для получения новых сортов растений и пород животных;
в биотехнологическом производстве плазмид и белков.

Многие, наверное, слышали такие слова как ГМО, трансгенные организмы или просто трансгены. Мы постараемся разобраться, что же это такое и как их получают. Сейчас ученые способны переносить и встраивать гены из геномов одних организмов в геномы любых других организмов, относящихся ко всем царствам живого. Такие организмы со встроенными чужеродными генами и называют генетически модифицированными организмами — ГМО или трансгенными организмами. К настоящему времени уже создано много таких изменённых организмов. Это и бактерии, производящие инсулин, и другие необходимые человеку соединения, и животные, дающие, например, молоко со свойствами грудного женского молока, а также множество растений, которые или устойчивы к каким-то соединениям, например, к гербицидам, или сами вырабатывают какие-то полезные человеку белки, например, вакцины или антитела. ГМО создают с помощью генно-инженерных технологий или генной инженерии.

Генная инженерия — направление исследований в молекулярной биологии и генетике, конечной целью которой является получение организмов с новыми, в том числе не встречающимися в природе комбинациями наследственных свойств. В её основе лежат достижения молекулярной биологии и, прежде всего, установление универсальности генетического кода (у всех организмов включение одних и тех же аминокислот в строящуюся полипептидную цепь белка кодируется одними и теми же последовательностями трех нуклеотидов в цепи ДНК). Кроме того, успехам генной инженерии способствовала разработка возможности объединения in vitro (в пробирке) генов, выделенных из различных источников, в одну молекулу ДНК, т.е. создание рекомбинантных молекул. Поэтому генную инженерию называют ещё и техникой рекомбинантных ДНК. Таким образом, генная инженерия - это совокупность приемов, позволяющих исследователю путём операций in vitro перенести генетический материал из одного организма (который принято называть источником генов) в другой (называемый хозяином или реципиентом) так, чтобы обеспечить наследование этих генов в новом для них организме. Перенос генов методами генной инженерии дает возможность преодолевать межвидовые барьеры и передавать отдельные наследственные признаки одних организмов другим (например, от человека или животного - бактериям, растениям и др.).

Как же можно с помощью генной инженерии создать ГМО и какие методы существуют для этого?
Для того чтобы получить трансгенные организмы нужно выполнить несколько последовательных действий.
Во-первых, надо создать вектор, то есть самостоятельно реплицирующуюся молекулу ДНК. Термин репликация (от позднелат. replicatio — повторение) обозначает самовоспроизведение нуклеиновых кислот (обычно ДНК, у некоторых вирусов РНК), обеспечивающее точное копирование генетической информации и передачу ее от поколения к поколению. При репликации ДНК нуклеотидная последовательность копируется (целиком или частично) в виде комплементарной последовательности, т.е. последовательности, у которых структуры двух молекул соответствуют в пространстве, благодаря чему возможно образование между ними водородных связей и осуществление межмолекулярных взаимодействий. Вектор способен включать чужеродную ДНК (гены) и переносить ее в клетки, наследственные свойства которых желают изменить. Векторами они названы за способность осуществлять процесс переноса направленно, по желанию экспериментатора.
Во-вторых, надо знать, какой ген необходимо встроить в организм, чтобы придать ему желательные свойства, и иметь этот ген.
В-третьих, надо разработать методы переноса, чтобы векторная молекула с необходимыми генами проникла в клетки изменяемого организма и встроила в клеточный геном чужеродные гены.
И, в-четвертых, необходимо правильное конструирование векторной молекулы, чтобы встроенный ген полноценно экспрессировался в клетке. Существуют различные типы векторов с разными свойствами. Однако обычно их создают на основе ДНК плазмид или вирусов (в том числе бактериофагов).

Большое количество векторов создано на основе бактериофагов. Они позволяют вводить чужеродную ДНК в ДНК-фаг. Причем, вставляемый фрагмент ДНК может быть значительно большего размера, чем при использовании плазмидного вектора.

Ген, который хотят ввести в трансформируемый организм, чтобы придать ему новые свойства, носит название целевого гена, или гена интереса.

СОЗДАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ КОНСТРУКЦИИ

Затем эту генетическую конструкцию встраивают в плазмиду, которую каким-либо образом вводят в клетку с тем, чтобы гены встроились в клеточный геном.

КАК ПОЛУЧАЮТ ГЕНЕТИЧЕСКИ ИЗМЕНЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ?

На рисунке приведена схема генетической трансформации клетки. Фенольные компоненты пораненной растительной клетки запускают экспрессию генов vir-области Ti-плазмиды. vir-белки вырезают Т-область из плазмиды, образуя Т-цепь. Затем Т-цепь и vir-белки нескольких типов переносятся в растительную клетку через транспортные каналы. Внутри клетки vir-белки взаимодействуют с Т-цепью, формируя Т-комплекс. Этот комплекс попадает в ядро, позволяя Т-ДНК интегрировать в геном растения и экспрессировать встроенные гены

После переноса в ядро растительной клетки Т-ДНК встраивается в геном в виде одной или нескольких копий. При этом одна из нитей плазмидной ДНК деградирует, а другая за счет рекомбинации с гомологичным участком ДНК клетки-хозяина может включиться в хромосому или внехромосом-ную единицу.

МЕТОДЫ ПЕРЕНОСА ДНК В КЛЕТКИ РАСТЕНИЙ

В настоящее время применяются две основные группы методов переноса ДНК в клетки растений: прямые и агробактериальные.

I. Прямой перенос ДНК в растительную клетку

При этом способе используются различные химические и физические методы:
электропорация, бомбардировка, микроинъекции, воздействие полиэтиленгликоля (ПЭГ), ионов Са2+ и высокие значения рН. Эти методы трудоемки и дорогостоящи, однако иногда без них не обойтись. В некоторых из этих методов (электропорация, воздействие ПЭГ, или ионов Са2+ и высокого рН) в качестве объекта для введения ДНК используются протопласты, т.е. клетки, лишенные клеточной стенки. Их получают, воздействуя на растительную ткань ферментами, растворенными в осмотике разрушающими пектин и целлюлозу - пек-тиназой (мацерозимом) и целлюлазой. Осмотик, в качестве которого используются многоатомные спирты (маннит или сорбит) или сахара (глюкоза или сахароза), необходим, чтобы протопласт после переваривания клеточной стенки не разрушился. После всех манипуляций протопласты высевают на питательную среду, где они образуют клеточную стенку, делятся и формируют колонии, из которых могут образоваться растения-регенеранты.

1. Электропорация основана на том, что импульсы тока высокого напряжения обратимо увеличивают проницаемость биомембран. В среду для электропорации добавляют протопласты (Пр) и плазмидную ДНК, которую необходимо ввести в клетки. Через среду пропускают высоковольтные импульсы (напряжение 200-350В, длительность импульса 30-60 мс), приводящие к образованию пор (электропробой) в цито-плазматической мембране, время существования и размер которых достаточны, чтобы молекулы ДНК могли из внешней среды войти в клетку в результате действия осмотических сил.
2. Трансформация протопластов с помощью ПЭГ, протопластов ионов Са и высоких значений рН. В этом методе для трансформации также используют протопласты, добавляя к ним специальные соединения (раствор ПЭГ, хлористый кальций, щелочь), добавляют плазмиду и инкубируют в течение 20-30 мин. ПЭГ и ионы Са2+ воздействуют на плазматическую мембрану, окружающую протопласты, удаляя с неё положительный заряд, отталкивающий молекулы ДНК. На нейтрально заряженную мембрану прикрепляется плазмидная ДНК и проходит в клетку за счет пиноцитоза. Пиноцитоз (от греч. pfno — пью, впитываю и kytos — вместилище, здесь — клетка) — захват клеточной поверхностью жидкости с содержащимися в ней веществами. Один из основных механизмов проникновения в клетку высокомолекулярных соединений, в частности белков и углеводно-белковых комплексов. При пиноцитозе на плазматической мембране клетки появляются короткие тонкие выросты, окружающие капельку жидкости. Этот участок плазматической мембраны впячивается, а затем отшнуро-вывается внутрь клетки в виде пузырька. Пиноцитозные пузырьки способны перемещаться внутри клетки, сливаться друг с другом и с внутриклеточными мембранными структурами. В клетке мембранная оболочка растворяется, и ДНК встраивается в геном клетки.

3. Трансформация с помощью биологической баллистики (биолистика или бомбардировка). Метод биологической баллистики (биолистики), несмотря на свою сложность, является одним из самых эффективных на сегодняшний день методов трансформации растений, особенно для трансформации однодольных видов. Суть метода заключается в том, что на мельчайшие частички инертного металла (вольфрам, титан, золото), диаметром 0,6-1,2 мкм, напыляется ДНК вектора, содержащего необходимую для трансформирования генную конструкцию. Металлические частички, несущие ДНК, наносятся на пластиковую пулю и помещаются внутрь биолистической (генетической) пушки на расстоянии 10-15 см над растительной тканью-мишенью. В пушке вакуумным насосом уменьшается давление до 0.1 атм. В момент сбрасывания давления частички металла с огромной скоростью выбрасываются из специального отверстия, над которым помещается пуля, и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму и ядро клеток.

Обычно клетки, располагающиеся непосредственно по центру, погибают из-за огромного количества и давления металлических частиц, в то время как в зоне 0.6-1 см от центра находятся наиболее удачно протрансформированные клетки. Далее клетки осторожно переносят на среду для дальнейшего культивирования и регенерации. Несомненным достоинством этого метода является то, что при его использовании могут быть трансформированы не только ядерные, но и органельные геномы.

II. Перенос ДНК с помощью агробактерий
Другая наиболее распространенная группа методов — трансформация с помощью Л. tumefaciens или Л. rhizogenes, имеющих генно-модифицированные плазмиды Ti или Ri. При агробактериальных методах переноса используется, как правило, метод совместного культивирования в течение некоторого времени (от 2-3 мин до 2-3 суток) с суспензией агробактерии (co-cultivation) растительных эксплантов, то есть кусочков каких-либо частей растения, которые затем переносят для регенерации каллуса или прямого побегообразования на среду, содержащую антибиотики для подавления роста бактерий.

ОТБОР ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ РЕГЕНЕРАНТОВ

ДОКАЗАТЕЛЬСТВО ТРАНСГЕННОСТИ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ РАСТЕНИЙ, Т.Е. НАЛИЧИЕ В ИХ ГЕНОМЕ ТРАНСГЕНА

ПОЛУЧЕННЫЕ К НАСТОЯЩЕМУ ВРЕМЕНИ ТРАНСГЕННЫЕ РАСТЕНИЯ

Ученые Вашингтонского университета, университета штата Орегон и университета Пердью (штат Индиана), работающие под руководством доктора Шэрон Доти (Sharon Doty), утверждают, что созданные ими генетически модифицированные тополя в лабораторных условиях поглощают до 91% трихлорэтилена — наиболее частого загрязнителя грунтовых вод в США. Обычные растения поглощают не более 3% этого соединения. Кроме того, растущие в пробирках экспериментальные тополя, высота которых составляет всего несколько дюймов, расщепляют трихлорэтилен до безопасных соединений в 100 раз быстрее, чем не трансформированные растения.

Записи сообщества

Поиск

Одноклеточные и многоклеточные организмы

Прокариоты разделяют на два таксона в ранге домена (надцарства): Бактерии (Bacteria) и Археи (Archaea).

Колониа́льный органи́зм — термин, который объединяет две группы организмов:

Создание трансгенных организмов используют:

Читайте также: