Вакцины против реовирусной инфекции птиц
Трефилов Б.Б., доктор вет. наук, профессор,
Никитина Н.В., канд. биол. наук, ст. науч. сотр.,
Бочкарев В.С. канд. вет. наук
Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства, Санкт-Петербург, Россия
В связи с широким распространением реовирусов в природе и персистированием их даже у клинически здоровых птиц, случаи заболеваний, вызванных данным возбудителем, регистрируют по всему миру. Болезнь протекает в виде энзоотических вспышек, особенно среди вновь завозимого поголовья. В борьбе с реовирусной инфекцией важная роль отведена специфической профилактике. Разработаны как живые вирусвакцины, так и инактивированные препараты против реовирусной инфекции. В статье приведены результаты многолетних исследований по профилактике и мерам борьбы с реовирусной инфекцией птиц.
Реовирусная инфекция птиц – высококонтагиозная болезнь сельскохозяйственной и синантропной птицы, протекающая в подострой, хронической или латентно-персистирующей формах, регистрируется во всех странах с развитым птицеводством [2,3,4,6,] и наносит ощутимый экономический ущерб, обусловленный гибелью молодняка птицы (5–20%), задержкой его в росте и развитии, повышенной выбраковкой (2–15%), иммуносупрессивным действием возбудителя и затратами на проведение общих и специфических ветеринарно-санитарных мероприятий [2,6,10].
При разнообразных патологических процессах у птицы, проявляющихся в виде артрита, тендовагинита, синдрома малабсорбции, миокардита, выделены реовирусы, относящиеся к 11 серотипам [2,6]. Реовирусы являются двуспиральными РНК- содержащими вирусами, т.е. их геном состоит из двойной нити РНК [10]. Они устойчивы к физической и химической инактивации, а также к низкому значению рН и воздействию многих дезинфектантов [2].
Реовирусы птиц (Avian orthoreoviruses) относятся к роду Orthoreovirus семейства Reoviridae.
Вирионы реовируса имеют изометрический тип симметрии и состоят из двух различных морфологических элементов: наружной капсидной оболочки, включающей восьми основных структурных белков, внутреннего ядра и нуклеокапсида. Диаметр вириона составляет 60–75 нм [2], он содержит 15–20% нуклеиновой кислоты и 80–85% белка.
Источником инфекции являются больная и переболевшая птица, отмечается длительное вирусоносительство (289 сут) и трансовариальная передача вируса. Факторами передачи возбудителя считаются помет, оборудование, инструменты, транспорт, бывшие в контакте с больной птицей, обслуживающий персонал, дикая птица [2,6].
Развитие реовирусной инфекции складывается из следующих основных этапов:
? заражение восприимчивой птицы (цыпленка);
? распространение вируса в организме с учетом клеточного и тканевого тропизма;
? иммунного ответа организма;
? повреждения клеток и/или персистенция возбудителя.
В пораженных реовирусами стадах птиц клиническое проявление болезни наблюдается с 7–10 – суточного возраста. Количество заболевших цыплят составляет 1–10% и их число увеличивается до 20%. Клинические признаки различны в зависимости от возраста, вида птицы и патогенности вируса [2].
У цыплят болезнь обычно проявляется в виде нехарактерных поражений со стороны дыхательной и пищеварительной систем. Синдром малабсорбции наблюдается у птиц от 7 до 21 – суточного возраста со следующими клиническими признаками: недостаточная усваиваемость кормов, задержка роста и снижение веса. С 21 – суточного возраста и старше появляются дополнительные симптомы:
- хромота различной степени, связанная с воспалением дигитального сгибателя и тарсометатарзальных экстензорных сухожилий;
? синдром бледной птицы;
? нарушение координации и боковое лежачее положение;
? присутствие в помете непереваренных частиц корма и оранжево окрашенной слизи.
Гибель наступает от дегидратации и истощения, особенно у птиц с односторонним переломом бедра.
Диагноз на реовирусную инфекцию ставят комплексно, на основании эпизоотологических данных (комплектование родительского стада, присутствие в хозяйстве бактериальных болезней), клиникопатоморфологических признаков и результатов лабораторных исследований (серологических: исследование парных сывороток с интервалом 14 сут в РДП в агаровом геле, РНГА[2] и ИФА [6,9] по нарастанию титров сыворотки крови и увеличению положительно реагирующей птицы; вирусологических: выделение реовируса с последующей идентификацией со специфической сывороткой в реакции нейтрализации, обнаружение вирусного антигена в патологическом материале методом флуоресцирующих антител [5] и методом индикации генома реовируса на основе ОТ-ПЦР [1].
Реовирусную инфекцию птиц следует дифферецировать от инфекционных болезней, сопровождающихся признаками поражения опорно-двигательной системы (стафилококкоз, пастереллез, микоплазмоз, колибактериоз, паразитарные болезни), а также от патологий, связанных с нарушениями условий кормления и технологией выращивания птицы (авитаминозы, недостаточность макро- и микроэлементов, микотоксикозы).
Профилактика реовирусной инфекции птиц (неспецифическая и специфическая) достигается выполнением следующих положений:
? соблюдение оптимальных условий технологии содержания и сбалансированного кормления, а также профилактических перерывов между посадками птицы;
? предотвращение заноса инфекции в благополучное хозяйство и стадо;
? применение эффективных схем вакцинации молодняка и родительского поголовья птицы.
Основным подходом к контролю реовирусной инфекции (теносиновит, синдром малабсорбции) является вакцинопрофилактика. Клинические признаки болезни проявляются у цыплят, преимущественно зараженных в суточном возрасте, хотя птица может быть инфицирована в любом возрасте, поэтому программы вакцинации разработаны для защиты цыплят в первые недели после вывода (в период наибольшей восприимчивости).
В РФ для специфической профилактики болезни применяют аттенуированные вирусвакцины из штаммов реовируса ВНИВИПДЕП [6,7,8] и S1133 и инактивированные вакцины как моно-, так и поливалентные из эпизоотического штамма 1733 или изолята реовируса, циркулирующего в данном регионе.
Стратегия и тактика ВНИВИП заключается в использовании инактивированных вакцин с раннего возраста (включая бройлеров).
Проведение вакцинопрофилактики реовирусной инфекции птиц инактивированными вакцинами в раннем возрасте преследует следующие цели:
? повышение сохранности и продуктивности птицы;
? производство высококачественной, экологически чистой продукции;
? усиление уровня иммунного ответа после применения вирусвакцин и защита птицепоголовья от инфекции на протяжении всего продуктивного периода;
? снижение уровня иммунодепрессии и, как следствие, уменьшение проявления секундарных инфекций; ? подавление циркуляции эпизоотических штаммов реовируса, вызывающих субклиническое течение болезни.
Специфическая профилактика реовирусной инфекции птиц должна строиться исходя из эпизоотической ситуации в птицехозяйстве с учетом антигенной вариабельности вакцинного штамма и изолята реовируса, циркулирующего в данном регионе.
Возможные схемы иммунопрофилактики птиц:
1. Цыплята-бройлеры – однократная вакцинация аттенуированной вирусвакциной в возрасте 7–10 сут согласно инструкции по применению.
2. Цыплята-бройлеры – однократная вакцинация аттенуированной бивалентной вирусвакциной, включая в состав вакцины штамм реовируса, вызывающий синдром малабсорбции, в возрасте 7–10 сут согласно инструкции по применению.
3. Ремонтный молодняк – I вакцинация в возрасте 7–10 сут аттенуированной вирусвакциной (при необходимости бивалентной, включающей штамм вируса малабсорбции). Ревакцинация в возрасте 35–40 сут аттенуированной вирусвакциной против реовирусной инфекции. Третья вакцинация инактивированным препаратом, изготовленным из антигенно родственного эпизоотического штамма реовируса, циркулирующего в данном хозяйстве.
4. Промышленное стадо – I вакцинация в возрасте 7–10 сут аттенуированной вирусвакциной согласно инструкции по применению. Ревакцинация в возрасте 40 сут инактивированным препаратом, изготовленным из антигенно родственного эпизоотического штамма реовируса, циркулирующего в данном хозяйстве. Успех специфической профилактики достигается при соблюдении оптимальных условий содержания и сбалансированного кормления птицы.
1. Андрейчук, Д. Б. Разработка молекулярно-биологических методов диагностики реовирусной инфекции кур и изучение изолятов, выявленных на территории РФ: автореф. дис. … канд. биол. наук.– Владимир, 2005.– 24 с.
2. Герман, В. В. Реовирусные заболевания индеек (эпизоотология, диагностика и меры борьбы): дис. … докт. вет. наук.– Харьков, 1988.– 308 с.
3. Коровина, В. В. Изучение распространения и антигенных взаимоотношений штаммов реовируса теносиновита кур: дис…канд. вет. наук.– СПб, 2001.– 116 с.
4. Пругло, В. В. Течение реовирусного теносиновита кур в ассоциации с кокковыми инфекциями: дис. … канд. вет. наук.– СПб, 2005.– 139 с.
6. Трефилов, Б.Б. Разработка и внедрение средств диагностики и специфической профилактики наиболее опасных вирусных болезней птиц (инфекционный ларинготрахеит, вирусный энтерит гусей, реовирусный теносиновит): дис. … докт. вет. наук.– СПб, 2000.– 42с.
8. Трефилов, Б.Б., Коровин Р. Н., Никитина Н. В., Явдошак Л. И., Горецкая Т.И. Сухая вакцина против реовирусного теносиновита кур// Патент РФ № 2166328, 2000.
9. Трефилов, Б. Б. Способ определения антител к антигену реовирусного теносиновита кур / Б.Б. Трефилов Р. Н. Коровин, Н. В. Никитина, Л. И. Явдошак // Патент РФ № 2192012, 2002.
10. Sekiguchi, K., Koide F. Characterization of avian reovirus ribonucleic acid // Arch. Ges. Virusfozsch.– 1974.– V.46.– P. 156–166.
Реовирусная болезнь птиц, индеек (синий гребень, трансмиссивный энтерит, инфекционный энтерит, реовирусный энтеронефрит), кур и цыплят (теносиновит, вирусный артрит, синдром “бледной птицы” и “неусвоения корма”), гусей и утят, проявляющаяся разнообразным симптомокомплексом и наносящая значительный финансовый ущерб.
Описание заболевания
Реовирусная инфекция птиц — вирусное контагиозное заболевание птиц, характеризующаяся диареей, артритами и теносиновитами:
- Этиология. Раздражитель болезни — РНК-содержащий вирус семейства Reoviridae. Вирус может длительное время персистировать в зараженном организме. Растет на куриных эмбрионах. В культуре клеток почки цыплят с возникновением синтициев.
- Эпизоотология. Заболеют куры и цыплята. Источником инфекции считается больная и переболевшая птица-носитель вируса (вирусоносительство длится 289 дней). Заражение протекает алиментарным путем, а также трансовариально. Перенесение вируса происходит через инкубируемое яйцо, приобретаемое как от больной, так и от переболевшего животного. Факторами передачи инфекции служат инфицированные помет, влага, корма, инвентарь и предметы ухода. Смертельный исход может достигать 30% на 100%-ной заболеваемости.
- Патогенез. Вирус плодится в эпителиальных клетках кишечника, образует развитие катарального энтерита, желточного воспаления. В дальнейшем происходит формирование лимфоидных фолликулов в сухожилиях и атрофия яичников.
Возбудителем болезни является РНК-содержащий реовирус с размером частицы 75–76 нм. Принадлежит к семейству Reoviridae.
Морфологически вирусы аналогичны с реовирусом 3‑го типа. Плавающяя плотность их в хлористом цезии 1,37 грамм на кубический сантиметр. Вирус заключает 2‑нитевую РНК и олигонуклеотиды, богатые аденозином. Капсид содержит восемь специфических полипептидов, из них лишь один с мол.м. 36 кД располагается внутри капсида, либо в наружной мембране вириона.
Вирионы располагают икосаэдрической формой, плотное ядро размером 45 нм, которое располагается в центре, окружены наружней оболочкой толщиной 15 нм, молекулярный вес их предположительно 70 млн дальтон, плавающяя плотность белков 1,36–1,38 грамм на кубический сантиметр.
Вирионы с наружной оболочкой располагают транскриптазной и метилазной активностью. Изображен серотип птичьего реовируса Фехи-Кроули. Вирионы обладают 2‑слойной оболочкой, диаметр их 65–70 нм. Полипептиды птичьих реовирусов, аналогично реовирусам млекопитающих, разделены на три класса по величине: большие, средние и малые. В инфекционных вирионах выявлены полипептиды с мол.м. 145,130 и 115 кД сообразно.
Все три полипептида находятся на внешней стороне вириона. Зафиксировано, что мРНК реовируса — копии полной протяженности геномных матриц; инициирующих кодон АУГ. На 3′-конце плюс-цепи всех фрагментов найдена схожая последовательность семи нуклеотидов: ААУЦАУЦ.
У заболевшего молодняка на 5‑ый день регистрируется понос, угнетение и показатель смертности до 5% и более. У уцелевших индюшат и гусят может формироваться инфраорбитальный синусит, конъюнктивит. Болезнь приобретает хронический характер, молодое поколение отстает в формировании.
У цыплят к трехнедельному возрасту формируется теносиновит, при котором регистрируется неправильная постановка ног, хромота. В неблагополучной по реовирусной инфекции группе остро выражена пестрота в развитии молодняка, частым симптомом является “высыхание” тушки за счет низкой поедаемости и усвояемости корма.
При инфецировании птицы реовирусом в 10–30 дней заболевание проходит менее остро, отход не превосходит 1,5–5%, однако планируемой производительности от такой птицы не добывают.
Наиболее значительный отход при резком течении реовирусной инфекции отмечается у молодняка птицы мясных пород: у бройлеров 5–18%, гусят и индюшат — 50%, утят — до 100%.
При естественном ходе инфекции фиксируют отеки сухожильных влагалищ и кровоизлияния в них, в полости пораженных суставов эксскудат. При хроническом ходе заболевания выявляется утолщение сухожильного влагалища, дегидратация, анкилоз сустава, вероятны разрывы атрофированного сухожилия.
Реовирус стабилен к воздействию внешней среды и разнообразных физико-химических факторов — к солнечному излучению, к изменению рН в широком спектре, относительно мало чувствителен к обычным обеззараживающим средствам.
Многократное замораживание и размораживание отрицательно воздействует на биологическую активность реовируса. Инфекционная активность вируссодержащего желточного материала не уменьшается при температуре плюс 22 С 51 неделю, при темпрературе воздуха минус 20 С — 4 года. Из неоплодотворённых яиц вирус отделяется на 61‑е сутки после инфицирования несушек.
Пары формальдегида не обезвреживают его на поверхности скорлупы инкубационных яиц, птенцы могут инфицироваться реовирусом при наклеве на выводе. Дезактивация возбудителя наступает при влиянии на него этанола в концентрации 70 процентов и раствора йода с объёмной долей 0,5 процентов.
Лечение и профилактика
Диагноз на реовирусную инфекцию устанавливают комплексно, на основании эпизоотологических сведений (комплектование родительского стада, пребывание в хозяйстве бактериальных заболеваний), клиникопатоморфологических признаков и конечных результатов лабораторных исследований (серологических: испытание парных сывороток с промежутком 14 суток в РДП в агаровом геле, ИФА и РНГА по нарастанию титров сыворотки крови и повышению положительно реагирующей птицы; вирусологических: выделение реовируса с дальнейшей идентификацией со характерной сывороткой в реакции нейтрализации, выявление вирусного антигена в патологическом материале способом флуоресцирующих антител и способом индикации генома реовируса на базе ОТ-ПЦР.
Профилактика реовирусного заболевания кур состоит в следующем:
- Не допустить заноса раздражителя в свой двор, ферму, инкубатор, для этого покупать птицу, инкубационные яйца лишь в благополучном предприятии (птицефабрика, ИПС).
- Для профилактики инкубационные яйца обеззараживают 0,4 %-ным раствором эстостериола в очищенной воде при +35°С, выдержка — семь минут, из расчета 35–50 миллилитров на одно яйцо. После обеззараживания яйца просушивают вентилятором и инкубируют в приготовленном инкубаторе (очищенном, продезинфицированном и помытом).
- При появлении очевидных симптомов болезни (сплошные поносы, синуситы) у индеек, кур и цыплят принимают меры для того, чтобы установить причины болезни, для чего вызвать районного ветврача.
- С целью увеличения резистентности (устойчивости) птицы повысить кормление, ввести увеличенные дозы витаминов в антистрессовых порциях; на 2–3°С увеличить нормативный уровень температуры в строении; улучшить обмен воздушных масс.
- Вводить антибиотики (байтрия, энроксил, парацилин, гентамицин) на протяжение 3–5 дней.
- К корму вносить витаминный комплекс на протяжение 3–5 дней, согласно назначениям ветврача.
- Периодически выполняют обеззараживание помещений дезинфектантами нового поколения (СИД-2000, вироцид).
- При наличии птицы в строении осуществлять обеззараживание йодистыми препаратами, либо вирконом С, либо вироцидом согласно назначениям ветспециалистов.
- Давать птице сульфодимезин 60 грамм на 1000 гол., курс лечения 5–7 дней.
- В племхозяйствах, где имеются родительские стада, прививают птицу против реовирусной инфекции: впервые живой вакциной ІЗео, штамм 1133 второй и третий раз инактивированной вакциной Пэо, штамм 2408 и 1733 (производитель, ф. Интервет, Голландия).
- В помещении, внутри двора, где живет и выгуливается птица, постоянно соблюдать высокую санитарную культуру. Производственные стада против реовирусной инфекции не прививаются.
Важность профилактики
Глобальное распространение реовируса птиц, его стабильность, увеличение ферм, уменьшение времени между посадками, очень высокая концентрацией птичьей популяции сообщает о том, что уничтожение реовирусной инфекции в хозяйствах может быть сложным делом. Кроме того, реовирус располагает иммунодепрессивным действием, что ведёт к повышению восприимчивости к остальным инфекциям.
Реовирусный теносиновит стимулирует и обостряет основное заболевание, обуславливая в будущем его скрытое течение без очевидных клинических признаков. У переболевшей птицы фиксируют авитаминоз, заторможенный рост, плохое оперение, искажение костей и аномалии скелета, остеопороз, увеличенную раннюю смертность, уменьшение уровня расплода, иммунодепрессию.
В племенных хозяйствах фиксируют снижение половой активности петухов, что становится причиной уменьшения оплодотворяемости и выводимости инкубационных яиц.
Поэтому очень важно корректно диагностировать реовирусный теносиновит, применяя эпизоотологические, клинические, патологоанатомические сведения, окончательный диагноз устанавливается на основании результатов лабораторных испытаний.
Для профилактики заноса инфекции необходимо выполнять ветеринарно-санитарные правила и эксплуатировать средства специфической профилактики — инактивированные и живые вакцины против реовирусного заболевания птиц.
Перед применением препарата обязательно проконсультируйтесь с ветеринаром.
Ветеринарный врач Фролов Владимир Владимирович
Телефон (вызов на дом): 8-965-449-26-10
Фармацевтическая группа:
Иммунотропные средства. Вакцина.
Назначение:
Вакцина предназначена для профилактики ньюкаслской болезни и реовирусного теносиновита птиц в племенных и товарных птицеводческих хозяйствах различного направления выращивания.
Симптомы ньюкаслской болезни птиц:
Особо высокая °С, потеря аппетита, угнетение, лежание с опущенной головой. Развиваются конъюнктивит, кашель, чиханье, характерны каркающие звуки, клюв открыт. Наблюдаются понос, чаще с примесью крови, шаткая походка, параличи крыльев, конечностей. Гибель наступает через 3-10 суток после начала болезни.
При подостром течении наблюдаются судороги, парезы, иногда параличи конечностей, дерганье головой и перекручивание шеи.
При хроническом течении симптомы почти такие же, как и при подостром.
Атипичное течение характеризуется только гибелью птицы (до 10—25%).
Искривление пальцев ног при теносиновите
Симптомы реовирусного теносиновита птиц:
У заболевшего молодняка на 5-ый день отмечается понос, угнетение и смертность до 5% и более. У выживших индюшат и гусят может развиваться инфраорбитальный синусит, конъюнктивит. Заболевание приобретает хронический характер, молодняк отстает в развитии. У цыплят к трехнедельному возрасту развивается теносиновит, при котором отмечается неправильная постановка ног, хромота. В неблагополучной по реовирусной инфекции группе резко выражена пестрота в развитии молодняка, частым признаком является "высыхание" тушки за счет пониженной поедаемости и усвояемости корма.
При естественном течении инфекции отмечают отеки сухожильных влагалищ и кровоизлияния в них, в полости пораженных суставов эксскудат. При хроническом течении заболевания выявляется утолщение сухожильного влагалища, обезвоживание, анкилоз сустава, возможны разрывы атрофированного сухожилия.
Состав:
Биологические свойства:
Вакцина вызывает формирование иммунного ответа у цыплят и кур к возбудителям ньюкаслской болезни и реовирусного теносиновита птиц через 28 суток после однократного применения, который сохраняется в течение 12 месяцев. Вакцинацию считают успешной, если не менее чем у 80% привитых птиц средний титр антител составляет:
- к вирусу НБ не ниже 1:64 (6,0 log2) в РТГА или в ИФА в 2 и более раз превышает минимальное положительное значение, предусмотренное инструкцией по применению используемого диагностического набора;
- к реовирусу птиц в ИФА в 2 и более раз превышает минимальное положительное значение, предусмотренное инструкцией по применению используемого диагностического набора
При напряжённости иммунитета менее чем у 80% птицу ревакцинируют. Вакцина безвредна, лечебными свойствами не обладает.
Применение:
Вакцинации подлежит птица начиная с 30-суточного возраста, но не позднее, чем за 1 месяц до начала яйцекладки. Перед применением вакцину выдерживают в течение 2-4 часов при температуре от 20°С до 25°С. Запрещается подогревание вакцины на водяной бане и приборах отопления. Перед применением и во время использования флакон с вакциной тщательно взбалтывают для восстановления однородности эмульсии. Вакцину вводят однократно в объёме 0,5 см 3 подкожно в область средней трети шеи или внутримышечно в область грудной мышцы с соблюдением правил асептики. Для вакцинации используют шприцы-автоматы, которые стерилизуют кипячением в течение 20 минут. Допускается использование одноразовых шприцов. Место инъекции дезинфицируют 70% раствором этилового спирта или другими антисептиками. Через 28 суток после вакцинации проводят контроль напряжённости иммунитета к вирусам НБ и РЕО, исследуя не менее 25 проб сывороток крови.
Форма выпуска:
Вакцина расфасована по 100, 200 или 250 см 3 (200, 400 или 500 прививных доз) в стерильные стеклянные или пластиковые флаконы соответствующей вместимости, герметично укупоренные резиновыми пробками, укреплёнными алюминиевыми колпачками.
Срок годности и условия хранения:
Срок годности вакцины 12 месяцев с даты выпуска при соблюдении условий хранения и транспортирования. По истечении срока годности вакцина к применению не пригодна. Вакцину хранят и транспортируют в сухом тёмном месте при температуре от 2°С до 8°С. Замораживание вакцины не допускается.
Где купить?
Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Технология изготовления инактивированной вакцины против реовирусного теносиновита птиц
На правах рукописи
Для служебного пользования . . № 58 дсп от 25.10.2000 экз. № ^
УДК 619:616.72 - 002-002.6:615.371
Шкиря Владимир Иванович
ТЕХНОЛОГИЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ РЕОВИРУСНОГО ТЕНОСИНОВИТА ПТИЦ
диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук
Работа выполнена в ФГУ Всероссийский научно-исследовательский институт защит! животных (ВНИИЗЖ) Министерства сельского хозяйства Российской Федерации.
Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук,
старший научный сотрудник Старое С.К.
Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, старший научный
сотрудник Русалеев B.C. (ВНИИЗЖ, г.Владимир
доктор биологических наук,
профессор Сафонов Г.А. (ПЗБ, г.Покров)
Ведущая организация: Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ, г.Москва)
Защита диссертации состоится «¿9у> декабря 2000 года в/С часов н заседании диссертационного совета Д 120.60.01. при Всероссийском научнс исследовательском институте защиты животных Минсельхоза России по адрес; 600900, Владимир, п/о Юрьевец, ВНИИЗЖ.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИЗЖ.
диссертационного совета - Г.М. Семенова
1.Общая характеристика работы
Актуальность темы. В современных условиях развития промышленного птицеводства выявляется большое количество новых инфекционных заболеваний вирусной этиологии. Одним из таких заболеваний является реовирусная инфекция птиц. Для обеспечения ветеринарного благополучия птицеводческих хозяйств в отношении этого заболевания первое место занимает специфическая профилактика.
Первое выделение реовируса у птиц относится к 1954 г., когда Fahey J.E. и Crawley J.F. изолировали вирус из дыхательных органов цыплят с хронической респираторной болезнью. "
Случаи естественного артрита у цыплят вирусной этиологии были впервые описаны в США (Olson N.O. 1966). Впоследствии было доказано, что агент, вызывающий заболевание, является реовирусом (Walker E.R. 1972).
Со времени первых докладов о заболевании в США оно зарегистрировано во многих странах мира, включая Австрию, Аргентину, Бразилию, Францию, Израиль, Италию, Нидерланды, Великобританию и Россию. На территории Российской Федерации за период 1990 - 1997 г.г., по данным ВНИВИП и ВНИИЗЖ, реовирусная инфекция птиц отмечена во многих птицеводческих хозяйствах.
Экономический ущерб, причиняемый птицеводству реовирусной инфекцией, часто связан с уменьшением яйценоскости на 6 - 20%, низкими привесами, плохой усвояемостью корма, понижением товарности, выбраковкой поражённой птицы и расходами на проведение ветеринарно-санитарных мероприятий. В племенных хозяйствах отмечают снижение половой активности петухов (van der Heide L. 1977, Dobson K.N. 1992).
Реовирусная инфекция птиц может быть ассоциирована с рядом клинических проявлений: теносиновитом, синдромом маладсорбции, авитаминозом, тимусной и бурсальной атрофией.
Повсеместное распространение реовируса птиц, его устойчивость, укрупнение ферм, уменьшение времени между посадками, а также тенденция к увеличению концентрации птичьей популяции говорит о том, что искоренение реовирусной инфекции в хозяйствах может быть трудным. Это также связано с тем, что вирус может передаваться как вертикальным, так и горизонтальным
Для специфической профилактики реовирусного теносиновита кур во многих странах применяют как живые, так и инактивированный вакцины. Схема профилактики предусматривает вакцинацию несушек инактивированными вакцинами с целью создания напряженного иммунитета в родительском стаде, что приводит к получению достаточного уровня пассивного иммунитета у цыплят с 1-го дня жизни. В настоящее время, в ветеринарной практике отсутствуют инактивированные вакцины отечественного производства против реовирусного теносиновита птиц, которые обеспечивали бы достаточно напряженный и продолжительный иммунитет. Очевидно, что в этой ситуации современн£му промышленному птицеводству необходима высокоиммунагенная инактивированная вакцина против реовирусной инфекции птиц.
Успехи, достигнутые в последние годы в области биотехнологии, а также большой опыт, накопленный сотрудниками института в области конструирования вакцин, делают вполне реальной разрешение задачи по созданию промышленной технологии изготовления и контроля инактивированной вакцины против реовирусного теносиновита птиц.
Цели и задачи исследований. Целью работы является разработка технологии изготовления и контроля инактивированной вакцины против реовирусной инфекции птиц. Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
• отработать получение биологически активного вирусного сырья;
• изучить вирулицидную активность различных инактивантов в отношении реовируса птиц;
• подобрать компонентный состав инактивированной вакцины против реовирусной инфекции птиц;
• изучить иммуногенную активность инактивированной вакцины против реовирусного теносиновита птиц с учетом динамики титров антител;
• отработать схему вакцинации в зависимости от кратности и сроков ревакцинации;
• разработать нормативно-техническую документацию на инактивированную вакцину против реовирусного теносиновита птиц;
• провести лабораторные и производственные испытания инактивированной вакцины против реовирусного теносиновита птиц;
• разработать промышленный регламент по изготовлению и контролю инактивированной вакцины против реовирусного теносиновита птиц.
Научная новизна. Разработана технология изготовления и контроля инактивированной вакцины против реовирусной инфекции птиц.
Выбрана чувствительная система культивирования реовируса птиц с использованием первично-трипсинизированной культуры клеток фибробластов куриных эмбрионов.
Отработан режим инактивации реовируса птиц аминоэтилэтиленимином в концентрации 0,08% в течение 24 часов при температуре 37°С.
Подобран компонентный состав инактивированной вакцины против реовирусного теносиновита птиц.
Изучена иммуногенная и антигенная активность инактивированной вакцины против реовирусного теносиновита птиц.
Практическая ценность работы. В результате выполненных исследований ветеринарной практике и промышленному птицеводству предложен препарат с высокими иммунобиологическими свойствами для профилактики реовирусного теносиновита птиц.
1. Разработаны и утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ нормативные документы на получение инактивированной эмульгированной вакцины против реовирусного теносиновита птиц, в которые входят:
• Технические условия на вакцину против реовирусного теносиновита птиц инактивированную эмульгированную ТУ 9384-017-00495527-99
• Наставление по применению вакцины против реовирусного теносиновита птиц
• Промышленный регламент на производство вакцины против реовирусного теносиновита птиц инактивированной эмульгированной
2. Рекомендуется использование шт.1733 реовируса птиц в качестве контрольного вирулентного штамма для контроля поствакцинального иммунитета.
3. Предложена методика титрования реовируса птиц и определения вируснейтрализующих антител в первичной культуре клеток фибробластов эмбрионов кур.
Основные положения, выносимые на защиту:
• Инактивация реовируса птиц формальдегидом и аминоэтилэтиленимином
• Подбор оптимального компонентного состава инактивированной вакцины против реовируса птиц
• Изучение иммуногенной активности вакцины против реовирусной инфекции птиц
• Технологический регламент изготовления и контроля инакгивированной вакцины
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 125 страницах, иллюстрирована 6 рисунками и 14 таблицами. Список использованной литературы включает 211 источников, из них 187 иностранных.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1.1. Штамм реовируса птиц
Культуральный реовирус птиц штамм S1133, выращенный монослойным способом в первичной культуре клеток фибробластов куриных эмбрионов, с титром инфекционности не менее 8,00 Lg ТЦЦ 50/мл.
Культуральный реовирус птиц штамм 1733, выращенный монослойным способом в первичной культуре клеток фибробластов эмбрионов кур, с титром инфекционности не менее 7,50 lg ТЦДбо/мл
2.1.2. Подопытная птица
Цыплята мясных и яичных пород, не иммунные к реовирусу птиц, 30-40-дневного возраста, средней массой 150-300 граммов и молодка 90-120-дневного возраста массой 1,0-1,5 кг.
2.1.3. Культуры клеток и куриные эмбрионы.
2.1.4. Культивирование реовируса птиц
Культивирование реовируса птиц шт. S1133 для производства инакгивированной вакцины проводили в первично-трипсинизированной культуре клеток фибробластов эмбрионов кур (ФЭК). Предназначенную для
культивирования вируса культуру клеток, готовили из кожно-мышечной ткани 12-дневных СПФ-эмбрионов кур.
В роллерные сосуды с монослоем клеток ФЭК вносили по 10 мл производственной расплодки реовируса птиц из расчета 0,1 ТЦЦ/кл.
Сосуды с инфицированной культурой помещали в роллерный аппарат при температуре 37±1 °С на 1 час для контакта вируса с клетками. После этого в роллерные сосуды заливали поддерживающую среду ПСП рН 7.3-7.4 с 2% инактивированной сыворотки КРС в объеме 300 мл.
2.1.5. Очистка реовируса птиц Культуральный реовирус осветляли низкоскоростным центрифугированием при 2000 об/мин в течение 20 минут.
2.1.6. Инактивация инфекционности реовируса птиц Инактивацию инфекционной активности вируса проводили аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) в концентрации 0,08% в течение 24 часов при температуре 37°С и формальдегидом в концентрации 0,08% в течение 24 часов при температуре 37°С.
2.1.7. Определение полноты инактивации Оценку полноты инактивации реовируса проводили в монослое культуры клеток ФЭК двухсуточного возраста.
3.1.8. Концентрирование суспензии реовируса птиц Концентрирование сорбцией на гель ГОД проводили следующим образом: к инактивированной суспензии реовируса (рН 7,4-7,6) добавляли расчетные количества 3% геля ГОА, смесь перемешивали, а затем отстаивали в течение 24 часов при температуре 4 °С. Надосадочную жидкость сливали до нужной концентрации сорбента.
Для концентрирования инактивированной суспензии реовируса предварительно готовили 50% раствор ПЭГа. Полученный раствор ПЭГа добавляли к антигену реовируса в расчетных количествах, смесь тщательно перемешивали. Также в раствор добавляли NaCI в конечной концентрации 3%. Суспензию выдерживали при температуре 4 °С 18 часов. По истечении указанного срока смесь центрифугировали, а осадок ресуспендировали.
Экспериментальные серии эмульгированной вакцины готовили путем смешивания 3 частей масляного адъюванта (ISA - 70) и 1 части инактивированной
суспензии реовируса. Смесь эмульгировали в гомогенизаторе в течение 5 минут при 3000 об/мин., до получения однородной эмульсии.
Экспериментальные серии сорбированной ГОА вакцины против реовируса птиц, изготавливали из инактивированной суспензии вируса адсорбированного на ГОА с добавлением сапонина.
2.1.10. Контроль вакцины Контроль эмульсионной и сорбированной форм инактивированной вакцины против реовирусного теносиновита птиц осуществляли путем определения стерильности, безвредности, реактогенности, иммуногенной активности вакцины.
2.1.11.1. Определение стерильности Испытание на стерильность вакцины проводили по ГОСТ 28085-89 (ст. СЭВ 6280-88), "Препараты биологические. Методы бактериологического контроля стерильности".
2.1.11.2. Проверка на безвредность и реактогенность вакцины Контроль на безвредность проводили на 10 цыплятах 90-120 суточного возраста, полученных из хозяйств, благополучных по острым инфекционным болезням птиц.
Проведение испытания проводили следующим образом: 3-х кратную дозу вакцины (1,0мл) вводили 10 цыплятам в мышцу груди, а 5 цыплят оставляли интактными. Вакцина считается безвредной, если 10 цыплят в течение указанного срока остаются живыми, без клинических признаков переболевания.
2.1.11.3. Проверка антигенной активности вакцины Антигенную активность определяли на опытной и контрольной группах цыплят 90-120 дневного возраста, по 10 голов в каждой. Цыплятам опытной группы вакцину вводили в мышцу груди в объеме 0,3 мл.
Через 21 сутки от птицы контрольной и опытной групп отбирали пробы крови из подкрыльцовой вены. Пробы сыворотки крови исследовали в РН или ИФА.
Вакцина считается антигенноактивной, если титр антител в сыворотке крови у 80% вакцинированных птиц через 21 день после иммунизации не ниже 1:800 или прирост антител составляет не менее двух разведений по сравнению с исходным.
2.1.12. Статистическая обработка результатов исследований Для обработки результатов исследований использовали статистические методы в биологии (И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев, 1962 г.).
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.2.1. Изучение антигенной активности вакцин из вируса, полученного в различных системах культивирования
Для успешной разработки технологии изготовления и контроля
инактивированной вакцины против реовирусного теносиновита птиц на первом этапе исследований необходимо было выбрать систему культивирования реовируса птиц шт. S1133, обеспечивающую урожай вируса с высокими иммунобиологическими свойствами.
В качестве тестируемых систем для культивирования реовируса нами были выбраны: 10-дневные СПФ-эмбрионы (КЭ-вирус), первичная культура клеток фибробластов эмбрионов кур (ФЭК-вирус) и культура клеток Vero (Vero-вирус). Цыплят прививали в дозе 0,3 мл. Отбор крови для исследований проводился на 14 и 21 день после вакцинации. В результате исследований установлено, что вакцинация птиц препаратами из вирусов, полученных в различных системах культивирования, индуцирует на 14 день после введения вакцины образование антител против реовирусного теносиновита с повышением к 21 дню до уровня 1:3455±329, 1:4745±267, 1:4172±211, соответственно (р -0,08 формалин -¿г-0,16 формалина
Рисунок 2. Динамика инактивации реовируса птиц с использованием формалина при температуре 37°С.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что для изготовления инактивированной вакцины против реовирусного теносиновита птиц возможно применение, как формальдегида, так и АЭЭИ. Однако, учитывая более высокую антигенную активность вакцин на основе АЭЭИ, для дальнейшей работы нами использовался АЭЭИ.
2.2.4. Изучение концентрирования реовируса птиц
Для изучения условий концентрирования реовируса птиц использовали: гидроокись алюминия и полиэтиленгликоль (ПЭГ м.м. 6000). Исходным материалом служил реовирус птиц с инфекционной активностью 8,00±0,25 Ig ТЦДбо/мл. После концентрирования отбирали пробы для определения титра инфекционности надосадочной жидкости на культуре клеток ФЭК. Результаты исследований свидетельствуют о том, что повышение концентрации ПЭГа и ГОА в суспензии реовируса птиц снижают потери вируса при концентрировании. При этом в надосадочной части суспензии реовируса птиц при титровании на культуре ФЭК, инфекционная активность вируса составляла 2,50±0,12 Ig ТЦЦ50/мл и 3,00±0,25 Ig ТЦД50/мл, соответственно. Наиболее оптимальной является конечная концентрация ПЭГа 8% с добавлением 3% NaCI, а концентрация ГОА - 0,8%.
2.2.5. Выбор компонентного состава инактивированной вакцины против реовирусной инфекции птиц
Напряженность и длительность иммунитета у птиц зависит от количества и качества антигена, а также использования неспецифических стимуляторов иммуногенеза, т.е. адъювантов.
Перед нами стояла задача определения количества антигена и выбора адъюванта, обеспечивающего получение иммуногенных вакцин. Были проведены сравнительные испытания эмульсионной вакцины с использованием адъюванта ISA-70 и сорбированной ГОА-вакцины с добавлением сапонина в сравнении с исходным инактивированным вирусом. Для изучения влияния концентрирования на атигенные свойства реовируса птиц проводили концентрирование антигена в 5 и 25 раз, при помощи ГОА и ПЭГа.
Образцы вакцины испытывали на цыплятах 30-дневного возраста, которым вводили экспериментальные вакцины в дозе 0,3 мл внутримышечно. Цыплят в количестве 90 голов разделили на 6 групп. Первую группу цыплят иммунизировали исходным вирусом, 2-ю - эмульгированной вакциной (без концентрирования), 3-ю - эмульгированной (концентрированной в 5 раз), 4-ю -эмульгированной (концентрированной в 25 раз), 5-ю - сорбированной
(концентрированной в 5 раз), 6-ю - сорбированной вакциной (концентрированной в 25 раз). Антигенную активность препаратов оценивали в ИФА по наличию в сыворотках крови антител. Кровь отбирали через 21 сутки после иммунизации. Результаты исследований представлены в таблице 2.
Сравнительное изучение антигенной а>стивности ГОА и эмульсионных
№ Вакцины Доза вакцины мл Титр антител в ИФА (М±т) Титрогруппа в ИФА
1" Нативный вирус (исходный инак-тивированный антиген) 0,3 1:3407±562 4
2 Эмульгированная без конц. 0,3 1:6412±754 7
3 Эмульгированная конц. в 5 раз ПЭГом 0,3 1:6583±927 7
4 Эмульгированная конц. в 25 раз ПЭГом 0,3 1:8358±996 9
5 Сорбированная конц, в 5 раз 0,3 1:5694±773 6
6 Сорбированная конц. в 25 раз 0,3 1:7394±973 8
Читайте также: