Для бактериологической диагностики лептоспироза используют

Таксономия боррелий, лептоспир и трепонем, и названия заболеваний, вызываемых ими.

Вид: B. recurrentis – возбудитель эпидемического возвратного тифа.

Вид: T. pallidum - возбудитель сифилиса

Вид: L. Icterohaemorrhagiae – возбудитель лептоспироза

Микроскопическая диагностика сифилиса.

Темнопольная микроскопия: перед исследованием берут тканевую жидкость со дна язвы или пунктат лимфатического узла. Готовят препарат раздавленной капли: на середину предметного стекла наносят каплю исследуемого материала, каплю накрывают покровным стеклом так, чтобы не было пузырьков воздуха. Положительный результат: при микроскопии обнаруживаются трепонемы с равномерными 8-12 крупными завитками. Для них характерны плавные вращательно-поступательные, маятникообразные и сгибательные движения.
При окраске по Романовскому-Гимзе: возбудитель сифилиса окрашивается в бледно-розовый цвет, другие трепонемы – в красновато-фиолетовый.

Реакции, используемые в серодиагностике сифилиса. Общая характеристика каждой из них.

РСК (реакция Вассермана): Компоненты: 1 система – сыворотка больного, диагностикум, комплемент, ИХН; 2 система – гемолитическая сыворотка и взвесь эритроцитов барана. Готовят 1 систему, инкубируют 37С 1 ч. Добавляют вторую, инкубируют 37С 1 ч. Положительный результат – отсутствие гемолиза.

РПГА: Компоненты: ИХН, сыворотка больного, эритроцитарный диагностикум. Готовят разведения сыворотки, добавляют диагностикум, в термостат 24 ч 37С. Пол. результат: зонтик.

ИФА: Компоненты: сыворотка больного, диагностикум, конъюгат, хромогенный субстрат. Связывают диагностикум с пластиком лунки планшета, вносят разведенную сыворотку, конъюгат и субстрат. Пол. результат: изменение окраски субстрата.

Непрямая РИФ: на предметное стекло наносят АГ – бледные трепонемы (штамм Никольса). Мазки высушивают на воздухе и фиксируют в ацетоне 5 минут. Сыворотку больного истощают взвесью непатогенных трепонем штамма Рейтера или разводят 1:200, затем наносят на приготовленные препараты. Выдерживают во влажной камере при 35С 30 мин (1 фаза). Мазки промывают 10 минут в ИХН и высушивают. Далее наносят на препарат каплю флюоресцирующей сыворотки против глобулина человека и инкубируют во влажно камере при комнатной температуре 30 мин (2 фаза). Мазки промывают ИХН, высушивают. Просматривают в люминесцентном микроскопе. Положительная реакция: зеленое свечение.

Реакция флоккуляции на стекле: плазму крови или непрогретую сыворотку смешивают с неспецифическим липидным антигеном в течение нескольких минут на предметном стекле. Положительный результат: под малым увеличением видны укрупненные частицы антигена (флоккулят).

Серодиагностика сифилиса с использованием РПГА.

Компоненты: ИХН, сыворотка больного, эритроцитарный диагностикум. Готовят разведения сыворотки, добавляют диагностикум, в термостат 24 ч 37С. Пол. результат: зонтик.

5. Серодиагностика сифилиса с использованием ИФА.

Компоненты: сыворотка больного, диагностикум, конъюгат, хромогенный субстрат. Связывают диагностикум с пластиком лунки планшета, вносят разведенную сыворотку, конъюгат и субстрат. Пол. результат: изменение окраски субстрата.

6. Серодиагностика сифилиса с использованием РСК.

Реакция Вассермана: можно использовать сыворотку крови больного и спинномозговую жидкость (на стадии нейросифилиса). В качестве диагностикума – трепонемный или кардиолипиновый антиген. Компоненты: 1 система – сыворотка больного, диагностикум, комплемент, ИХН; 2 система – гемолитическая сыворотка и взвесь эритроцитов барана. Готовят 1 систему, инкубируют 37С 1 ч. Добавляют вторую, инкубируют 37С 1 ч. Положительный результат – отсутствие гемолиза.

Методы микробиологической диагностики лептоспироза.

Бактериоскопический метод: готовят препарат раздавленной капли, изучают его в темнопольном микроскопе: подвижные тонкие нити с изгибами на концах (вторичные завитки) – в виде скобы или буквы S.

Бактериологический метод: материал – кровь, моча, спинномозговая жидкость. Материал засевают (3-5 пробирок) в водно-сывороточную среду, среду Флетчера, Картофа. Инкубируют до 30 суток при 28-30С в атмосфере СО₂. Для выявления роста лептоспир через 10 дней после посева из пробирки берут материал, готовят препарат раздавленной кали и изучают в темнопольном микроскопе. Из пробирки, где обнаружен рост лептоспир, пересевают в 3 пробирки со свежей питательной средой, инкубируют 7-10 дней, температура та же. Для дифференциации проводят бикарбонатный тест, определяют гемолитическую активность, фосфолипазную активность. Идентифицируют по антигенной структуре с помощью агглютинирующих сывороток.

Биологическое исследование: морским свинкам вводят внутрибрюшинно 1 г исследуемого материала и наблюдают в течение месяца, отмечая температуру и вес тела, появление желтухи и кровоизлияний, а также гибель животного.

Серологическое исследование: АТ в сыворотке появляются со 2 недели. Используют реакции микроагглютинации и лизиса лептоспир. Сыворотку больного разводят двукратно от 1:100 до 1:1600. В ряд пробирок вносят 0,2 мл разведенной сыворотки и такое же количество живой культуры штаммов лептоспир. Инкубируют 1 час при 37С. Из содержимого каждой пробирки готовят препарат раздавленной капли и микроскопируют. АТ в сыворотке первых разведений обусловливают лизис – растворение или зернистое набухание лептоспир. В последующих разведениях – агглютинация – агломераты в виде паучков. Диагностическое значение имеет положительная реакция в разведении 1:400 и выше.

Диагноз на лептоспироз ставят путем проведения микроскопических, бактериологических, серологических и гистологических исследований с учетом эпизоотологических, эпидемиологических, клинических и патологоанатомических данных.

Материалом для прижизненной диагностики является кровь и моча, для посмертной — трупы мелких животных, от крупных животных ветспециалист отбирает в ветлабораторию следующий патматериал: сердце, кусочки паренхиматозных органов , почку, транссудат грудной и брюшной полостей, перикардиальную жидкость, мочевой пузырь с содержимым. Абортированный плод доставляют в лабораторию целиком или берут желудок с содержимым и паренхиматозные органы. В летнее время патологический материал должен быть взят и исследован в течение 6 часов, зимой при условии хранения его в охлажденном состоянии — в течение 10-12 часов. При обнаружении больных или подозрительных по заболеванию животных берут не менее 50 проб крови от животных каждого скотного двора, свинарника, гурта; спустя 7-10 дней у тех же животных ветспециалист берет кровь повторно. В хозяйстве рекомендуется провести микроскопию мочи не менее чем от 100 животных.

Бактериологическая диагностика состоит в обнаружении в исследуемом материале или в органах лабораторных животных, зараженных этим материалом, лептоспир путем микроскопии, а также в выделении и идентификации чистых культур.

Серологическая диагностика основана на обнаружении специфических антител в крови животных реакцией микроагглютинации (РМА) или реакцией макроагглютинации.

Диагноз на лептоспироз считается установленным и хозяйство признается неблагополучным по лептоспирозу, если при лабораторном исследовании материала обнаруживаются лептоспиры: при микроскопии; при выделении культур; выявлении возбудителя в гистологических срезах почек или печени; установлении нарастания титра антител при повторном исследовании в 5 раз и более или при обнаружении антител у ранее не реагировавших животных, если специфические антитела обнаружены в сыворотке крови при однократном исследовании по РМА в титре 1:100 и выше более чем у 25% обследованных животных или по РА 1-4креста более чем у 20% животных.

Дифференциальный диагноз. При установлении причины падежа животного специалистам необходимо учитывать, что животные –лептоспироносители, а также животные, имеющие в крови антитела к лептоспирозу, могут погибать от других инфекционных и незаразных болезней. При заболевании крупного и мелкого рогатого скота необходимо исключить гемоспоридиозные заболевания, злокачественную катаральную горячку, бруцеллез, кампилобактериоз (вибриоз), трихомоноз, листериоз, сальмонеллез, вирусные пневмоэнтериты, кормовые отравления. У свиней необходима исключить бруцеллез, сальмонеллез, чуму, рожу, дизентерию, микотоксикозы. У лошадей — инфекционную анемию, инфекционный энцефаломиелит. У собак и пушных зверей — чуму, инфекционный гепатит, сальмонеллез и вирусный энтерит.

Лечение. Заболевших лептоспирозом животных изолируют и подвергают лечению. Лечение может быть специфическим и симптоматическим. Из специфических средств хороший лечебный эффект оказывает поливалентная гипериммунная противолептоспирозная сыворотка, особенно если ее применить в самом начале болезни. Сыворотку вводят подкожно в разовых дозах: крупному рогатому скоту 50-120 мл; телятам 20-40 мл; свиньям, овцам, лисицам 5-30 мл. При тяжелом течении болезни введение сыворотки через 1-2 дня повторяют. Внутривенно сыворотка вводится в половинных дозах. Эффективно также применение антибиотиков: стрептомицин (по 10-12 тыс. ЕД на 1кг массы животного 2 раза в день 4-5дней подряд), дитетрациклин (свиньям по 30 тыс.ЕД на 1кг массы животного 2-3 раза с интервалом 2-3дня). Для симптоматического лечения используют глюкозу. При лептоспирозе в организме животных наблюдается гипогликемия. Использование глюкозы компенсирует недостачу сахара, пополняет энергетические ресурсы организма, 40% раствор глюкозы вводят внутривенно : крупному рогатому скоту и лошадям 500 мл; молодняку 50-200 мл; лисицам, песцам и собакам 5-10мл. Для устранения атонии желудочно-кишечного тракта используют слабительные (внутрь — глауберовую соль 25-500г). Для дезинфекции мочевых путей внутрь применяют уротропин с водой: крупным животным 5-10г, телятам 1-2г. Для поддержания сердечной деятельности подкожно инъекция кофеина: крупным животным 2-3г; мелкому рогатому скоту и свиньям 0,5-2г. При поражении ротовой полости ее промывают растворами марганцовокислого калия (1:1000). Некротические очаги кожи смазывают ихтиоловой мазью, борным вазелином и т.д. Больным животным создают наилучшие условия кормления и содержания. В рацион вводят рыбий жир, рыбную муку, микроэлементы, витамины. Телят и поросят облучают кварцевой лампой.

Больных животных необходимо предохранять от действия солнечных лучей, необходимо их чаще поить.

Иммунитет и иммунизация. Чрезвычайно широкое распространение лептоспир в природе дают частые возможности контакта всех видов животных с этими микроорганизмами. В то же время при вспышках лептоспироза в сельскохозяйственных предприятиях большинство животных не заболевает. Чаще болеют молодые животные, а это говорит о том, что естественная иммунизация животных против лептоспироза (иммунизирующая субинфекция) является бесспорным фактором.

В создании невосприимчивости к лептоспирозу в организме животного большую роль играют гуморальные и клеточные факторы. При попадании лептоспир в организм их обнаруживают в макрофагах различных органов, купферовских клетках печени; доказано, что фагоцитарная активность клеток крови (нейтрофилов) через несколько дней после заражения увеличивается в 4-6раз. То есть можно сказать, что в начальном периоде после заражения защитные функции выполняют клеточные факторы иммунитета, которые приобретают специфичность под влиянием появляющихся несколько позднее антител, агглютининов, лизинов, комплемент связывающих антител, преципитинов. Преципитины делают фагоцитоз не только завершенным, но и разрушают паразитов (лизис). Конечно, эффективность механизмов иммунитета зависит от состояния нервной системы организма, и в первую очередь от ее чувствительности, способной своевременно пускать в ход защитные механизмы.

Изучая иммуногенез, ученые заметили, что переболевшие лептоспирозом животные приобретают иммунитет к повторному заражению гомологичным серотипом, а кровь реконвалисцентов обладает лечебными и профилактическими свойствами. Эти факторы были учтены учеными при изыскании вакцин и сыворотки против лептоспироза.

Первая вакцина против лептоспироза в СССР была предложена С.Я. Любашенко в 1940г., а начиная с 1946 по 1958г., лептоспирозную вакцину готовили из трех серотипов (гриппотифоза, помона, иктерогеморрагия). В дальнейшем в соавторстве с А.Г. Малявиным для приготовления вакцины стали использовать еще два серотипа (каникола и тарасови).

Сейчас для активной иммунизации животных используют поливалентную депонированную вакцину ВГНКИ, выпускаемую в двух вариантах (различное сочетание серогрупп лептоспир).

Противолептоспирозные вакцины применяют как для профилактики, так и при проведении вынужденной вакцинации животным в возрасте от 1месяца и старше в неблагополучных, откормочных и угрожаемых по лептоспирозу хозяйствах, при выпасе животных в зоне природного очага болезни, при выявлении в хозяйстве животных, сыворотка крови которых реагирует на лептоспироз по РМА или РА, и в районах с отгонным животноводством. Специалисты при проведении вакцинации должны учитывать то, что крупный рогатый скот, буйволов, коз, свиней и лошадей нельзя вакцинировать в последнею неделю беременности и в первую неделю после родов, а собак, лисиц и песцов — во вторую половину беременности. Иммунитет у привитых животных наступает через 14 дней и продолжается до года. Сыворотку крови от вакцинированных животных не исследуют на лептоспироз в течение 2-3 месяцев после вакцинации.

Для пассивной иммунизации применяют поливалентную сыворотку против лептоспироза сельскохозяйственных и промысловых животных. Владельцам животных необходимо помнить, что сыворотка, как и вакцина, не освобождает организм животных от лептоспироносительства; и не может профилактировать наступление абортов у зараженных животных.

Меры борьбы. Борьба с лептоспирозом проводится согласно ветеринарных правил ВП 13.3. 1310-96 утвержденных Начальником Департамента ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации — Главным государственным ветеринарным инспектором Российской Федерации В. М. Авиловым 18июня 1996г. и Санитарных правил СП 3.1. 091-96, утвержденных первым заместителем председателя Госкомсанэпиднадзора России — заместителя Главного государственного санитарного врача Российской Федерации. С.В. Семеновым 31 мая 1996г.

При установлении диагноза лептоспироз Постановлением Губернатора области выносится решение об объявлении хозяйства (отдельной его части), населенного пункта неблагополучным по лептоспирозу, вводятся ограничения и утверждается план оздоровления хозяйства.

В плане оздоровительных мероприятий предусматриваются необходимые диагностические исследования животных, ограничительные, ветеринарные, санитарные, организационно-хозяйственные мероприятия с указанием сроков проведения и ответственных лиц.

По условиям ограничений запрещается:

• выводить (ввозить) животных для целей воспроизводства, продавать животных населению;
• перегруппировывать животных без ведома ветеринарного специалиста, обслуживающего хозяйство;
• допускать животных к воде открытых водоемов и использовать ее для поения и купания животных;
• выпасать невакцинированных животных на пастбищах, где выпасались больные лептоспирозом животные, или на территории природного очага лептоспироза;
• скармливать невакцинированным животным корма, в которых обнаружены инфицированные лептоспирами грызуны.

Молоко, полученное от больных лептоспирозом животных, нагревают до кипения и используют в корм. Молоко клинически здоровых коров, сыворотка крови которых дает положительную РМА без нарастания титра, используют без ограничений.

В неблагополучном по лептоспирозу хозяйстве (ферме, отделении, стаде, свинарнике, и т.д.) проводят клинический осмотр и измерение температуры тела у подозрительных по заболеванию животных.

Больных и подозрительных по заболеванию животных изолируют, лечат гипериммунной сывороткой и антибиотиками в дозах, указанных в наставлениях по их применению.

Клинически здоровых животных всех видов и возрастных групп, восприимчивых к лептоспирозу, вакцинируют. Животных, подвергнутых лечению, вакцинируют через 5-7дней после выздоровления.

Всех животных откормочных хозяйств, неблагополучных по лептоспирозу, и малоценных животных в племенных и пользовательных хозяйствах откармливают и сдают на убой.

Маточное поголовье, производителей и ремонтный молодняк, которые необходимо сохранить для воспроизводства, после вакцинации обрабатывают лептоспироцидными препаратами и переводят в продезинфицированное помещение.

Эффективность обработки проверяют через 10-15дней путем микроскопии мочи.

Молодняк, полученный после проведения мероприятий, выращивают отдельно, вакцинируют в сроки, предусмотренные наставлением по применению вакцины против лептоспироза и, после снятия ограничений, реализуют на общих основаниях.

Вывод животных для откорма разрешается в пределах области (края, республики) через месяц после последнего случая выздоровления животного, проведения вакцинации и заключительных ветеринарно-санитарных мероприятий.

У производителей (быки, хряки, жеребцы, бараны) инфицированных лептоспирами ( положительная реакция РМА, лептоспиры в моче), прекращают получать сперму и, исходя из хозяйственной целесообразности, направляют их на убой или обрабатывают стрептомицином и проводят дезинфекцию помещения. Все поголовье вакцинируют против лептоспироза. Через 10-15 дней эффективность лечения контролируют путем микроскопии мочи. При обнаружении лептоспир в моче повторяют курс лечения и проверку его эффективности. От быков, признанных здоровыми, продолжают брать сперму. Сперму, полученную от быков — лептоспироносителей, уничтожают.

Повторное исследование сыворотки крови в РМА и микроскопию мочи всех производителей на ранее неблагополучном по лептоспирозу предприятии (станции) проводят через 3 месяца и при получении отрицательных результатов далее каждые 6месяцев.

Производителей на предприятиях (станциях, пунктах) искусственного осеменения, расположенных в неблагополучной или угрожаемой по лептоспирозу зоне, вакцинируют против лептоспироза.

Ограничения в неблагополучных по лептоспирозу хозяйствах снимают в следующем порядке:

• в откормочных хозяйствах-после сдачи поголовья на убой и проведения заключительных ветеринарно-санитарных мероприятий;
• в племенных и пользовательных хозяйствах — после установления их благополучия по лептоспирозу лабораторными методами исследований. Для этой цели через 1-2 месяца после проведения мероприятий исследуют в РМА не менее 50 проб сыворотки крови молодняка, предназначенного для продажи (не должно быть положительных реакций), и не менее 100 проб мочи от каждой 1000 взрослых животных или группы ремонта, среди которых не должно быть лептоспироносителей; РМА у взрослых животных может оставаться положительной;
• повторные исследования на лептоспироз в ранее неблагополучных хозяйствах проводят через 6 месяцев после снятия ограничений;
• хозяйство считается оздоровленным при получении отрицательных результатов исследований у всех обследованных животных.

В целях недопущения заболевания животных лептоспирозом собственники и владельцы скота, ветеринарные специалисты обязаны выполнять следующее:

• осуществлять контроль за клиническим состоянием животных, учитывать количество абортов и при подозрении на лептоспироз отбирать патматериал для лабораторных исследований;
• комплектование племенных хозяйств (ферм), предприятий, станций искусственного осеменения из благополучных по лептоспирозу хозяйств;
• исследовать всех поступающих в хозяйство животных в период 30-дневного карантина на лептоспироз в РМА в разведении 1:25;
• разрешается комплектовать откормочные хозяйства (отделения, фермы) клинически здоровыми животными без обследования на лептоспироз, но с обязательной вакцинацией их против лептоспироза в период карантинирования;
• не допускать контакта животных со скотом неблаголучных по лептоспирозу хозяйств (ферм), населенных пунктов на пастбищах, в местах водопоя и т.д.;
• не выпасать невакцинированных животных на территории природных очагов лептоспироза;
• не устраивать летних лагерей для животных на берегах открытых водоемов;
• систематически уничтожать грызунов в животноводческих помещениях, на территории ферм, местах хранения кормов и т.п.

Диагноз на лептоспироз устанавливают бактериологическим, серологическим и гистологическим методами исследования с учетом эпизоотологических, клинических и патологоанатомических данных и проведением дифференциальной диагностики.

Бактериологическая диагностика лептоспироза

Бактериологическая диагностика основана на обнаружении лептоспир в исследуемом материале путем микроскопии или выделения культуры и складывается из следующих этапов:

- взятие патологического материала;

- микроскопия в темном поле микроскопа;

- выделение культур лептоспир посевом в специальные среды или биологической пробой на лабораторных животных;

- идентификация и дифференциация выделенных культур.

1.1. Порядок взятия материала для лабораторного анализа

1.1.1. Материалом для прижизненной диагностики служат кровь и моча, для посмертной - трупы мелких животных. От трупов ирупных животных берут сердце, кусочки паренхиматозных органов, почку, транссудат из грудной и брюшной полостей, перикардиальную жидкость, мочевой пузырь с содержимым, спинномозговую жидкость.

Абортированный плод доставляют в лабораторию целиком или берут желудок с содержимым и паренхиматозные органы плода.

1.1.2. Мочу собирают при естественном мочеиспускании в чистые пробирки, закрепленные на проволоке, или в банки, чашки Петри, кружки и т.д. Легче всего брать пробы после утреннего подъема животных, а у свиней в любое время дня после 1-2-часового лежания. У коров и свиноматок мочу можно брать катетером.

1.1.3. Кровь в количестве 3-5 мл берут для бактериологического исследования в период лихорадки на 1-7-й день болезни, для серологического исследования - 5-10 мл и не ранее чем через 5-7 дней после проявления клинических признаков болезни или через 60 дней после введения вакцины.

1.1.4. Почку извлекают в невскрытой капсуле. Сердце, мочевой пузырь и желудок плода берут с содержимым, для чего накладывают лигатуры на соответствующие сосуды и сфинктеры. Каждый орган или кусочек органа завертывают отдельно в пергамент.

1.1.5. Ликвор, транссудат, спинномозговую жидкость и другие жидкие субстраты насасывают стерильным шприцем или пипеткой в стерильные пробирки.

1.1.6. Воду из водоисточника для обнаружения лептоспир берут в объеме 1,5-2 л в стерильные колбы с ватно-марлевыми пробками.

1.1.7. Взятый материал помещают в ящик, опечатывают и направляют в лабораторию с нарочным.

1.1.8. Патологический материал должен быть взят и исследован в течение 6 часов в летнее время и 10-12 часов - при условии хранения его в охлажденном состоянии.

1.1.9. Микроскопия мочи должна быть закончена при температуре 30-40 °С в течение 3 часов, 25-30 °С - 4- 5 часов, 20-25 °С - 6-8 часов, 16-20 °С - до 10-12 часов с момента взятия.

Вероятность обнаружения лептоспир в исследуемом материале в более поздние сроки не исключена, но значительно снижается.

1.1.10. Ветеринарный специалист, направляя материал в лабораторию для исследования на лептоспироз, должен рассчитывать, чтобы взятие материала, доставка в лабораторию и проведение исследования укладывались в сроки выживания лептоспир в патологическом материале, в противном случае ответ будет заведомо отрицательным.

В сопроводительной к патологическому материалу должно быть указано время гибели животного или время взятия пробы при жизни.

1.2. Микроскопическое исследование

1.2.1. Для микроскопического исследования на лептоспироз необходимы:

- биологический микроскоп (МБИ-3, МБИ-1, МБИ-11 и др.);

- конденсор темного поля (ОИ-7, ОЙ-13 и др.);

- осветитель (ОИ-19, ОИ-21 и др.) с точечной лампой;

- предметные стекла толщиной не более 0,8-1,1 мм;

- покровные стекла стандартные.

Стекла, используемые для микроскопии, должны быть бесцветными, прозрачными, чистыми, без царапин и бликов.

1.2.2. Порядок микроскопии в темном поле следующий. Осветитель соединяют с микроскопом соединительной планкой. Передвигая лампочку осветителя, фокусируют свет на центре плоского зеркала микроскопа. При этом четко должны быть видны завитки спирали. Верхнюю линзу конденсора устанавливают на уровне предметного столика. Центрируют конденсор с помощью регулировочных винтов по оптической оси микроскопа. На верхней линзе конденсора при правильной установке виден равномерно освещенный круг.

Препарат для микроскопических исследований готовят по принципу раздавленной капли. Небольшой объем исследуемого материала наносят пипеткой или бактериологической петлей на предметное стекло и накрывают покровным стеклом, избегая образования пузырьков воздуха. На одном предметном стекле готовят три раздавленные капли.

На верхнюю линзу конденсора наносят каплю дистиллированной воды и устанавливают препарат для микроскопии. Пространство между линзой конденсора и предметным стеклом должно быть заполнено тонким слоем воды, без пузырьков воздуха, что уменьшает рассеивание световых лучей. Фокус конденсора должен находиться в плоскости препарата. Конденсор при этом обычно вплотную прилегает к стеклу. Иногда в зависимости от толщины препарата его приходится опускать на 0,5-1 мм.

Микроскопируют исследуемый материал при увеличении 40X7-10 и 20X1,5X7, а для более детального рассмотрения препарата-при увеличении 40ХЮ-15 или 40X1,5X10.

1.3. Характеристика лептоспир

1.3.1. Лептоспиры при рассмотрении в темном поле микроскопа представляют собой спиралеподобные тонкие серебристые нити, - концы которых, оба или один, загнуты и булавовидно утолщены. Встречаются и бескрючковые формы лептоспир. Лептоспиры подвижны. В жидких средах обычными формами движения являются: вращательное, прямолинейное поступательное с одновременным вращением вокруг собственной оси и круговые. Одна и та же особь может совершать и вращательные и поступательные движения.

1.3.2. Морфология и характер движения настолько типичны, что позволяют безошибочно распознавать лептоспир в патологическом материале. Кроме того, лептоспиры при микроскопии в отличие от других микроорганизмов никогда не бывают блестящими.

1.3.3. Возможность безошибочной дифференциации лептоспир от микроорганизмов других видов по морфологическим признакам дает право при лептоспирозе устанавливать диагноз только на основании микроскопических исследований, без последующего выделения чистых культур и их идентификации.

1.4. Микроскопия мочи

1.4.1. Мочу микроскопируют в нативном виде или после центрифугирования. Прозрачную мочу, не содержащую кристаллов солей, хлопьев, спермиев и других посторонних частиц, центрифугируют при 10-15 тыс. об/мин в течение 30 минут, сливают надосадочную жидкость, осадок ресуспензируют в оставшейся капле мочи и микроскопируют.

Мочу, содержащую значительное количество посторонних частиц, очищают центрифугированием при 3 тыс. об/мин в течение 10 минут, затем сливают надосадочную жидкость и центрифугируют ее для осаждения лептоспир при 10-15 тыс. об/мин в течение 30 минут.

При массовом исследовании животных в хозяйстве готовят по одной, а при наличии немногих животных - не менее трех раздавленных капель из каждой пробы мочи. Просматривают 50 и более полей зрения в каждой капле.

1.4.2. Лептоспир с активной подвижностью обнаруживают примерно в 50% положительных проб, в остальных случаях они неподвижны и довольно часто имеют измененную морфологию. Количество их также бывает различным. В моче примерно у 30% животных - лептоспироносителей содержатся по 1-2, реже по 5-7 и очень редко по 10-15 лептоспир в каждом поле зрения, в 30 - 35% ' случаев удается обнаружить 1-2 лептоспиры в 5-'10 полях. В остальных случаях выявляют 1-2 лептоспиры в 20-50 и более полях зрения.

В кислой моче с рН 5,0-6,0 лептоспиры быстро утрачивают подвижность и погибают. Некоторые мертвые клетки сохраняют форму, типичную для лептоспир, но у них по длине тела бывает видна зернистость, довольно часто концевые крючки распрямлены.

1.5. Микроскопия крови

1.5.1. Кровь, взятую от больного или подозреваемого в заболевании животного, смешивают с двойным количеством 1,5%-ного раствора лимоннокислого натрия, центрифугируют при 2-3 тыс. об/мин в течение 5 минут или отстаивают в течение часа, микроскопируют прозрачный надосадочный слой жидкости. Целесообразно осаждение лептоспир из надосадочной жидкости проводить центрифугированием при 10-15 тыс. об/мин в течение 30 минут.

1.6. Микроскопия суспензии из ткани органов

1.6.1. При бессимптомном течении лептоспироза суспензию готовят из кусочков коркового слоя почки, а при остром течении - из почки и печени. У абортированного плода микроскопируют 'Суспензию из всех органов.

1.6.2. Кусочки исследуемого органа весом 2-3 г. растирают в ступке с 5-7 мл питательной среды, физиологического раствора или стерильной воды до получения гомогенной взвеси. Суспензию отстаивают в холодильнике 1-2 часа или центрифугируют при 3 тыс. об/мин в течение 10 минут и микроскопируют надосадочную жидкость.

1.6.3. Транссудат из грудной и брюшной полостей, околосердечную жидкость, содержимое желудка плода и другие жидкие субстраты микроскопируют по той же методике, что и мочу.

1.6.4. Из проб крови и суспензии каждого органа готовят не менее трех раздавленных капель и просматривают в каждой из них не менее 50 полей зрения

1.7. Дифференциальная диагностика

1.7.1. При микроскопической диагностике лептоспиры необходимо дифференцировать от нитей фибрина, обломков хвостовых частей спермиев, разрушенных эритроцитов, спиралло- и вибриоподобных микроорганизмов, интерспир у хряков и других микроорганизмов.

1.7.2. Спермии постоянно содержатся в моче быков и хряков и часто в большом количестве. Обломки их хвостовых частей не имеют концевых крючков, неподвижны и вследствие преломления света кажутся блестящими.

1.7.3. Нити фибрина постоянно обнаруживают в крови, транссудате и иногда в «моче. Они не преломляют свет, но не имеют концевых крючков и не обладают подвижностью.

1.7.5. Спирилла- и вибриоподобные микроорганизмы обнаруживают в 10-15% случаев в моче свиней и крупного рогатого скота и постоянно - в крови, спинномозговой жидкости, суспензии из органов, а также в тканях и жидкостях абортированных плодов. Эти микроорганизмы отличаются от лептоспир змееподобным движением и отсутствием концевых крючков.

1.7.6. Интерспиры обитают в препуциальном мешке свиней. В моче, взятой при естественном мочеиспускании, их обнаруживают повсеместно в 50-80% случаев. В моче, взятой из мочевого пузыря, они не содержатся. Интерспиры подвижны. Оба или один конец микробной клетки перемещается судорожными, маятникообразными с широкой амплитудой движениями. После нескольких колебательных движений клетка некоторое время остается неподвижной, а затем снова можно наблюдать несколько очередных движений. Подвижность сохраняется не более 1-2 часов с момента получения мочи. Неподвижная интерспира имеет, так же как и лептоспира, один или два крючка и не преломляет свет, но в отличие от лептоспир у шее видны первичные завитки и тело клетки запоминает нить, состоящую из бусинок. Концы крючков заострены.

1.7.7. Другие микроорганизмы дифференцируют от лептоспир по форме и характеру движения, и все они, кроме того, преломляют свет и кажутся блестящими.

1.8. Выделение культур лептоспир

1.8.1. Выделение лептоспир из крови при жизни возможно в первые 5-7 дней болезни в период лихорадки. Для этой цели кровь из яремной или ушной вены вносят через стерильную иглу по 3-5 капель в 5-7 пробирок с питательной средой или высевают из пробы крови, присланной в лабораторию (приложения 2 и 3).

1.8.2. От трупа при диагностическом убое высевают пастеровской пипеткой кровь из сердца, ткани печени и почки, а от абортированного плода, кроме того, и из содержимого желудка. При убое клинически здоровых животных высевы делают из почки и мочевого пузыря. Из каждого органа засевают 3-5 пробирок с питательной средой.

1.8.3. Для выделения культур из почки ее освобождают от капсулы, поверхность прижигают шпателем или горящим спиртовым тампоном, пипетку вводят параллельно поверхности в корковый слой. Высев делают у крупного рогатого скота из 2-3 долей почки, у свиней- из нескольких участков почки.

1.8.4. Высевы из других органов делают по общепринятой методике.

Мочу, ликвор, околосердечный, брюшной транссудат и другие жидкие биосубстраты засевают по 1-3 капли в 3-5 пробирок с питательной средой.

1.8.5. Посевы культивируют при температуре 28 - 30° в течение трех месяцев. Лептоспиры, размножаясь в питательной среде, не изменяют ее внешнего вида. Поэтому для выявления роста лептоспир через 3, 5, 7, 10 и далее каждые 5 дней культивирования из всех пробирок микроскопируют капли, которые наносят на предметное стекло бактериологической петлей. Большинство культур вырастает через 7-20 дней. Иногда лептоспиры обнаруживают в среде на 3-5-й день, через 1-2 месяца и очень редко через 2-3 месяца культивирования.

Содержимое Каждой пробирки, в которой обнаружены лептоспиры, пересевают в 3-5 пробирок со свежей питательной средой. Пробирки с обильным ростом посторонней микрофлоры уничтожают.

1.9. Порядок сохранения культур

1.9.1. Пересевы культур лептоспир производят пастеровскими пипетками. В пробирку с 5-10 мл питательной среды вносят 0,5-1,0 мл культуры. Максимальное накопление лептоспир наблюдается через 4-7 дней культивирования при температуре 28-30°.

1.9.2. Рост и чистоту культуры лептоспир в жидких питательных средах контролируют микроскопически в темном поле микроскопа и макроскопически - просмотром пробирок с культурами в луче света от осветителя. При этом после встряхивания в питательной среде четко просматриваются муаровые волны, образуемые выросшей культурой.

Культуру лептоспир пересевают через каждые 10-15 дней не менее чем в 3-4 пробирки.

1.9.3. Штаммы лептоопир, постоянно поддерживаемые б лаборатории, можно хранить в пробирках под вазелиновым маслом, в запаянных ампулах, в морозильной камере при -70-80 °С или при температуре жидкого азота (-190 °С). Лептоспиры консервируют любым из этих методов после выращивания в сывороточной среде до максимального накопления.

В пробирку на культуру наслаивают 1 - 1,5 мл стерильного вазелинового масла или культуру расфасовывают в стерильные 1-5 мл ампулы из нейтрального стекла и запаивают.

Хранят пробирки и ампулы в темном месте при комнатной температуре. В таких условиях лептоспиры можно хранить без пересевов в течение трех месяцев.

1.9.4. Для хранения в замороженном состоянии культуры расфасовывают в ампулы, запаивают, охлаждают до 0-4 °С и помещают в сосуды Дьюара, заполненные азотом, или морозильную камеру.

В жидком азоте лептоспиры можно хранить без пересевов в течение года, при этом они заметно не изменяют своих биологических свойств.

1.10. Очистка загрязненных культур лептоспир

1.10.1. Культуры лептоспир, загрязненные микрофлорой, очищают биологическим методом, фильтрацией через бактерийные фильтры или пересевом на плотные питательные среды.

1.10.2. Для очистки биологическим методом загрязненную культуру вводят внутрибрюшинно морским свинкам в дозе 1-2 мл, крольчонку - 1-2 мл, хомяку или мыши - 0,5 мл. Через 30-60 минут кровь из сердца зараженного животного высевают в пробирки с питательной средой.

1.10.3. Лептоспиры проходят через асбестовые фильтровальные пластины марки СФ и свечи Шимберляна Л-5. Для очистки методом фильтрации загрязненную культуру фильтруют через простерилизованный фильтр. Фильтрат рассеивают в 5-10 пробирок с питательной средой. В высевах из фильтрата получают чистую культуру лептоспир.

1.11. Постановка биологической пробы

1.11.1. Восприимчивы к лептоспирозу при экспериментальном заражении золотистые хомяки, крольчата, морские свинки, крапчатые суслики, щенки собак, котята, белые и серые мыши.

Для повседневной практической работы используют золотистых хомяков 20-30-дневного возраста и крольчат-сосунов в возрасте 10-20 дней.

Молодые свинки (3-5-недельного возраста) весом 150-200 г. наиболее чувствительны к L. icterohaemorrhagiae, в меньшей степени - к L. pomona и мало чувствительны к лептоспирам других серологических групп.

1.11.2. Лабораторных животных заражают для выделения культур лептоспир из патологического материала и объектов внешней среды, очистки культур лептоспир от посторонней микрофлоры, определения вирулентности выделенных культур и дифференциации от сапрофитов.

1.11.3. Для выделения культур лептоспир животных заражают кровью, мочой, суспензией из паренхиматозных органов животных (абортированного плода) или спермой.

Исследуемый материал вводят подкожно или внутрибрюшинно хомякам от 0,3-0,5 до 1 мл, крольчатам - 2-3 мл.

1.11.4. На каждую пробу исследуемого материала необходимо брать по два зверька: одного из них убивают на 4-5-й, другого, если он не погибает, на 14-16-й день после заражения. Кровь зверька, убитого на 14-16-й день после заражения, исследуют по реакции микроагглютинации, начиная с разведения 1:10 с лептоспира-ми 13 серологических групп. Положительная РМА свидетельствует о наличии лептоспйр в исследуемом материале.

1.11.5. Высевы от убитых и павших зверьков делают из сердца, печени и почки в 2-3 пробирки из каждого органа. Вторую почку, кусочки печени, транссудат из грудной и брюшной полостей, околосердечную жидкость и содержимое мочевого пузыря микроскопируют.

1.11.6. Культуры лептоспир чаще удается выделить из органов зверька в период проявления клинических признаков болезни, проявляющихся отказом от корма, вялостью, дрожью, взъерошенностью шерсти, конъюнктивитом, желтушностью видимых слизистых оболочек и т.д.

1.11.7. У крольчат и морских свинок проводят после заражения термометрию. У крольчат нормальной температурой считается 38,5-39,5 °С, у свинок - 38-39,5 °С. В период лихорадки кровь берут из уха или сердца шприцем для микроскопии и посева.

1.11.8. Патогенность и вирулентность выделенных культур лептоспир проверяют на золотистых хомяках или крольчатах. Патогенные лептоспиры способны размножаться в организме животного, вызывать клинические проявления болезни, характерные патологоанатомические изменения и гибель животного. Лептоспиры-сапрофиты такими свойствами не обладают. Заражение животных проводят внутрибрюшинно 5-7-дневной культурой, содержащей 70-100 лептоспир в поле зрения микроскопа. Культуры лептоспир, убивающие золотистых хомяков на 5-12-й день дозой менее 0,1 мл, считают высоковирулентными, 0,2-0,4 мл - средней вирулентности и 0,5-1 мл - слабовирулентными.

1.11.9. Определение серогрупповой принадлежности культур лептоспир проводят в соответствии с Наставлением по применению групповых агглютинирующих лептоспирозных сывороток, утвержденным Главным управлением ветеринарии МСХ СССР 31 мая 1974 г.

1.11.10. В качестве биологической модели для обнаружения лептоспир могут быть использованы взрослые кролики и морские свинки. Кровь животных исследуют по РМА на наличие специфических антител. Животных, в крови которых не обнаружены специфические антитела, заражают исследуемым материалом.

Кровь зараженных животных исследуют три раза через каждые семь дней по реакции микроагглютинации начиная с разведения 1: 10 с лептоспирами 13 серологических групп. Обнаружение в крови зараженных животных специфических антител свидетельствует о наличии лептоспир в исследуемом материале и позволяет ориентировочно судить о их серогрупповой принадлежности.