Элективная среда для культивирования возбудителя дифтерии

Дифтерия – это острое инфекционное заболевание, вызываемое дифтерийной палочкой Corynebacterium diphthеriae. Заболевание характеризуется воспалительным процессом слизистых оболочек(значительно реже кожи) с образованием фибринозных пленок и общей интоксикацией.

Чаще всего воспалительный процесс развивается в зеве, гортани, трахеи. Реже в других органах (встречается дифтерия половых органов, кожи). Возбудитель дифтерии был открыт в 1883 году Клебсом, а впервые выделил культуру этих бактерий в 1884 году3 Леффлер.

C.diptheriae полиморфны, могут иметь булавовидные утолщения на концах (corine – булава). Иногда у них могут появляться ветвистые формы. Но чаще всего дифтерийные коринебактерии имеют прямую форму размерами 0,3-0,8 х 3-8 мкм.

В микропрепаратах палочки располагаются под углом друг к другу. У C.diptheriae по полюсам клетки расположены по одному зерна валютина (зерна Бабеша-Эрнста), которые можно обнаружить при окрашивании препаратов по Нейссеру или по Леффлеру.

Возбудители дифтерии грамположительны. Неподвижны, жгутиков не имеют. Спор и капсул не образуют.

Коринебактерии продуцируют экзотоксин, обладающий гистотоксическим, дермонекротизирующим и гемолизирующим действием.

Бактерии хорошо развиваются при 370С на элективных питательных средах (при рН 7,2-7,4), содержащих кровь или сыворотку.

По степени вирулентности с учетом культуральных и биохимических свойств принято различать три типа дифтерийных бактерий: тип gravis (вызывает наиболее тяжелое заболевание), тип mitis (вызывает легкие формы заболевания) и тип intermedius (промежуточный).

C.diphtheriae имеют термолабильные типоспецифические белковые и группоспецифические термостабильные полисахаридные антигены.

Дифтерийные бактерии хорошо развиваются при 37 г8радусах на элективных питательных средах (при рН 7,2 – 7,4), содержащих кровь или сыворотку.

Для культивирования дифтерийных бактерий широко используются среда Ру (свернутая лошадиная сыворотка), среда Леффлера (свернутая бычья сыворотка с глюкозным бульоном) и сывороточный агар.

Дифтерийные бактерии на плотных питательных средах развиваются 18 – 20 часов, образуя колонии, не сливающиеся между собой.

Тип gravis по способу биологического окисления приближается к аэробам, а тип mitis – к факультативным анаэробам.

При культивировании на плотных питательных средах тип gravis образует колонии R- формы, тип mitis образует колонии S- формы.

На жидкой питательной среде бактерии дифтерии типа gravis образуют на поверхности пленку и зернистый осадок, бульон при этом остается прозрачным. Палочки типа mitis в этих же условиях образуют более нежную пленку и равномерное помутнение бульона. Коринебактерии intermedius на бульоне растут с образованием равномерного помутнения питательной среды и зернистого осадка на дне пробирки.

Ферментативные особенности дифтерийных палочек имеют большое значение при их дифференцировке.

Все три типа дифтерийных бактерий не ферментируют манит, сахарозу и мочевину.

Коринебактерии типа gravis ферментируют декстрин, крахмал и гликоген. На кровяном агаре с телуритом образуют относительно крупные матовые серо - черные колонии с волнистым краем и радиально исчерченной поверхностью. Дифтерийные палочки типа mitis на этой же среде образуют колонии круглые, выпуклые, блестящие черные и гладкой поверхностью и ровным краем, непостоянно ферментируют декстрин, крахмал и гликоген вообще не ферментируют.

Коринебактерии типа intermedius занимают промежуточное положение, На агаре с теллуритом они образуют мелкие черные блестящие колонии, ферментируют крахмал и гликоген.

По антигенной структуре различают 11 серологических вариантов бактерий дифтерии. У них есть вариантоспецифические термолабильные поверхностные белковые антигены и группоспецифические термостабильные соматические полисахаридные антигены.

Следует отметить, что экзотоксин, продуцируемый разными штаммами типов gravis и mitis по антигенной структуре не дифференцируются и поэтому нейтрализуются одной и той же дифтерийной антитоксической сывороткой. Дифтерийные бактерии сравнительно устойчивы к действию факторов окружающей среды.

Выделяясь во внешнюю среду со слизью из зева или с фибринозными пленками, бактерии дифтерии при комнатной температуре на свету могут до 3 недель сохранять жизнеспособность. В пленках от дифтерийных больных при комнатной температуре в темноте бактерии сохраняются несколько месяцев. Хорошо переносят высушивание. Не изменяют вирулентности под воздействием малых концентраций дезинфицирующих веществ.

В засохших пленках из зева больного сохраняются до 3 месяцев, на белье, обуви, верхней одежде больного – до 4 недель, в мокроте – до 3 месяцев. На посуде, книгах, игрушках, которыми пользовался больной – до 30 дней, на вилках и ложках – до 24 часов.

Дифтерийные бактерии устойчивы к низким температурам. Присутствие света, влаги, а также высокая температура обуславливают их быструю гибель. На рассеянном свету дифтерийные бактерии погибают в течение 4-8 часов, в чистой воде – через 8 часов, при 500С – через 10 минут.

Чувствительны к дезинфицирующим средствам. В 10% перекиси водорода микробы погибают через 3 минуты, в 1% растворе карболовой кислоты – через 10 минут, в 1% растворе сулемы, в 5% растворе хлорамина и в 50-ти градусном этиловом спирте – через 1 минуту.

Очень чувствителен к действию различных факторов дифтерийный экзотоксин. Он легко разрушается под влиянием света, кислорода воздуха, повышенной температуры. Более устойчив к действию ультразвука.

При добавлении к токсину 0,3-0,4% раствора формалина, с последующим содержанием при 38-400С в течение 3-4 недель происходит превращение его в анатоксин.

Источником инфекции являются больные дифтерией, реконвалесценты или носители (среди здоровых людей носители составляют до 5%).

Возбудитель в основном передается аэрогенным путем (воздушно-капельным или воздушно-пылевым). Передача возбудителя возможна и через различные предметы (игрушки, посуду, книги, полотенца, белье и пр.), а также через инфицированные коринебактериями пищевые продукты (молоко, холодные блюда и пр.).

Заболеваемость дифтерией и носительство дифтерийных микробов наблюдается повсеместно независимо от климато-географических условий. Сезонность при дифтерии выражена отчетливо. Максимум заболеваний приходится на холодную пору года, минимум – на теплую. Около 80% всех случаев заболеваемости приходится на детей. Наиболее уязвимы дети до 16 лет.

Наиболее частыми воротами дифтерийной инфекции служит слизистая оболочка зева и носа, хотя местом проникновения дифтерийных бактерий могут быть также слизистая оболочка гортани, трахеи, глаз, половых органов, места повреждения кожных покровов.

При инфицировании человека коринебактериями дифтерии, возбудитель размножается на месте внедрения. По месту локализации возбудителя различают дифтерию зева, носа, кожи, половых органов, глаз, ушей. Чаще всего (в 90% случаев) регистрируется дифтерия зева, в меньшем количестве случаев – дифтерия носа. Остальные варианты дифтерии встречаются редко.

По истечении инкубационного периода (2-7 дней), в результате размножения дифтерийных бактерий в тканях и действия токсина на слизистую оболочку, развивается патологический процесс на месте локализации клеток возбудителя. Вначале это проявляется в виде катарального, а затем через 1-3 дня в виде фибринозного дифтерического или крупозного воспаления. При развитии процесса на слизистых оболочках, покрытых многослойным плоским эпителием (полость зева, глотки), возникает воспаление, при котором фибринозная пленка плотно связана с подлежащей тканью.

Ведущую роль в развитии клинических проявлений играет гистотоксин, выделяемый размножающимися коринебактериями дифтерии.

Токсин оказывает не только местное действие. Токсином поражаются нервная и сердечнососудистая системы, надпочечники и почки.

По степени интоксикации организма различают легкие, субтоксические и токсические формы дифтерии. Особенно тяжело протекают токсическая и геморрагическая формы дифтерии зева.

Исход заболевания зависит от тяжести течения, сроков начала серотерапии, а также от развития тех или иных осложнений, связанных с поражением миокарда, нервной системы, почек и надпочечников.

Важную роль в борьбе с распространением инфекции играет выявление бактерионосителей.

Каждый больной дифтерией независимо от клинической формы подлежит госпитализации в инфекционное отделение. В очаге инфекции (в квартире), где находился больной до госпитализации, делают тщательную дезинфекцию помещения. Обстановки, предметов ухода за больным, посуды, белья и прочих предметов с которыми контактировал больной.

Необходимо помнить о том, что выделение вирулентных дифтерийных бактерий после клинического выздоровления больного во многих случаях может продолжаться до 14 дней.

Лица, находившиеся в контакте с больным, подлежат карантину, длящемуся до получения отрицательных результатов бактериологического исследования, прежде всего материала из зева и носа.

Специфическая профилактика осуществляется введением вакцины (дифтерийный анатоксин), обеспечивающей создание антитоксического иммунитета. Дифтерийный анатоксин может быть применен как моновакцина (адсорбированный дифтерийный анатоксин) или в сочетании со столбнячным анатоксином (адсорбированный дифтерийно – столбнячный анатоксин), а также со столбнячным анатоксином и коклюшной бактериальной вакциной (адсорбированная коклюшно – дифтерийно – столбнячная вакцина).

Лабораторная диагностика при подозрении на дифтерию проводится тремя методами: микроскопическим, иммунной флюоресценции и выделения и идентификации возбудителя.

Лабораторная диагностика особенно важна при стертых и атипичных формах дифтерии, что все чаще стали регистрироваться в последние годы.

Материалом для исследования в большинстве случаев служат выделения зева, носа, реже – вульвы, глаз, кожи.

Материал из зева следует брать до еды и до полоскания дезинфицирующими средствами. Материал, взятый стерильным тампоном и помещенный в стерильную пробирку, необходимо сразу же (но не позже как через 3- 4 часа) отправить в лабораторию.

Предварительно, ориентировочно ответ можно получить (через 30 – 60 минут), сделав мазок тампоном на предметном стекле. Мазок высушивают, фиксируют, окрашиваю по Грамму, Леффлеру и микроскопируют.

Однако, поскольку в последнее время нередко приходится встречаться с атипичными формами дифтерийных бактерий, лабораторную диагностику дифтерии нельзя ограничивать только классическим микроскопическим или флюоресцирующим методами.

Основным методом лабораторной диагностики при подозрении на дифтерию является выделение и идентификация возбудителя по культуральным, биохимическим и токсигенным свойствам.

Следует помнить, что к роду коринебактерий кроме C.diphtheriae, относятся и другие виды, в том числе псевдодифтерийная палочка Гофмана и дифтероиды, виды патогенные для животных.

Выделение чистой культуры проводится путем посева исследуемого материала на сывороточную, кровяную и теллуритовую среды. Для дифференцировки истинных дифтерийных бактерий от ложнодифтерийных и дифтероидов посев делается уколом на 0,5% сахарный агар столбиком и на агаровую среду с 0,2% добавкой масляно – кислого натрия.

В первом случае вырастут только истинные дифтерийные бактерии, во втором – только дифтероиды и ложнодифтерийные бактерии.

Истинные дифтерийные бактерии не расщепляют уреазу, но расщепляют цистин до сероводорода. Токсигенность дифтерийных бактерий можно определить in vitro диффузным методом.

Возбудитель дифтерии относится к роду Corynebacterium. Бактерии имеют булавовидные утолщения на концах. К этому роду относятся патогенные дл человека дифтерийные палочки и дифтероиды, обнаруженные на слизистых оболочках и кожных покровах.

Возбудитель дифтерии были обнаружены Т. Клебсом (1883) и выделены в чистом виде Ф. Леффлером (1884).

Морфология. Возбудители дифтерии слегка изогнутые, тонкие палочки, размером 3-6х0,3-0,5 мкм, на концах которых имеются утолщения. В этих утолщениях имеются зерна волютина. Бактерии дифтерии неподвижны, не имеют спор и капсул. Грамположительны. Они хорошо окрашиваются основными анилиновыми красителями, при этом волютиновые зерна окрашиваются интенсивнее. Для окраски обычно применяют щелочной метиленовый синий или кристаллический фиолетовый. Особенностью коринебактерий дифтерии является их полиморфность; в одной культуре встречаются различные по форме и размерам палочки: изогнутые, прямые, длинные, короткие. Толстые. Иногда коккобактерии. Характерно расположение бактерий в мазках – они обычно располагаются попарно под острым или тупым углом, в виде растопыренных пальцев и т.д. Расположение в мазках и наличие зерен волютина является дифференциально-диагностическим признаком при микроскопическом исследовании. Непатогенные представители рода коринебактерий – ложнодифтерийные палочки и дифтероиды чаще располагаются в виде частокола, зерна волютина у них могут отсутствовать либо быть на одном конце.

Культивирование. Коринебактерии дифтерии – факультативные анаэробы. Растут при температуре 35-37 о С, рН среды 7,4-7,8. Они не размножаются на обычных питательных средах. Культивируют их на средах, содержащих кровь или сыворотку.

В концеXIX века французский ученый Э. Ру для культивирования бактерий дифтерии предложил использовать свернутую бычью или лошадиную сыворотку, а Ф. Леффлер рекомендовал добавлять к ней бульон и 1% глюкозу. На этих средах астерактерии растут быстро, в течение 14-18 ч образуют несливающиеся выпуклые колонии кремового цвета. Однако отдифференцировать на этих средах дифтерийные палочки от ложнодифтерийных невозможно.

В настоящее время основными средами для выращивания являются среда Клауберга, хинозольная среда Бучина, среда Тинсдаля и др. на основании культуральных и ферментативных свойств бактерии дифтерии делятся на три биовара: гравис, митис, интермедиус. Биовар гравис обычно находится в R-форме. На среде Клаубергабактерии этого биовара растут в виде крупных колоний 2-3 мм, серовато-черного цвета, имеют изрезанные края, что придает им вид розетки. При прикосновении к колонии петлей она как бы рассыпается. На бульоне бактерии этого биовара образуют крошащуюся пленку и зернистый осадок.

Коринебактерии биовара Митис на среде Клауберга растут в виде небольших, гладких колоний черного цвета. На бульоне они дают равномерное помутнение.

Коринебактерии биовара интермедиус являются промежуточными. На среде Клауберга бактерии этого биовара чаще растут в виде блестящих, мелких, черных колоний.

Ферментативные свойства. Все три биовара дифтерийных бактерий обладают ферментом цистиназой, расщепляющим цистин с образованием сероводорода. Эти свойства используются для дифференциации возбудителей дифтерии от непатогенных представителей этого рода.

Возбудители всех трех биоваров расщепляют глюкозу, мальтозу до образования кислоты. Гравис расщепляю крахмал. Это свойство отличает его от двух других биоваров. Коринебактерии дифтерии образуют индол, не разлагают мочевину.

Коринебактерии дифтерии образуют нейроминидазу, гиалуронидазу и другие ферменты патогенности.

Антигенная структура. У бактерий дифтерии имеется поверхностный термолабильный белковый антиген и типоспецифический полисахаридный О-антиген. Кроме этого, среди коринебактерий различают 19 фаговаров, которые учитываются при идентификации культур. С помощью фаговаров выявляют источник заболевания.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Возбудители дифтерии сравнительно устойчивы. Температура 60 о С убивает их через 10-15 мин, 100 о С – через минуту.

В пленке они выдерживают нагревание до 90 о С. на свернутой сыворотке при комнатной температуре сохраняются до 2 мес, на детских игрушках – несколько суток. Низкие температуры бактерии переносят хорошо. К высушиванию возбудители дифтерии довольно устойчивы. Дезинфицирующие вещества убивают эти бактерии в течение нескольких минут.

Восприимчивость животных. В естественных условиях животные дифтерией не болеют. Из экспериментальных животных наиболее восприимчивы морские свинки и кролики. При внутрикожном или подкожном заражении у них развивается картина токсикоинфекции с образованием на месте введения воспаления, отека, некроза. В надпочечниках наблюдаются кровоизлияния.

Источники заболевания. Больные люди и бактерионосители.

Пути передачи. Воздушно-капельный путь, контактно-бытовой.

Дифтерия – инфекционная болезнь, вызываемая Corynebacterium diphtheriae, характеризующаяся фибринозным воспалением в зеве, гортани, трахее, реже в других органах и явлениями интоксикации. Возбудитель дифтерии был открыт в 1883.1884 гг. Т. Клебсом и Ф. Леффлером.

Дифтерия. Таксономия. Corynebacterium diphtheriae относится к отделу Firmicutes, роду Corynebacterium.

Дифтерия. Морфология и тинкториальные свойства. Возбудитель дифтерии характеризуется полиморфизмом – наряду с наиболее распространенными тонкими, слегка изогнутыми палочками длиной 1-5 мкм встречаются кокковидные и ветвящиеся формы. Располагаются бактерии нередко под углом друг к другу. Они не образуют спор, не имеют жгутиков, у многих штаммов выявляют микрокапсулу. Характерной особенностью С. diphtheriae является наличие на концах палочки зерен волютина, что обусловливает неравномерное окрашивание клеток анилиновыми красителями. Грамположителен.

Дифтерия. Культивирование. С. diphtheriae – факультативный анаэроб, оптимальная температура для роста 37ºС, рН среды – 7,6. Растет на специальных питательных средах (в частности, на элективной среде – свернутой сыворотке); на среде Клауберга, содержащей кровь и теллурит калия, образует колонии трех типов: крупные серые с неровными краями, радиальной исчерченностью, напоминающие маргаритки; мелкие черные, выпуклые с ровными краями; колонии, похожие на колонии обоих типов.В зависимости от культуральных и ферментативных свойств различают 3 биологических варианта С. diphtheriae: gravis, mitis и intermedius.

Ферментативная активность. Биохимическая активность возбудителя дифтерии достаточно высока. Наряду с другими ферментами он обладает цистиназой, которая отсутствует у других кори небактерий. Биовар gravis ферментирует крахмал и гликоген в отличие от биовара mitis.

Дифтерия. Антигенная структура. На основании строения О- и К-ан-тигенов различают 11 сероваров возбудителя дифтерии.

Дифтерия. Факторы патогенности. Основным фактором патогенности является экзотоксин, поражающий мышцу сердца, надпочечники, почки, нервные ганглии. Способность вырабатывать токсин связана с наличием в клетке профага, несущего ген tox+, ответственный за образование токсина V, M. раздел 3.7). Кроме того, С. diphtheriae продуцирует ферменты агрессии – гиалуронидазу, нейраминидазу, корд-фактор.

Резистентность. Дифтерийная палочка устойчива к высушиванию, действию низких температур. Может сохраняться на детских игрушках до 15 дней, в воде – 6-20 дней.

Дифтерия. Восприимчивость животных. Модели для культивирования С. di phtheriae нет, однако к токсину чувствительны морские свинки, кролики и другие животные.

Дифтерия. Условно-патогенные коринебактерии. К роду Corynebacterium, помимо возбудителя дифтерии, относятся другие виды, способные при определенных условиях вызывать гнойно-воспалительные заболевания – C.pseudodiphtheriticum (hofTmanii), С. xerosis и т. д. Эти бактерии обитают там же, где и возбудители дифтерии, – в зеве, на конъюнктиве, коже.

Дифтерия. Патогенез. Входные ворота инфекции – слизистые оболочки .

Дифтерия. Клиническая картина. Существуют разнообразные по локализации формы дифтерии: дифтерия зева, носа, гортани, глаз, наружных половых органов, кожи, ран и др. В 85-90 % случаев наблюдается дифтерия зева. Инкубационный период – от 2 до 10 дней. Заболевание начинается с повышения температуры тела, появления боли при глотании, пленки на миндалинах, увеличения лимфатических узлов. У взрослых дифтерия может протекать как лакунарная ангина. У детей раннего возраста нередко одновременно с зевом и носом в патологический процесс вовлекается гортань, и в результате отека гортани развивается дифтерийный круп, который может привести к асфиксии и смерти. Другие тяжелые осложнения, которые также могут явиться причиной смерти, – токсический миокардит, острая недостаточность гипофизарно-надпочеч-никовой системы, паралич дыхательных мышц.

Дифтерия. Иммунитет. После перенесенного заболевания вырабатывается стойкий иммунитет. Достаточно продолжительным является поствакцинальный иммунитет (до 3-5 лет). Выявляют наличие антитоксических антител с помощью РПГА.

Дифтерия. Микробиологическая диагностика. Для бактериологической диагностики дифтерии берут материал из зева и носа. Для постановки предварительного диагноза возможно применение бактериоскопического метода. Основной метод – бактериологический. В процессе идентификации выделенной чистой культуры С. diphtheriae дифференцируют от других коринебактерий. Внутривидовая идентификация заключается в определении биовара, что имеет только эпидемическое значение.

Дифтерия. Лечение. Основной метод лечения – немедленное введение антитоксической

противодифтерийной сыворотки. Проводят также антибиотикотерапию.

Дифтерия. Профилактика. Специфическая профилактика заключается во введении грудным детям, начиная с трехмесячного возраста (до этого времени у них сохраняется плацентарный иммунитет), дифтерийного анатоксина, входящего в состав препаратов АКДС (адсорбированной коклюшно-дифтерийно-столбнячной вакцины), АДС (адсорбированного дифтерийно-столбнячного анатоксина). Ревакцинацию производят с помощью АДС-анатоксина не только в детском возрасте, но и взрослым людям каждые 10 лет. При контакте с больным человеком людям, не имеющим напряженного антитоксического иммунитета, вводят дифтерийный анатоксин (АД). Помимо данных препаратов, выпускают АКДС-М, АДС-М, АД-М – анатоксины, содержащие малое количество антигена и используемые для иммунизации людей с предрасположенностью к аллергии, однако эти препараты являются менее иммуногенными.

Дифтерийная палочка – возбудители дифтерии.

Дифтерия – острое инфекционное заболевание, характеризующееся токсическим поражением сердечно-сосудистой и нервной систем, а также специфическим фибринозным (дифтеритическим) воспалением в месте входных ворот.

Возбудитель был открыт в 1883 г. Клебсом, в 1884 г. Ф. Леффлер выделил его в чистой культуре. В 1888 г. Ру и Йерсен получили дифтерийный токсин, а в 1895 г. Беринг и Ру независимо друг от друга получили противодифтерийную сыворотку. В 1923 г. Рамон разработали технологию получения дифтерийного анатоксина, а позднее получил противодифтерийную сыворотку. Н.Г. Габричевский применил противодифтерийную сыворотку с лечебной целью и организовал ее производство в России.

Таксономия.

Вид – С. diphtheriae

В род Corynebacterium входят около 60 видов. Согласно Международной классификации Берджи этот род разделен на 3 секции:

1) патогенные для человека и животных;

2) патогенные для растений;

Морфология.

Прямые или слегка изогнутые палочки размером 0,3 - 0,6 х 4 - 8 мкм, спор не образуют, имеют микрокапсулу, неподвижны.

Особенностями дифтерийной палочки является наличие булавовидных утолщениях на концах; палочки отличаются также полиморфизмом; характерно взаимного расположения бактерий в мазках – в виде цифр V,X, L (не полное расхождение при делении);

Грамположительные микроорганизмы. При окраске по методу Нейссера тело клетки окрашивается в синий цвет, а зерна волютина - в желтый. Метод Леффлера окрашивает цитоплазму в голубой цвет, а зерна волютина – в темно-синий.

Культуральные свойства.

Возбудители дифтерии - факультативные анаэробы, отимальная температура их культивирования 37 о С, рН 7,3-8,0. Требовательны к питательной среде, для роста необходимо наличие цистина, гистидина, фенилаланина, метионина и т.д. Факторами роста являются Са 2+ , Mg 2+ , Fe 2+ , Zn 2+ , Mn 2+ , Cu 2+ . Для культивирования применяют сывороточные (среда Леффлера), среды с добавлением крови, хинозальную среду Бучина. Дифференциально-диагностические среды: теллуритовая среда (Конради, Трох, 1913г.), глицериновокровяная среда с теллуритом (среда Клауберг ΙΙ), сывороточно-теллуритовый агар с цистином (Тиндаль), теллурит-шоколадный агар Маклеода.

На теллуритовых средах возбудитель образует серовато-черные колонии, что обусловлено восстановлением теллурита до металлического теллура, имеющего черный цвет и аккумулирующегося бактериями.

Биохимическая активность.

Дифтерийные палочки малоактивны, сбраживают с образованием кислоты глюкозу, мальтозу, галактозу, декстрин, не разлагают сахарозу, лактозу, маннит, восстанавливают нитраты в нитриты. Не гидролизуют мочевину (проба Закса отрицательная), не образуют индол. Разлагают цистеин (проба Пизу положительная).

По культуральным, биохимическим, патогенетическим и некоторым другим свойствам дифтерийные палочки разделяются на 3 биовара.

1) биовар митис, характеризуется свойствами:

• ферментирует глюкозу, крахмал, мальтозу, не сбраживает сахарозу, гликоген, декстрин;
• обладает цистиназной активностью;
• восстанавливает нитраты;
• уреазная проба отрицательная;
• на средах с теллуритом образует мелкие гладкие блестящие черные колонии с ровным краем;
• на жидкой среде дает равномерное помутнение и порошкообразный осадок;
• дает зоны гемолиза на кровяных средах;
• малотоксичен;
• возбудители вызывают легкую спорадическую заболеваемость.

2) биовар гравис, характеризуется свойствами:

• ферментирует глюкозу, крахмал,декстрин, мальтозу,
• обладает цистиназной активностью;
• восстанавливает нитраты;
• уреазная проба отрицательная;
• на средах с теллуритом формирует крупные, сухие, матовые, плоские, серо-черные колонии, приподнятые в центре, с радиальной исчерченностью и неровным краем (напоминают маргаритку);
• на жидкой среде образуется пленка, помутнение, крошковидный или крупнозернистый осадок;
• дает гемолиз на кровяных средах;

· обладает выраженными токсигенными свойствами;

· выделяется от больных с тяжелой формой дифтерии, вызывает групповые вспышки.

3) биовар интермедиус, характеризуется свойствами:

· на средах с теллуритом образует мелкие сухие матовые серо-черные колонии с прозрачной периферией и неровным краем;

· на жидкой среде дает помутнение с последующим просветлением и образованием мелкозернистого осадка;

· гемолиз на кровяных средах отсутствует.

Антигенная структура.

Дифтерийная палочка имеет 2 антигена

1. О – антиген (групповой), полисахарид клеточной стенки, термостабильный, дает перекрестные реакции с микобактериями и нокардиями;

2. К – антиген (типовой), капсульный, термолабильный, иммуногенный, видоспецифичный.

На практике серотипирование не применяется, однако выпускаются диагностические сыворотки для РА, РПГА.

Для идентификации используют фаготипирование (22 фага) и бактериоцинотипирование (25 бактериоцинов).

Факторы патогенности.

Токсины. Палочка выделяет токсин – дифтерийный экзотоксин. По силе он занимает 3-е место после ботулинического и столбнячного. Термолабильный, высокотоксичный, иммуногенный, протективный, обладает анестезирующим действием. Гистотоксин обладает дермонекротическими, гемолитическими свойствами. Синтезируется в виде неактивного предшественника - единой полипептидной цепи с молекулярной массой 61 кД. Активируется под действием собственной протеазы, которая разрезает полипептид на 2 связанные между собой дисульфидными связями пептида: А (21 кД) и В (39 кД). Пептид В выполняет акцепторную функцию – распознает рецептор, связывается с ним, формирует внутримембранный канал, через который проникает в клетку пептид А. Пептид А – это фермент, который обеспечивает перенос аденозиндифосфатрибозы из НАД на один из аминокислотных остатков (гистидина) белкового фактора элонгации EF-2. В результате модификации EF-2 утрачивает свою активность, что приводит к подавлению синтеза белка рибосомами на стадии транслокации. Токсин синтезируют только С. diphtheriae, лизогенные умеренным конвертирующим tox-профагом, интегрирующимся с помощью сайт-специфической рекомбинации. Оперон, кодирующий синтез токсина имеет промотор tox Р и 3 участка: tox S, tox А, tox В. Тox S – обеспечивает выход токсина через мембрану в периплазматическое пространство бактериальной клетки. Утрата клеткой профага или мутации в tox-опероне делают клетку малотоксичной.

Ферменты патогенности: гиалуронидаза, нейраминидаза, фибринолизин, каталаза – факторы инвазии, лейкоцидин – обеспечивает устойчивость к фагоцитозу;

Структурные и химические компоненты клетки – пили (способствуют адгезии на чувствительных клетках), микрокапсула (обеспечивает устойчивость к фагоцитозу), корд-фактор (6-6-дифосфоэфир трегалозы, коринемиколовая и коринемиколиновая кислоты, обладающие нарушает фосфорилирование в митохондриях), бактериоцины (корицины) кодирование синтеза которых передается плазмидами.

Резистентность.

При нагревании до 60 о С палочки погибают за 10 мин, при 100 о С наступает мгновенная гибель. 5% раствор карболовой кислоты обеспечивает инактивацию через – 1 мин. Под действием прямого солнечного света палочка выживает несколько часов, в высохших пленках и кале – 3-4 мес., на предметах обихода и одежде сохраняется до 15 дней, на мягких игрушках – 3 мес., в воде и молоке – до 20 дней, в пыли – до 5 мес. Дифтерийные палочки чувствительны к пенициллину, тетрациклину, эритромицину.

Эпидемиология.

Источник инфекции – больной человек, носитель или реконвалесцент.

Механизмы передачи инфекции:

– аэрогенный (пути - воздушно-капельный и воздушно-пылевой);

– контактный (путь - непрямой контактный).

Больной опасен (в смысле заражения) с последних дней инкубационного периода.

Входные ворота – слизистые оболочки носа, зева, гортани, трахеи, бронхов, конъюнктивы глаз, наружных половых органов; раневая поверхность, пупочная рана.

Инкубационный период – 2-14-20 дней.

Патогенез.

Возбудители адсорбируются на чувствительных клетках, колонизируют эпителий. Секретируют гистотоксин, который инициирует развитие местного фибринозного воспаления, некроз эпителия, паретическое расширение сосудов с нарушением их проницаемости, отек тканей и выход фибриногена из сосудов. Фибриноген под влиянием тканевого тромбопластина, некротизированных тканей и атмосферным кислородом свертывается. На поверхности образуется фибринозная пленка. На многослойном плоском эпителии - плотная, спаянная с прилежащими тканями; на однослойном – тонкая, легко снимается. Разрастание пленок в воздухоносных путях может привести к асфиксии (истинный круп). Процесс сопровождают регионарные лимфадениты. Системное действие токсина приводит к гемодинамическим нарушениям. Развивается токсический миокардит и ранний паралич сердца. Возможно поражение канальцевого аппарата почек, некроз коркового слоя. В нервной системе – цитолиз нервных клеток с развитием поздних параличей мягкого неба, диафрагмы, сердца, блуждающего нерва. Смерть при дифтерии может наступить от раннего или позднего паралича сердца и диафрагмы, а также в результате истинного крупа (закупорки дыхательных путей оторвавшимися пленками).

У детей грудного возраста чаще развивается дифтерия зева (насмокр, слабая выраженность общих проявлений). Необходимо осматривать пупочную ранку для исключения местного процесса.

Иммунитет.

После перенесенного заболевания развивается стойкий напряженный антитоксический и мало выраженный антимикробный иммунитет. Возможно развитие носительства (10%) и повторное заражение (6-8%). Уровень иммунитета можно установить в РПГА. Диагностические – титры - 1:200 и выше. С той же целью применяется реакция Шика – внутрикожное введение микродоз дифтерийного токсина (1/40 Dlm 0,2 мл) внутрикожно. Через 48 ч появляется покраснение и инфильтрат, что свидетельствует об отсутствии антитоксических антител; при их наличии реакция не возникает. Из-за опасности сенсибилизации организма эту пробу проводят редко.

Микробиологическая диагностика.

Исследуемый материал – слизь из зева, носа, пленки с миндалин, раневое отделяемое, кровь

1. Бактериоскопический метод – микроскопия мазков из исследуемого материала (окраска по Граму, Нейссеру, Леффлеру).

2. Бактериологический метод – выделение чистой культуры возбудителя и ее идентификация. Необходимо не только выделить из исследуемого материала дифтерийную палочку, но и определить ее токсигенность.

Определение токсигенности С. dphtheriae:

а) биологическая проба на животных – внутрикожное заражение морских свинок фильтратом культуры дифтерийных бактерий – вызывает некроз в месте введения. Минимальная смертельная доза (20-30 нг) убивает морскую свинку на 4-5 день;

б) заражение куриных эмбрионов (наблюдается гибель под действием токсина);

в) внесение в культуру клеток ( выявление ЦПД);

г) метод твердофазного ИФА с меченными пероксидазой антителами;

д) использование ДНК-зонда для обнаружения tox-оперона в геноме;

е) тест Илека и Оухтерлони (1948 г.) – основу составляет способность токсина и антитоксина диффундировать в агар и образовывать преципитаты (усы, стрелы) по ходу диффузии – метод двойной преципитации в геле, предварительный ответ может быть выдан через 48 часов, через 72 часа – заключение о наличии токсигенных коринебактерий, через 96 часов – окончательный ответ.

3. Серодиагностика – РПГА, ИФА, РИА, реакция ко-агглютинации, реакция Шика.

4. Экспресс – диагностика – РИФ, ИФА, РПГА, реакция ко-агглютинации.

5. Биохимический и молекулярно-биологический метод – ПЦР (обнаружение tox-гена).