Иммунохроматографический тест для выявления сибирской язвы

Диагностические препараты и тест-системы, используемые при проведении лабораторной диагностики сибирской язвы

Номер регистрационного удостоверения

Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие сибиреязвенные неадсорбированные сухие, лиофилизат (для диагностических целей)

РП N 247-97 ФС 42-3640-98 (до 2003 г.)

ФГБУ "НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи"

123098, г. Москва,

Тел.: (499)193-30-50; 190-44-59

Альбумин бычий или бараний меченный родамином сухой

Набор реагентов для иммунохроматографического экспресс- выявления и идентификации спор возбудителя сибирской язвы (ИХ-тест В. anthracis)

142279, Московская область, Серпуховский район, п. Оболенск

Тел./факс: (4967) 36-00-20

Диагностический фаг-тест-набор для идентификации сибиреязвенного возбудителя (Фаг-тест-набор "Оболенск RI")

142279, Московская область, Серпуховский район, п. Оболенск

Тел./факс: (4967) 36-00-20

Тест-система для выявления ДНК В. antracis рХ01 + методом ПЦР (Ген-Сиб)

ФСР 2007/00101 от 25.05.2007

410005, г. Саратов, ул. Университетская, д. 46

Набор реагентов для выявления ДНК Bacillus anthracis в биологическом материале и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме "реального времени" "Ампли-Сенс Bacillus anthracis-FRT"

ФСР 2008/02417 от 09.04.2008

ФБУН ЦНИИ эпидемиологии, ООО "Интерлабсервис" 119021, г. Москва, Олсуфьевский переулок, д. 8, стр. 1

ФКУЗ РосНИПЧИ "Микроб"

410005, г. Саратов, ул. Университетская, д. 46

Незарегистрированные и разрабатываемые препараты (используются лабораториями территориального и регионального уровней только после регистрации)

Набор реагентов для иммунохроматографического экспресс-выявления и идентификации вегетативных клеток возбудителя сибирской язвы (ИХ тест-полоска В. anthracis)

Экспериментально-производственные серии, будут сертифицированы в ближайшее время

142279, Московская область, Серпуховский район, п. Оболенск

Тел.: (4967) 36-00-09

Тел./факс: (4967) 36-00-20

Иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные соматические адсорбированные флюоресцирующие сухие

Экспериментально-производственные серии, будут сертифицированы в ближайшее время

355035, г. Ставрополь, ул. Советская, 13-15

Тел./факс: (8652) 26-40-39

Иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные споровые адсорбированные флюоресцирующие сухие

Экспериментально-производственные серии, будут сертифицированы

355035, г. Ставрополь, ул. Советская, 13-15

Тел./факс: (8652) 26-40-39

Бактериофаг Fah-ВНИИВВиМ сибиреязвенный диагностический

ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии 601120, г. Покров Петушинского района Владимирской области

Тел.: (49243) 6-21-25; 6-10-82

Факс: (49243) 6-21-25; 6-13-85; 6-10-56

E-mail: VNIIVViM@ niiv.petush.elcom.ru

Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий

355035, г. Ставрополь, ул. Советская, 13-15

Тел./факс: (8652) 26-40-39

Диагностикум эритроцитарный сибиреязвенный антигенный сухой

ФКУЗ Волгоградский НИПЧИ,

400131, г. Волгоград, ул. Голубинская, 7

Диагностикум эритроцитарный сибиреязвенный имммуноглобулиновый сухой

ФГУ "48 ЦНИИ МО РФ"

610000, г. Киров, Октябрьский пр., 119

Сыворотка преципитирующая сибиреязвенная

302501, Орловская область, Орловский район, п. Биофабрика, ФГУП "Орловская биофабрика"

> Антибактериальные препараты, используемые при проведении лабораторной диагностики сибирской язвы для приготовления селективных.

Содержание Методические указания МУК 4.2.2941-11 "Порядок организации и проведения лабораторной диагностики сибирской язвы для лабораторий.

Откройте актуальную версию документа прямо сейчас или получите полный доступ к системе ГАРАНТ на 3 дня бесплатно!

Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.

Полный текст:

1. Абрамов ДД, Воробьев АА, Кузнецовский АВ, Савиных АВ, Онучина НВ, Дармов ИВ, Трофимов ДЮ, Кузнецов СЛ. Разработка и испытания молекулярно-биологической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы методом полимеразной цепной реакции в реальном времени. Клиническая лабораторная диагностика 2011; (3): 46-50.

2. Антюганов СН, Рязанова АГ, Еременко ЕИ, Куличенко АН. Сибирская язва в Российской Федерации и за рубежом. Эпидемиология и инфекционные болезни 2012; (5): 4-8.

3. Буравцева НП, Мицаев ШШ, Мезенцев ВМ, Рязанова АГ, Еременко ЕИ, Куличенко АН. Эпизоотологическая и эпидемиологическая обстановка по сибирской язве в Чеченской Республике и Республике Дагестан. Эпидемиология и инфекционные болезни 2011; (3): 10-5.

4. Artenstein AW. Anthrax: from antiquity to answers. J Infect Dis. 2007; 195(4): 471-3.

5. Саяпина ЛВ, Абдрашитова АС, Комратов АВ, Ращепкин ЛИ, Осин АВ, Храмов МВ и др. Характеристика новых препаратов для диагностики сибирской язвы по данным медицинских испытаний. Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. 23-24 мая 2012. Ставрополь: Экспо-Медиа; 2012.

6. Шарова ИН, Казакова ЕС, Карнаухов ИГ, Щербаков ДА, Щербакова СА, Самойлова ЛВ и др. Принципы организации и проведение лабораторной диагностики в мобильной лаборатории индикации для осуществления эпизотоологического мониторинга особо опасных и других природно-очаговых инфекций. Проблемы особо опасных инфекций 2012; (3): 94-6.

7. Egren J, Hamidjaja Raditijo A, Hansen T, Ruuls R, Thierry S, et al. In silico and in vitro evaluation of PCR-based assays for the detection of Bacillus anthracis chromosomal signature sequences. J Virulence 2013; 4(8): 671-85.

9. Kaman WE, Hulst AG., Roffel S, van der Schans M, Merkel T, van Belkum A, Bikker FJ. Peptide-based fluorescence resonance energy transfer protease substrates for the detection and diagnosis of Bacillus species. Anal Chem. 2011; 83(7): 2511-7.

10. Куличенко АН, Еременко ЕИ, Буравцева НП, Рязанова АГ. Диагностика сибирской язвы в Российской Федерации. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2010; (5): 62-6.

11. Саяпина ЛВ, Малахаева АН, Касина ИВ, Барулина ИС. Анализ качества диагностических флуоресцирующих иммуноглобулинов, используемых для выявления возбудителей особо опасных инфекций. Биопрепараты 2007; (2): 26-8.

12. Лобач РН, Абдрашитова АС, Саяпина ЛВ. Испытания сибиреязвенных флуоресцирующих иммуноглобулинов, предназначенных для выявления возбудителя сибирской язвы. Биопрепараты 2013; (4): 29-33.

13. Баркова ИА, Алексеев ВВ, Липницкий АВ, Барков АМ. Использование иммуноглобулинов сибиреязвенной монорецепторной сыворотки для идентификации Bacillus anthracis в МФА. В кн.: Материалы IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ. 30 сентября - 2 октября 2008. Волгоград: ВолгГМУ; 2008.

14. Маринин ЛИ, Дятлов ИА, Мокриевич АН, Бахтеева ИВ, Белова ЕВ, Борзилов АИ и др. Методы изучения биологических свойств возбудителя сибирской язвы. М.: Гигиена; 2009.

15. Барков АМ, Баркова ИА, Алексеев ВВ, Липницкий АВ, Кулаков МЯ. Обнаружение антител к протективному антигену Bacillus anthracis с использованием реакции непрямой гемагглютинации и твердофазного иммуноферментного метода. Проблемы особо опасных инфекций 2010; 105: 42-5.

16. Цncь Serkan, Цncь Selcen, Serhan Sakarya. Anthrax - an overview. Med Sci Monit. 2003; 9(11): 276-83.

17. Терешкина НЕ, Девдариани ЗЛ. Современное состояние проблемы иммунодетекции возбудителя сибирской язвы. Проблемы особо опасных инфекций 2008; (1): 44-8.

18. Шишкова НА, Кравченко ТБ, Маринин ЛИ, Мокриевич АН. Идентификация возбудителя сибирской язвы, выделенного из почвы скотомогильника. Проблемы особо опасных инфекций 2011; (4): 53-6.

19. Хлынцева АЕ, Лунева НМ, Белова ЕВ, Дятлов ИА, Шемякин ИГ. Разработка и испытания диагностикума на основе моноклональных антител для определения спор возбудителя сибирской язвы в реакции латекс-агглютинации. Проблемы особо опасных инфекций 2011; (4): 71-5.

20. Кравец ЕВ, Дугаржапова ЗФ, Родзиковский АВ, Хлынцева АЕ, Лунева НМ, Белова ЕВ и др. Применение методов латекс агглютинации и иммунохроматографии для ускоренной идентификации культур Bacillus anthracis при эпидемиологических расследованиях вспышек. Проблемы особо опасных инфекций 2011; (1): 81-2.

21. Хлынцева АЕ, Баранов АМ, Белова ЕВ, Шемякин ИГ, Маринин ЛИ, Дятлов ИА. Изучение свойств моноклональных антител для разработки иммунохроматографического стрип-теста с целью определения спор возбудителя сибирской язвы. В кн.: Материалы IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ. 30 сентября - 2 октября 2008. Волгоград: ВолгГМУ; 2008.

22. Соловьев ПВ, Баранова ЕВ, Рудницкий СЮ, Королева-Ушакова АГ, Колосова НВ, Бикетов СФ. Разработка иммунохроматографических тестов для идентификации спор и вегетативных клеток B. anthracis. Материалы научно-практической школы-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора. 25-27 мая 2010 г. Оболенск: А-ПРИНТ; 2010.

23. Ярков СП, Шиленко ИВ, Скопинская СН, Злобин ВН. Комплект для выявления возбудителей особо опасных заболеваний и токсинов люминесцентным иммунохроматографическим анализом. Проблемы особо опасных инфекций 2008; (2): 46-9.

24. Горобец ЕА. Разработка иммунобиологических препаратов для диагностики сибирской язвы: автореф. дис. … канд. биол. наук. Ставрополь; 2009.

25. Дугаржапова ЗФ, Родзиковский АВ, Чеснокова МВ, Балахонов СВ, Болошинов АБ, Ханхареев СС. и др. Эпизоотолого-эпидемиологический анализ ситуации по сибирской язве в Республике Бурятия (1995-2008). Эпидемиология и инфекционные болезни 2010; (6): 11-5.

26. Гаранина СБ, Тучков ИВ, Куличенко АН, Куклев ЕВ, Пикалов ИН. Использование ПЦР-анализа при работе в очаге сибирской язвы. В кн.: Сборник тезисов докладов 3-й Всероссийской научно-практической конференции 25-27 января 2000 г. Москва. М.; 2000.

27. Еременко ЕИ, Рязанова АГ, Цыганкова ЕА, Цыганкова ОИ, Куличенко АН. Генотипические особенности штаммов Bacillus anthracis c разным проявлением признаков, ассоциированных с патогенностью. Проблемы особо опасных инфекций 2010; (2): 53-6.

28. Чеканова ТА, Кирдяшкина НП, Пудова ЕА, Сажин АИ, Судьина АЕ, Маркелов МЛ, Шипулин ГА. Наборы реагентов для идентификации возбудителей особо опасных инфекций в формате иммуночипов и ДНК-чипов. Материалы V Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. Москва; 2013. С. 441-2.

29. Яцышина СБ, Обухов ИЛ, Кириллов ЛВ, Саленко ЛС, Шмаргун БИ, Шипулин ГА. Применение мультиплексной ПЦР для идентификации вирулентных форм возбудителей сибирской язвы. Материалы IV Всероссийской научно-практической конференции. Тверь; 2002.

32. Кутырев ВВ, Смирнова НИ. Генодиагностика и молекулярное типирование возбудителей чумы, холеры и сибирской язвы. Молекулярная генетика, микробиология, вирусология 2003; (1): 6-14.

33. Цыганкова ЕА, Еременко ЕИ, Цыганкова ОИ, Рязанова АГ. Полиморфизм гена протективного антигена у вариантов штаммов Bacillus anthracis, обнаруживаемый методом PCR RFLP анализа. В кн.: Материалы IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ. 30 сентября - 2 октября 2008. Волгоград: ВолгГМУ; 2008.

34. Harrell LJ, Andersen GL, Wilson KH. Genetic variability of Bacillus anthracis and related species. J Clin Microbiol. 1995; 33(7): 1847-50.

35. Лиманская ОЮ, Муртазаева ЛА, Klee S, Лиманский АП. Молекулярные технологии детекции возбудителя сибирской язвы посредством ПЦР различных форматов. Биотехнология 2013; (3): 86-96.

36. Ezzell JW, Abshire T, Ibrahim S, Teska J, et al. Identification of Bacillus anthracis: an overview. 3rd International Conference on Anthrax. Plymouth, England, 7-10 Sept., 1998.

37. Шишкова НА, Мокриевич АН, Платонов МЕ, Светоч ТЭ, Маринин ЛИ. Изучение генетического разнообразия штаммов сибиреязвенного микроба из коллекции ГНЦ ПМБ. Проблемы особо опасных инфекций 2010; (2): 60-5.

38. Рязанова АГ, Еременко ЕИ, Цыганкова ОИ, Цыганкова ЕА, Куличенко АН. Использование методов молекулярного типирования Bacillus anthracis в Референс-центре по мониторингу за возбудителем сибирской язвы. Проблемы особо опасных инфекций 2011; (4): 68-70.

39. Амосов МЮ, Кузнецовский АВ, Сероглазов ВВ, Савиных АВ, Онучина НВ, Воробьев АА, и др. Идентификация и дифференциация микробных культур возбудителя сибирской язвы, выделенных на территории Южного федерального округа в мае 2007 г. Молекулярная медицина 2011; (6): 43-8.

40. Beyer W, Turnbull PCB. Anthrax in animals. Molecular Aspects of Medicine 2009; 30(6): 481-9.

41. Keim P, Price LB, Klevytska AM, Smith KL, Schupp JM, Okinaka R, et al. Multiple-locus variable-namber tandem repeat analysis reveals genetic relationships within Bacillus anthracis. J Bacteriol. 2000; 182(10): 2928-36.

42. Рязанова АГ, Еременко ЕИ, Цыганкова ОИ, Цыганкова ЕА. Усовершенствование методов идентификации атипичных штаммов возбудителя сибирской язвы и их дифференциация от близкородственных бацилл. Журнал микробиология, эпидемиология и иммунобиология 2009; (3): 76-80.

43. Ригвава С, Натидзе М, Бубашвили М, Гогиашвили Д, Вардзелашвили Н. Идентификация штаммов B. anthracis, выделенных из различных объектов, и серодиагностика сибирской язвы. Аллергология и иммунология 2010; 2(11): 123-5.

44. Головинская ТМ, Буравцева НП, Цыганкова ОИ, Еременко ЕИ. Сравнительное изучение литической активности и специфичности экспериментальных серий сибиреязвенных бактериофагов Гамма А-26, К ВИЭВ, ВА-9 и Fah-ВН ИИВВиМ. Проблемы особо опасных инфекций 2011; (3): 28-30.

45. Желудкова ЕВ, Климов ВИ, Бывалов АА, Зиганшин РШ, Ковтун ВП. Совершенствование системы контроля качества питательных сред, используемых в микробиологии. В кн.: Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария. Матер. юбилейной науч. конф., посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ. 1998. С. 298-299.

46. Говорунова ВА, Маринин ЛИ, Миронова РИ, Храмов МВ, Мокриевич АН, Баранов АМ. Диагностическая питательная среда для выделения и идентификации возбудителя сибирской язвы. Проблемы особо опасных инфекций 2012; (2): 82-4.

Саяпина Л.В., Лобач Р.Н., Бондарев В.П., Никитюк Н.Ф. Современное состояние лабораторной диагностики сибирской язвы: обнаружение и идентификация Bacillus anthracis. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2016;16(1):27-34.

Sayapina L.V., Lobach R.N., Bondarev V.P., Nikityuk N.F. Current status of the laboratory diagnosis of anthrax: detection and identification of Bacillus anthracis. BIOpreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2016;16(1):27-34. (In Russ.)

Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.

На правах рукописи

Хлынцева Анна Евгеньевна

РАЗРАБОТКА КОМПЛЕКСА ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ

03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

доктор биологических наук, профессор Шемякин Игорь Георгиевич;

кандидат биологических наук Козырь Арина Владимировна

Афанасьев Станислав Степанович, заслуженный деятель науки, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им Г. Н. Габричевского" Роспотребнадзора, заместитель директора по биотехнологии

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова))

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Разработка современных диагностических систем для детекции возбудителя сибирской язвы представляет собой одну из наиболее актуальных задач борьбы с сибиреязвенной инфекцией. Сибирская язва является острым инфекционным заболеванием людей и животных, вызываемым аэробным спорообразующим грамположительным микроорганизмом Bacillus anthracis.

По классификации ВОЗ Россия относится к зоне спорадического проявления инфекции. Однако, в последние годы в стране отмечается неуклонный рост территорий, неблагополучных по сибирской язве, таким образом, службы надзора Российской Федерации оценивают санитарно-эпидемиологическую обстановку по этому заболеванию как напряженную [Лукьянова и др., 2011].

Возбудитель - В. anthracis представляет собой грамположительную палочку длиной 6-10 мкм и шириной 1-2 мкм. Она неподвижная, образует споры и капсулу. Хорошо растет на различных питательных средах. Споры сибирской язвы весьма устойчивы во внешней среде, они могут сохраняться в почве несколько десятков, а, возможно, и сотни лет, формируя устойчивые природные очаги инфекции.

Источником В. anthracis считают больных домашних и диких животных, организм которых предоставляет естественные условия для развития и размножения этого патогена [Ипатенко и др., 1987]. При этом источником могут быть и животные-бациллоносители, с атипичным или бессимптомным течением заболевания [Онищенко и др., 1999]. Заражение может наступать при уходе за больными животными, убое скота, обработке мяса, а также при контакте с продуктами животноводства (шкуры, кожи, меховые изделия, шерсть, щетина), обсемененными спорами сибиреязвенного микроба. Основным резервуаром В. anthracis считается почва [Ипатенко и др., 1987]. К тому же, почва может быть и непосредственным источником инфекции сибирской язвы - известны случаи заболевания людей и животных, возникшие в результате контакта с заражённой почвой [Маринин и др. 2008].

Важнейшую роль играет ранняя диагностика инфекции и необходимость детекции низких концентраций возбудителя сибирской язвы в окружающей среде и продуктах питания. К настоящему времени в нашей стране и за рубежом разработан целый ряд экспериментальных иммунодиагностических тест-систем, предназначенных для выявления возбудителя сибирской язвы и его антигенов [Терешкина и Девдариани, 2008]. Однако экспериментальные разработки зачастую не завершаются внедрением результатов в практику на уровне сертифицированных

препаратов, как правило, из-за несоответствия принятым параметрам специфичности (неспецифическое взаимодействие с близкородственными видами, такими как Bacillus cereus и др.).

Таким образом, для разработки эффективных средств иммунодиагностики сибирской язвы необходимы дополнительные фундаментальные и прикладные исследования. Помимо создания собственно диагностических систем, существенную роль в разработке новых диагностических средств играет идентификация антигенов или их фрагментов, специфичных исключительно для В. anthracis. В качестве основы для быстрой разработки различных типов современных диагностикумов наиболее перспективными и универсальными являются панели моноклональных антител (МКА), на основе которых можно создавать широкий спектр диагностических средств, учитывающих как особенности патогенеза сибирской язвы, так и современные форматы высокочувствительных систем детекции микроорганизмов и их факторов вирулентности.

Цель исследования - создание комплекса высокоэффективных и чувствительных иммунодиагностических тест-систем для определения возбудителя сибирской язвы, основанных на специфичных МКА, анализ их эффективности и идентификация антигенной мишени МКА.

1. Получить и охарактеризовать панель моноклональных мышиных антител к В. anthracis. Провести изучение полученных МКА на наличие внутри- и межвидовой перекрестной активности при помощи коллекции патогенных и сапрофитных бацилл.

2. Разработать на основе полученных МКА диагностические тест-системы в формате ИФА и латекс-агглютинации.

3. Сконструировать систему для селективного концентрирования возбудителя сибирской язвы на основе магнитных частиц с иммобилизованными МКА.

4. Идентифицировать антигенную мишень полученных МКА, использованных при разработке диагностических тест-систем.

1. Получена и охарактеризована панель МКА к спорам В. anthracis. Определены изотипы антител, константы аффинности, подобраны диагностически значимые пары антител, не конкурирующих за связывание антигена. Показана специфичность взаимодействия антител с возбудителем сибирской язвы и отсутствие перекрестных реакций с близкородственными микроорганизмами.

2. Идентифицирована антигенная мишень МКА, использованных при разработке тест-систем, представляющая собой белок ЕА1, поверхностный антиген В. anthracis. Показано взаимодействие МКА, примененных при разработке тест-систем, с рекомбинантным белком ЕА1, полученным в гетерологичной системе экспрессии в Е. coli.

Практическая ценность диссертации:

1. С применением МКА разработаны диагностические тест-системы на основе ИФА, латексных частиц и магноиммуносорбентов, проведено определение чувствительности и специфичности разработанных тест-систем. Тест-системы успешно прошли комиссионные испытания.

3. Тест-система на основе магноиммуносорбентов способна специфически детектировать споры штаммов сибирской язвы в концентрациях -1х103 спор/мл. Данная система позволяет проводить селективное концентрирование спор возбудителя сибирской язвы из проб окружающей среды и рекомендована к внедрению в практику работы учреждений Санэпиднадзора.

Положения, выносимые на защиту:

1. Полученная панель из шести МКА, являющихся специфичными к белку ЕА1 S-слоя возбудителя сибирской язвы и не дающих перекрестных реакций с близкородственными микроорганизмами, может быть использована для создания иммунодиагностикумов для определения В. anthracis.

3. «Набор реагентов. Тест-система иммуноферментная магноиммуносорбентная для выявления возбудителя сибирской язвы в споровой

Личный вклад соискателя. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором в сотрудничестве, главным образом, с к.б.н. Е.В. Беловой (ГНЦ ПМБ), к.б.н. A.M. Барановым (ГНЦ ПМБ), к.б.н. A.B. Козырь (ГНЦ ПМБ), к.б.н. A.B. Колесниковым (ГНЦ ПМБ), к.м.н. С.С. Ветчининым (ГНЦ ПМБ), к.м.н. Е.В. Барановой (ГНЦ ПМБ), д.б.н. И.В. Жарниковой (СтавНИПЧИ) и д.б.н., проф. И.Г. Шемякиным. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль автора была определяющей. В исследованиях также принимали участие сотрудники ГНЦ ПМБ Р.И. Миронова и Н.М. Лунева.

План и аннотация диссертации обсуждены и одобрены на заседании Ученого совета ГНЦ ПМБ 24 декабря 2008 г., протокол № 8. Результаты исследований доложены на заседании межлабораторного семинара ГНЦ ПМБ (протокол № 22 от 28 декабря 2011 г).

Публикации. Основное содержание работы отражено в 10 научных публикациях, в том числе в трех статьях, опубликованных в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, в одном патенте на изобретение №2439148 С1 РФ. ив МУ 4.2.2941-11,2011 г.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований с их обсуждением, заключение, выводы и указатель литературы, включающий 38 работ отечественных и 119 - зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 9 рисунками и

16 таблицами. Приложения состоят из трех статей, опубликованных по теме диссертации.

Материалы и методы исследования

Штаммы микроорганизмов. В работе использованы 29 штаммов возбудителя сибирской язвы и 57 штаммов близкородственных споровых сапрофитов рода Bacillus, полученных из лаборатории микробиологии сибирской язвы ФБУН ГНЦ ПМБ, из коллекции патогенных микроорганизмов ФГУЗ СтавНИПЧИ, из коллекции микроорганизмов ФКУЗ ИркутскНИПЧИ Сибири и ДВ и из коллекционного центра живых культур ФГУЗ ВолгоградНИПЧИ.

Споры использованных в работе штаммов микроорганизмов получали при выращивании микроорганизмов на голодном L-агаре/по Луриа (Луриа-Бертани), вегетативные клетки микроорганизмов получали при выращивании микроорганизмов на агаре Хоттингера (Оболенск, РФ).

Получение гибридом. Для иммунизации использовали мышей линии BALB/c. Мышей иммунизировали путем двукратного, с тридцатидневной экспозицией, подкожного введения спор штамма В. anthracis СТИ-1, эмульгированных с полным (первая иммунизация) и неполным (вторая иммунизация) адъювантом Фрейнца (Sigma, США). Бустер-дозы препарата (107спор) вводили внутривенно в физиологическом растворе. Проверку титра специфичных антител у иммунизированных мышей проводили непрямым твердофазным ИФА по методу A.M. Егорова [Егоров и др., 1991]. Интенсивность окрашивания анализировали при длине волны 492 нм (фотометр Пикон, РФ). В качестве отрицательного контроля использовали сыворотку крови интактной мыши. Для гибридизации брали мышей с титром специфичности 1:32000. Гибридизацию проводили по стандартному протоколу [Kohler & Milstein, 1975], в качестве партнера для слияния использовали мышиную миеломную клеточную линию X63-Ag8.653. Полученные гибридомные клоны были первично проскринированы в ИФА. Гибридомы, проявляющие иммунореактивность в отношении спор В. anthracis в ИФА, клонировали и переклонировали методом лимитирующих разведений на 96-луночных планшетах с макрофагальным фидерным слоем. После повторной проверки специфической активности в ИФА отобрали гибридные клоны, продуцирующие антитела к спорам В. anthracis. Полученные клоны гибридом продуцентов МКА масштабировали, заложили на хранение в жидком азоте и использовали для наработки специфичных антител in vivo и in vitro.

Выделение и очистка МКА. Выделение МКА из асцитической жидкости проводили путем аффинной хроматографии на колонке с белком G-сефарозой (Protein G Sepharose 4 Fast Flow), согласно рекомендации производителя (GE Healthcare, Швеция). Чистоту полученных иммуноглобулиновых фракций оценивали методом SDS-PAGE-электрофореза в денатурирующих условиях. Концентрацию иммуноглобулинов определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм на спектрофотометре Smart Spec Plus (BIO RAD, США).

Определение подклаееовой принадлежности. Подклассы полученных МКА определяли с помощью набора для определения изотипов мышиных моноклональных антител (Roche Diagnostic Corporation, США).

Определение аффинностн МКА. Константу аффинности МКА определяли в неконкурентном иммуноферментном анализе по методу Beatty [Beatty et al., 1987].

Определение специфической и перекрестной активности полученных

МКА в отношении спор В. anthracis и спор близкородственных спорообразующих бацилл проводили методом дот-блот анализа.

Подбор пар МКА проводили в двухсайтовом дот-блот анализе. Приготовление биотинилирующего реагента проводили по методу Duk [Duk, 1994]. Рабочий титр конъюгированных МКА определяли в ИФА.

Для разработки тест-системы иммуноферментной

магнонммуносорбентой были использованы магноиммуносорбенты (МИС), полученные по методике, описанной в изобретении [Пат. РФ. №2138813, G-01, №33/543]. Чувствительность и специфичность МИС проверяли путем постановки ИФА со штаммами В. anthracis и штаммами близкородственных бацилл в споровой форме. В качестве отрицательного контроля использовали фосфатно-солевой буфер с альбумин-твином (USB, США). Учет результатов проводили на фотометре (Пикон, РФ) для ИФА при длине волны 492 нм. Положительными считали результаты, если оптическая плотность образцов в два и более раз превышала оптическую плотность отрицательного контроля.

Получение рекомбинантных белков В. anthracis ЕА1 и BclA. ДНК штамма В. anthracis СТИ-1 была амплифицировали с использованием пары праймеров, специфичных к 5' и 3'- концам кодирующих областей генов eal и bel А. Гены был клонировали в экспрессионный вектор на основе pET-MASMT [Патент РФ №2355769], содержащий последовательности для N-концевых пептидов MASMT, His6 и с-тус, используемые для аффинной очистки, детекции, и оптимизации трансляционного контекста белков. Рекомбинантные антигены ЕА1 и BclA продуцировали в Е. coli BL21(DE3) и очищали металл-хелатной хроматографией. Очищенный препарат проверяли на взаимодействие с полученными МКА методом иммуноблоттинга.

Результаты исследований и обсуждение

Отбор высокоаффннных и специфичных МКА

Одним из важных этапов работы по конструированию иммунодиагностических тест-систем с использованием МКА является отбор стабильных клеточных линий (гибридом), продуцирующих высокоаффинные, специфичные МКА.

В ходе работ получили и охарактеризовали панель из 20 гибридных клонов, продуцирующих МКА к спорам возбудителя сибирской язвы В. anthracis. Следует отметить, что антигенные различия между спорами представителей рода Bacillus минимальны [Quinlant & Foegeding, 1997], и отсутствие перекрестного взаимодействия антител, полученных к спорам В. anthracis, со спорами близкородственных спорообразующих бацилл является одним из важнейших факторов, обеспечивающих возможность применения полученных антител для разработки специфичных диагностических тест-систем.

Исследование специфической активности полученных МКА показало, что шесть из исследованных МКА - 4Е6, 2В8, 3G3, 2С8, 6В6 и 1Е6 - специфически взаимодействовали со спорами 16 штаммов возбудителя сибирской язвы в концентрации 105 спор/мл и не давали перекрестных реакций со спорами близкородственных бацилл. Результаты по определению специфической активности МКА представлены в таблице 1.

В качестве кандидатов для конструирования иммунодиагностических тест-систем было отобрано шесть МКА (4Е6, 2В8, 3G3, 2С8, 6В6 и 1Е6), специфически взаимодействовавших со спорами В. anthracis и не связывавших споры близкородственных микроорганизмов.

Отобранные МКА охарактеризовали (рис. 1), показали, что МКА, 2В8, 3G3, 2С8, 6В6, 1Е6 относятся к иммуноглобулинам изотипа Gl, а МКА 4Е6 - изотипа G2a. Чистоту выделенных препаратов иммуноглобулинов и молекулярные массы легкой и тяжелой цепей полученных МКА определяли методом белкового SDS-ПААГ электрофореза. Результаты по определению констант аффинности МКА показали, что наибольшей аффинностью обладают три антитела: 1Е6, 6В6 и 3G3.

Во многих случаях для конструирования иммунодиагностичесих тест систем используют диагностически значимые пары антител, что позволяет снизить неспецифическое взаимодействие и проводить выделение возбудителя из больших объемов проб. Для формирования диагностических пар было необходимо выбрать из имеющейся панели антитела, не только не конкурирующие за общие сайты связывания, но и не теряющие специфической активности при конъюгировании с ферментной или иной меткой. Подбор пар МКА осуществляли методом двухсайтового дот-блот анализа. В результате установили, что наибольшая чувствительность анализа (до 10б спор/мл) достигалась при использовании в качестве первого антитела МКА 1Е6, 3G3, и в качестве второго антитела - МКА 6В6. При использовании других комбинаций антител реакция была менее интенсивна (рис. 2).

Подобранные пары МКА использовали при конструировании ИФА-тест-системы и МИС для выявления возбудителя сибирской язвы в споровой форме.

Таблица 1 - Перекрестная активность МКА с бактериальными спорами

Споры (10;спор мл) штаммов микроорганизмов Реактивность моноклональных антител