Ингибиторы матричных биосинтезов дифтерийный токсин
Существует большая группа веществ, ингибирующая синтез ДНК, РНК или белков. Некоторые из них нашли применение в медицине для лечения инфекционных болезней и опухолевых новообразований, а другие для человека оказались токсинами.
Действие ингибиторов матричных биосинтезов как лекарственных препаратов основано на модификации матриц: ДНК, РНК, белоксинтезирующего аппарата (прежде всего, рибосом) или на инактивации ферментов. Центральное место среди них принадлежит антибиотикам — разнообразным по химическому строению органическим соединениям, синтезируемым микроорганизмами, главным образом, микроскопическими грибами, и способным в малых количествах оказывать избирательное токсическое действие на другие микроорганизмы (табл. 4-5).
Таблица 4-5. Антибиотики — ингибиторы матричных биосинтезов как лекарственные препараты
Алкилирует ДНК и нарушает репликацию
Ингибируют ДНК-топоизомеразу II, ответственную за суперспирализацию ДНК, нарушают репликацию и транскрипцию
Связываются с бактериальной РНК-полимеразой и препятствуют началу транскрипции
Ингибируют элонгацию: связываются с 30S субъединицей рибосомы и блокируют присоединение аа-тРНК в А-центр Присоединяется к 50S субъединице рибосомы и ингибирует пептидилтрансферазную активность
Присоединяется к 50S субъединице рибосомы и ингибирует транслокацию
Ингибирует инициацию трансляции. Связывается с 30S субъединицей рибосомы, вызывает ошибки в прочтении информации, закодированной в мРНК
А. Ингибиторы репликации — противоопухолевые препараты
Избирательность действия противоопухолевых антибиотиков невелика и обеспечивается более высокой по сравнению с нормальными клетками скоростью синтеза ДНК и РНК, а также повышенной проницаемостью клеточных мембран опухолевых клеток. В то же время эти соединения токсичны для быстроделящихся нормальных клеток организма, таких как стволовые клетки кроветворной системы, клетки слизистой оболочки желудка и кишечника, фолликулов волос. В последние годы проводятся исследования по созданию препаратов, обеспечивающих доставку ингибитора только в опухолевые клетки. Это достигается связыванием цитотоксических антибиотиков с белками, рецепторы к которым имеются главным образом на опухолевых клетках (см. раздел 15).
К препаратам, останавливающим репликацию, относят алкилирующие агенты и ингибиторы ДНК- топоизомеразы II (одной из изоформ топоизомераз). Последние называют ингибиторами гираз, поскольку ДНК-гиразы — ферменты прокариотических клеток, ответственные за суперспирализацию ДНК; у эукариотов аналогичную функцию выполняют ДНК-топоизомеразы. Известно, что транскрипция некоторых генов возможна лишь при определённом уровне суперспирализации матрицы. Соединения, вмешивающиеся в работу ДНК-гираз, могут ингибировать или активировать синтез РНК. К ингибиторам гираз принадлежат налидиксовая кислота, новобиоцин и номермицин.
Б. Ингибиторы транскрипции и трансляции — антибактериальные препараты
К ингибиторам матричных синтезов, оказывающим противобактериальное действие, относят вещества, блокирующие синтез РНК или белка. В эту группу входит широко применяемый в клинике рифампицин, получаемый на основе природного антибиотика рифамицина. Антибиотики из семейства рифамицинов ингибируют только бактериальную ДНК-зависимую РНК-полимеразу, связываясь с β-субъединицей фермента и препятствуя инициации транскрипции (рис. 4-44). Их применяют для лечения туберкулёза, так как эти препараты не влияют на работу ядерных РНК-полимераз эукариотических клеток. Однако они могут ингибировать синтез митохондриальных РНК, хотя дозы препарата, при которых блокируется образование митохондриальных РНК, выше тех, что используют в лечении инфекционного заболевания.
Рис. 4-44. Антибиотики из семейства рифамицинов.
Большая группа антибиотиков является ингибиторами трансляции (рис. 4-45): тетрациклины, эритромицин, пуромицин, хлорамфеникол и аминогликозиды. Так, один из наиболее известных аминогликозидов стрептомицин ингибирует инициацию синтеза белка у прокариотов и вызывает ошибки в прочтении информации, закодированной в мРНК. Его часто назначают при лечении инфекционных заболеваний сердца. К антибиотикам широкого спектра действия относят тетрациклины. Они связываются с 30Sсубъединицей рибосомы и блокируют присоединение аминоацил-тРНК в А-центр рибосомы, тем самым нарушая элонгацию полипептидной цепи. Тетрациклины эффективны в отношении возбудителей многих болезней. Левомицетин (хлорамфеникол) также относят к антибиотикам широкого спектра действия. Он ингибирует синтез белка за счёт присоединения к 50S субъединице рибосомы, подавляя пептидилтрансферазную активность.
Рис. 4-45. Некоторые антибиотики-ингибиторы синтеза белков у прокариотов.
Пенициллины и цефалоспорины относят к группе β-лактамных антибиотиков, продуцируемых плесенью штамма PeniciUum. В структуре этих молекул присутствует реакционноспособное β- лактамное кольцо, вызывающее ингибирование синтеза клеточных стенок у грамотрицательных микроорганизмов. Действие этих антибиотиков направлено на фермент, обеспечивающий образование поперечных связей в структуре белков клеточной стенки бактерий. Необратимое ингибирование активности этого фермента ведёт к образованию изменённых клеточных стенок и гибели бактерий в процессе размножения.
Надо сказать, что препараты антибактериальной группы отличаются высокой избирательностью и сравнительно мало токсичны для человека. Это объясняется различиями в структуре РНК-полимераз, РНК и белков рибосом в эукариотических и прокариотических клетках.
В. Вирусы и токсины — ингибиторы матричных синтезов в эукариотических клетках
Генетический материал вирусов представлен молекулой ДНК или РНК. Он, как правило, невелик и содержит информацию лишь о некоторых специфических белках и ферментах, необходимых для репродукции вируса (например, вирусов оспы, гриппа, полиомиелита, гепатита). Вскоре после заражения с высокой скоростью начинается синтез вирусных ДНК, РНК и белков с использованием ферментов и белков, субстратов и источников энергии клетки хозяина. При этом в инфицированных клетках прекращается синтез нуклеиновых кислот и белков, свойственных организму хозяина. Репродукция вирусных частиц идёт вплоть до гибели заражённой клетки.
Причиной гибели людей при отравлении бледной поганкой Amanita phalloides является токсин — α-аманитин, который содержится в теле гриба и вызывает необратимую дисфункцию печени и почек. Высокая токсичность этого соединения для человека связана с тем, что оно ингибирует эукариотические РНК-полимеразы. Наибольшую чувствительность к яду обнаруживает РНК-полимераза II, катализирующая синтез мРНК. Для α-аманитина LD50 (доза per os, при которой погибает 50% лиц, получивших токсин) составляет 0,1 мг/кг массы тела.
Чрезвычайно токсичен белок рицин, выделенный из клещевины обыкновенной. Он представляет собой N-гликозилазу, которая удаляет один остаток аденина из 28S рРНК большой субъединицы рибосомы и ингибирует синтез белка у эукариотов. Рицин — белковый компонент касторового масла, иногда используемого в качестве слабительного средства. Из-за высокой токсичности рицина лечение касторовым маслом проводят короткими курсами, так как длительное употребление может вызвать непрекращающийся понос, нарушение работы кишечника и даже гибель больного.
У человека развитие некоторых бактериальных инфекций сопровождается ингибированием матричных синтезов. Наиболее изученный пример — ингибирование синтеза белков в клетках слизистой оболочки зева и гортани энтеротоксином возбудителя дифтерии Corynebacterium diphteriae. Некоторые штаммы этого патогенного микроорганизма получают ген токсина от бактериального вируса, называемого β-фагом, который инфицирует бактерию и индуцирует синтез токсина — одноцепочечного белка с молекулярной массой 60 кД. В цитоплазме клеток хозяина под влиянием протеолитических ферментов токсин расщепляется на 2 фрагмента, один из которых является ферментом АДФ-рибозилтрансферазой. Этот фермент катализирует АДФ-рибозилирование и инактивацию фактора элонгации EF-2 по реакции:
В условиях in vitro эта реакция обратима, но при pH и концентрации никотинамида, которые существуют в клетках, она становится необратимой. Модификация фактора EF-2 нарушает транслокацию рибосом, ведёт к прекращению биосинтеза белков в инфицированных клетках и к их гибели. С действием токсина связаны основные симптомы дифтерии.
Описаны и другие токсины бактериального и растительного происхождения, ингибирующие синтез и функциональную активность белков путём АДФ-рибозилирования или модификации рРНК.
Интерфероны — небольшие белки (гликопротеины), состоящие примерно из 160 аминокислотных остатков. Они секретируются некоторыми клетками позвоночных в ответ на заражение вирусами и препятствуют распространению вирусной инфекции. Этот класс белков синтезируется в исключительно малых количествах: от нанограммов (10 -9 г) до пикограммов (10 -12 г), но является очень активным неспецифическим противовирусным агентом (10 6 — 10 9 единиц антивирусной активности на 1 мг белка). Это соответствует способности одной молекулы интерферона защищать от инфекции одну клетку.
Некоторые компоненты вирусных частиц (например, двухцепочечная РНК) индуцируют синтез по крайней мере 3 типов интерферонов. У человека имеются 14 генов, кодирующих α-интерфероны, которые продуцируются В-лимфоцитами и макрофагами, 5 генов β-интерферонов, обеспечивающих образование соответствующих белков фибробластами, и 1 ген y-интерферона, экспрессия которого идёт в Т-лимфоцитах.
Связываясь с рецепторами на плазматической мембране заражённых клеток, эти белки, подобно белковым гормонам, стимулируют синтез ферментов, способных разрушать мРНК вирусов и прекращать синтез белков на рибосомах, препятствуя тем самым экспрессии вирусных генов в клетках эукариотов.
Исследование механизма действия интерферонов показало, что они:
• ингибируют синтез белков, необходимых для репликации вирусов;
• стимулируют синтез фермента олигонуклеотидполимеразы, катализирующего образование небольших количеств коротких олигоаденилатов: 2',5'-олиго (А). Эти олигонуклеотиды являются активаторами рибонуклеазы — фермента, расщепляющего матричные и рибосомные РНК;
• стимулируют синтез протеинкиназы, которая фосфорилирует и, тем самым, инактивирует фактор инициации eIF2:
eIF2 + АТФ —> eIF2 — ОРО3Н2 + АДФ.
В результате синтез всех белков в инфицированных клетках прекращается. Клетки погибают, но вместе с ними останавливается размножение вирусов, и начинается выздоровление. Таким образом, жертвуя небольшим количеством клеток, организм защищает себя от болезни.
В настоящее время интерфероны, полученные промышленным путём с использованием техники клонирования генов, широко используют при лечении обычной простуды, гриппа, полиомиелита, ветряной оспы, герпеса, вируса гепатита и других инфекций. Хорошие результаты показывает использование интерферонов в терапии некоторых видов злокачественных опухолей, главным образом, гемобластозов (см. раздел 15), хотя их роль в химиотерапии опухолей до настоящего времени остаётся малопонятной.
Биологическая библиотека - материалы для студентов, учителей, учеников и их родителей.
Наш сайт не претендует на авторство размещенных материалов. Мы только конвертируем в удобный формат материалы, которые находятся в открытом доступе и присланные нашими посетителями.
Если вы являетесь обладателем авторского права на любой размещенный у нас материал и намерены удалить его или получить ссылки на место коммерческого размещения материалов, обратитесь для согласования к администратору сайта.
Разрешается копировать материалы с обязательной гипертекстовой ссылкой на сайт, будьте благодарными мы затратили много усилий чтобы привести информацию в удобный вид.
Прекращение матричных биосинтезов ведет к гибели клетки. На этом основано применение антибиотиков (АБ), веществ, продуцируемых микроскопическими грибами, для лечения инфекционных болезней и злокачественных опухолей. АБ, взаимодействующие с ДНК, нарушают ее матричную функцию и подавляют репликацию или транскрипцию. Их применяют для лечения опухолей. Противоопухолевые АБ не отличаются избирательностью, т.е. практически взаимодействуют с ДНК как опухолевых, так и нормальных клеток. Поэтому при лечении могут повреждаться здоровые клетки, что требует хорошо поставленного контроля при использовании противоопухолевых АБ.
АБ, взаимодействующие с белками рибосом, ингибируют трансляцию. Они применяются в основном как противобактериальные средства, отличаются достаточно высокой избирательностью и часто сравнительно мало токсичны для человека. Это объясняется различиями в строении белков рибосом и бактерий человека.
- группа белков, регулирующих реакцию клетки на вирусную инфекцию. Синтез интерферонов индуцируется некоторыми компонентами вирусных частиц, в частности двуспиральной РНК, имеющейся во многих вирусах. Интерферон в свою очередь индуцирует синтез фермента протеинкиназы, которая катализирует фосфорилирование фактора инициации IF2:
В результате фактор инициации утрачивает активность, и синтез белков в клетке прекращается. Кроме того, интерферон активирует латентную РНКазу (механизм активации последней связан с активацией под влиянием интерферонов 2’,5’-олиго(А)-синтазы и накоплением в клетке 2’,5’-олиго(А)), которая расщепляет матричные и рибосомные РНК. Конечно, это ведет к гибели клетки, но вместе с ней погибают и вирионы.
Ингибирование синтеза белков дифтерийным токсином
Возбудитель дифтерии, размножающийся в слизистой зева, выделяет токсин белковой природы. Этот белок, состоящий из одной полипептидной цепи с мол. массой
60000, поступает в клетку, где под действием протеиназ клеток хозяина распадается на два фрагмента: А и В. Фрагмент А представляет собой фермент АДФ-рибозилтрансферазу, переносящий АДФ-рибозильный остаток с НАД + на фактор элонгации ЕF2:
НАД + + EF2 ® АДФ-рибозил-EF2 + никотинамид
Модифицированный таким образом фактор элонгации утрачивает способность участвовать в регенерации EF1 и трансляция прекращается. Этим объясняется токсическое действие белка. Фрагмент В не обладает ферментативной активностью, не токсичен. Он необходим для проведения фрагмента А через клеточную мембрану внутрь клетки.
С действием токсина связаны все основные симптомы дифтерии. Размножающиеся бациллы выделяют токсин, вследствие чего клетки слизистой зева погибают, и развивается воспалительная реакция. Из лейкоцитов, экссудата и погибших клеток образуется пленка, которая может стать причиной асфиксии, наиболее опасного осложнения дифтерии. Кроме того, дифтерийный токсин вызывает поражение сердца, что является частым осложнением заболевания.
Молекулярные механизмы генетической изменчивости
Естественный отбор и биологическая эволюция невозможны без генетической изменчивости, которая возникает за счет мутаций и рекомбинаций в процессе мейоза. В последнем случае происходит обмен участками ДНК между гомологичными хромосомами родителей.
С изменчивостью связаны такие явления как гетерогенность популяций человека и существование наследственных болезней.
Генные мутации
Мутации – это нерепарированные изменения первичной структуры ДНК, появляющиеся в молекуле в ответ на дефекты в работе ДНК-полимераз или ДНК-репарирующих систем, воздействия внешней и внутренней среды.
Точечные мутации (затрагивающие один нуклеотид ДНК) в основном бывают трех видов: замены (это наиболее распространенный тип повреждений молекулы ДНК), вставки и делеции (или выпадения) нуклеотидов.
Каждый тип мутации вызывает разные последствия: так, замена нуклеотида а) может быть “молчащей” и не проявиться в белке, если кодирующий триплет, в котором находится мутантный нуклеотид, из-за вырожденности кода обеспечивает включение в белок той же аминокислоты, что исходный кодон; б) может сопровождаться включением в белок одной измененной аминокислоты (миссенс-мутация). Так возникла, например, мутация, проявляющаяся как серповидно-клеточная анемия: кодон, ответственный за включение Glu в положение 6 b-цепи гемоглобина, превратился в кодон Val; в) если в результате замены образуется один из терминирующих кодонов – UAA, UAG или UGA (нонсенс-мутация), то синтез пептидной цепи обрывается и получается укороченный вариант белка.
Делеции и вставки также приводят к неоднозначным результатам: а) если включается или выпадает один нуклеотид или участок ДНК, в котором число нуклеотидов не кратно трем, то происходит сдвиг рамки считывания информации и при трансляции вся информация, расположенная за местом мутации, считывается неверно. В результате такой мутации синтезируется белок с бессмысленной последовательностью аминокислот. Такого типа мутации вызывают вещества, интеркалирующие (встраивающиеся) между азотистыми основаниями молекулами ДНК; б) если выпадает или включается в ДНК участок с длиной цепи, кратной 3, то сдвига рамки не происходит (делеция или вставка без сдвига рамки считывания информации). Белок, который зашифрован такой мутацией, будет либо укорочен (при делеции), либо удлинен (при вставке) на одну или несколько аминокислот.
В большинстве случаев мутации влияют на экспрессию или структуру генов, что проявляется в снижении количества или изменении структуры белкового продукта, а, следовательно, и его функциональной активности. Иногда снижение ил полное отсутствие белка является результатом мутаций в регуляторных участках генов.
Мутации в половых клетках передаются по наследству и могут проявляться в фенотипе потомства как наследственная болезнь, связанная со структурным или функциональным изменением белка. В соматических клетках мутации могут вызвать различные функциональные нарушения, такие как непереносимость некоторых пищевых и лекарственных веществ, предрасположенность к определенным заболеваниям, а иногда трансформацию клеток и развитие опухолей.
У разных особей возникают варианты (мутации) разных генов или варианты одного и того же гена. Варианты генов, образующиеся у отдельных особей, могут постепенно распространяться в популяции в результате наследования, если они не летальны. Так формируется генотипическая неоднородность популяции, которая ведет и к фенотипической неоднородности. На молекулярном уровне наиболее изучен (как следствие генотипической гетерогенности) полиморфизм белков – существование разных форм белка, выполняющего одинаковые или очень сходные функции (изобелки).
Причинами, приводящими к образованию изобелков, являются: 1) мутации; 2) рекомбинации. Гомологичные хромосомы половых клеток в процессе мейоза могут обмениваться аллелями или их частями. Если при рекомбинации аллельные гены обмениваются не целиком, а участками меньшей длины, то такой обмен будет приводить к появлению новых, прежде не существовавших в популяции аллелей (а не просто новых сочетаний прежних аллелей). Рекомбинации – гораздо более частые события, чем мутации, поэтому разнообразие форм внутри вида обусловлено главным образом именно рекомбинациями; 3) амплификация генов. При дихотомической эволюции происходит удвоение генов, т.е. образуются новые генные локусы: сначала это копии исходного гена, но последующие мутации копий приводят к появлению в организме изобелков. В этом случае варианты белка являются продуктами разных генных локусов, а не аллельных генов.
Т.о., изобелки – это множественные молекулярные формы белка, обнаруживаемые в пределах организмов одного биологического вида, как результат наличия в генотипе вида множественных аллелей или множественных генных локусов.
Примеры полиморфизма белков. Гемоглобин
Гемоглобины А (a2b2), А2 (a2d2), F (a2g2) содержатся в эритроцитах всех людей. Гены этих белков не аллельны – они занимают разные локусы. Эти гены возникли в результате дупликации гена-предшественника и последующих независимых мутаций. Но в крови некоторых людей обнаруживаются гемоглобины, являющиеся продуктами аллельных генов. Один из вариантов – это HbS. По аллелям HbA и HbS все люди делятся на три группы с генотипами AA, AS и SS. У людей первой группы эритроциты содержат HbA, у второй – HbA и HbS, у третьей – HbS. Распространенность аллеля S – людей с генотипами AS и SS – географически неравномерна: у некоторых народностей Азии и Африки – до 35%, тогда как у европейцев встречается редко.
Существует еще один вариант гемоглобина: Hb C (β6Glu→Lys). По этой паре аллелей существуют генотипы АА, АС и СС. Теперь всех людей можно разделить на пять генотипически и фенотипически разных групп: AA, AS, SS, АС, СС. Известно около 300 аллельных вариантов гемоглобина А. Следовательно, по всем аллелям HbA люди образуют около 600 генотипически различающихся групп.
Группы крови
Групповая принадлежность крови определяется системой АВО, имеющей важное значение для практики переливания крови.
Интегральный гликопротеин глифорин присутствует только в плазматической мембране эритроцитов. К N-концевой части белка, расположенной на наружной поверхности мембраны, прикреплено около 20 олигосахаридных цепей. Олигосахариды гликофорина – антигенные детерминанты системы групп крови АВО.
У созревающих эритроцитов этот олигосахарид имеет последовательность: фукоза - галактоза – N-ацетилглюкозамин – R. Олигосахарид ковалентно связан с липидами мембраны. При созревании эритроцита олигосахарид удлиняется на один моносахаридный остаток. Присоединение моносахарида к галактозе катализирует фермент гликозилтрансфераза. В популяции человека встречаются три аллельных гена этого фермента (А, В и О) и соответственно три аллельных варианта фермента, которые обозначаются теми же буквами. Варианты фермента А и В различаются по субстратной специфичности: вариант А присоединяет к олигосахариду N-ацетилгалактозу, а вариант В – галактозу. Аллельный ген О кодирует синтез белка, не имеющего ферментативной активности. Т.о. разные аллели обусловливают образование гликозилтрансфераз, катализирующие процессы:
аллель А ® фермент А ® олигосахарид А
аллель В ® фермент В ® олигосахарид В
аллель О ® неактивный белок ® олигосахарид не достроен.
Разветвленные олигосахариды А и В являются антигенами. К каждому из них могут вырабатываться антитела. При смешивании раствора анти-А с кровью, эритроциты которой содержат антиген А, происходит агглютинация эритроцитов. То же происходит при встрече анти-В с эритроцитами, содержащими антиген В. Поэтому при переливании крови руководствуются правилом: кровь донора и реципиента не должна содержать антиген и антитело, реагирующие между собой, иначе произойдет агглютинация эритроцитов и гемолиз.
В настоящее время известны десятки белков, для которых найдены множественные формы. Есть основания считать, что у значительной части из десятков тысяч структурных локусов генома человека имеются аллели. А это значит, что число разных генотипов может быть практически неисчерпаемым.
Полиморфизм белков и других биохимических структур настолько велик, что можно говорить о биохимической индивидуальности. С биохимической индивидуальностью связаны и индивидуальные особенности развития и здоровья.
Использование ДНК-технологий в медицине
Получение рекомбинантных ДНК.
Получение гена или его фрагмента осуществляется, как правило, с использованием рестриктаз – ферментов из группы эндонуклеаз, “узнающих” определенную последовательность нуклеотидов ДНК и расщепляющих обе нити. Расщепление обеих нитей ДНК может происходить двояким путем с образованием двухцепочечных (“слепых”) или одноцепочечных (“липких”) концов.
Ген или его фрагмент, имеющий “липкий” конец, может по принципу комплементарности взаимодействовать с “липким” концом другого, не родственного ему фрагмента ДНК, полученного при действии на ДНК одной и той же рестриктазы. Фрагменты ковалентно соединяют друг с другом с помощью ДНК-лигазы и получают рекомбинантные (гибридные) ДНК. Далее, с помощью вектора, обычно ретровируса, чужеродный ген вводится в бактерию, и здесь обеспечивается репликация, транскрипция и трансляция с образованием нужного продукта.
С помощью техники рекомбинантных ДНК оказалось возможным: а) использовать микроорганизмы в качестве продуцентов веществ, необходимых для человека (инсулин, гормон роста, VIII фактор свертывания крови для лечения гемофилии); б) лечить наследственные и ненаследственные (инфекционные) заболевания путем введения генов в клетки пациентов для устранения дефектов генов или придания им новых функций. Впервые эта задача была успешно решена в 1990 году, когда 4-летней девочке, страдающей наследственным иммунодефицитом, вызванным мутацией в гене аденозиндезаминазы, были пересажены ее собственные лимфоциты, предварительно трансформированные вне организма рекомбинантной ДНК, содержащей ген аденозиндезаминазы и ретровирусный вектор. В настоящее время предпринимаются попытки лечения подобным способом некоторых наследственных заболеваний, а также ВИЧ-инфекции.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
- метод получения большого числа копий (несколько миллионов) гена или его фрагмента за короткий период времени в условиях репликации in vitro, требующий очень малых количеств исходной ДНК в образце. Объектами для выделения ДНК могут быть кровь, раневое отделяемое и т.д. Метод широко используется, в частности, в микробиологии для тестирования инфекционных возбудителей.
Дата публикования: 2015-11-01 ; Прочитано: 1151 | Нарушение авторского права страницы
studopedia.org - Студопедия.Орг - 2014-2020 год. Студопедия не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования (0.004 с) . 
ДНК человека содержит около 3 млрд. нуклеотидов. Точность их копирования зависит от точности: а) репликации, б) транскрипции, в) трансляции.
Факторы нарушения структуры ДНК: УФО, ионизация, химические агенты, спонтанные изменения (при фоновых излучениях).
Чаще всего происходит депуринизация (50'000 нуклеотидов за 70 лет жизни) – 40% всех пуриновых нуклеотидов (за 70 лет). Реже – дезаминирование и депиримидирование.
Этим процессам препятствуют процессы репарации ДНК. Т.о., постоянство информации поддерживается с помощью репликации и репарации.
Изменчивость генотипа наблюдается в результате мутаций. Их молекулярной основой является нерепаративное изменение первичной структуры ДНК. Напр., при действии азотной к-ты изменяются Ц→У, Ц→Г, У→А – эти изменения репаративная система "не замечает".
Система репарации ДНК
Репаративная система состоит из трех ферментов: (1) эндонуклеаза, (2) экзонуклеаза, (3) ДНК-полимераза (репарирующая).
Механизм репарации ДНК:
1. ДНК-эндонуклеаза обнаруживает участок повреждения и вызывает в этом месте разрыв фосфодиэфирных связей.
2. ДНК-экзонуклеаза отщепляет с образовавшихся концов нуклеотиды, в том числе и поврежденные.
3. ДНК-полимераза репарирующая восстанавливает нуклеотиды по принципу комплементарности.
Они затрагивают небольшие участки ДНК (на уровне генов). Виды генных мутаций:
1. Замена нуклеотидов или кодонов. Замена одного нуклеотида – точечная мутация.
1.1. Замена нуклеотида без изменения смысла кодона. Напр., ААА (лиз)→ ААГ (лиз)
1.2. Замена нуклеотида с изменением смысла кодона. Напр., ААГ (лиз)→ ГАГ (глу). Это миссенс-мутация.
1.3. Замена с образованием терминирующего кодона. Напр., ААА (лиз)→ УАА (обрыв транскрипции). Это нонсенс-мутация.
2.1. Вставка одного или нескольких кодонов (т.е. триплетов), при этом не происходит сдвига рамки считывания. Напр., ААА ГЦА ГГА ЦЦА → ААА ГАГ ГЦА ГГА ЦЦА. В белке появляется одна или несколько "лишних" АК.
2.2. Вставка 1, 2 и др., но не кратного трем кол-ва нуклеотидов. Происходит сдвиг рамки считывания. Напр., ААА ГЦА ГГА ЦЦА → ААА ГАГ ЦАГ ГАЦ ЦА… Получается пептид со случайной аминокислотной последовательностью.
3.1. Выпадение одного или нескольких кодонов. Нет сдвига рамки считывания. Образуется белок, укороченный на одну или несколько АК.
3.2. Выпадение нуклеотидов 1, 2, но не кратного трем кол-ва. Сдвиг рамки считывания. Синтезируется пептид со случайной последовательностью АК.
Мутации, возникающие в половых клетках, передаются по наследству. Мутации соматических клеток могут приводить к раковому преобразованию клетки.
По биологическим последствиям мутации:
ü молчающие – не проявляются в обычных физиологических условиях, а проявляются в экстремальных условиях.
ü нейтральные – формируется нормальный белок (напр., при замене ГЛУ на АСП).
ü вредные (патогенные) – приводят к заболеванию (напр., при замене в гемоглобине в 6-м положении АК ГЛУ на ВАЛ развивается серповидно-клеточная анемия.
ü полезные – способствуют лучшей адаптации.
Ингибиторы матричных биосинтезов (Антибиотики)
а) ингибиторы, модифицирующие матрицы,
б) модифицирующие рибосомы,
в) инактивирующие ферменты.
Ингибиторы трансляции применяются против прокариот (это антибактериальные препараты). К ингибиторам транскрипции и репликации чувствительны и прокариоты, и эукариоты – они используются для подавления злокачественного роста. Напр., флеомицин, связываясь с ДНК, подавляет репликацию; актиномицин Д ингибирует транскрипцию; митомицин образует ковалентные связи с ДНК (нарушает и транскрипцию, и репликацию). Они подавляют биосинтез во всех клетках.
Стрептомицин нарушает структуру рибосом.
Тетрациклин нарушает связывание аминоацил-тРНК с рибосомами.
Эритромицин нарушает образование пептидных связей, нарушает конформацию 50S-субъединицы рибосом.
В результате мутаций возникают различные варианты генов. Если эти варианты не летальны, то они наследуются. Так формируется генотипическая неоднородность (гетерогенность). Это ведет к фенотипической неоднородности. Следствием генотипической неоднородности является полиморфизм белков – это существование разных форм белка, выполняющих одинаковые функции, но отличающихся по физико-химическим свойствам (и по первичной структуре).
Это изобелки, в т.ч. изоферменты.
Так, известно более 300 вариантов гемоглобина, 30 вариантов глюкозо-6-фосфат-ДГ, 14 вариантов альфа1-антитрипсина, 30 вариантов А,В-белков групп крови, 10 вариантов алкоголь-ДГ и ацетальдегид-ДГ.
Биохимический полиморфизм настолько велик, что в настоящее время говорят о биохимической индивидуальности.
Биохимический полиморфизм лежит в основе предрасположенности к заболеваниям (напр., атеросклерозу, алкоголизму, сахарному диабету), непереносимости некоторых пищевых компонентов (напр., лактозы – 15% европейцев, 80% азиатов), непереносимости лекарственных препаратов (напр., непереносимости препарата дитилина при сниженной активности холинэстеразы – дитилин используют при бронхиальной астме).
Биологические последствия обратной транскрипции
В молекулярной биологии принят основной постулат: ДНК → мРНК → белок. Однако, в 1970-е гг. Тёмин открыл фермент обратную транскриптазу (или ревертазу), катализирующую процесс обратной транскрипции (мРНК → кДНК - комплементарная ДНК). Этот процесс характерен для РНК-содержащих вирусов (ретровирусов), в которых имеется ревертаза, напр., для ВИЧ.
Обратная транскрипция заключается в синтезе короткого фрагмента ДНК, используя мРНК в качестве матрицы. Эта вирусная ДНК внедряется в ДНК хозяина (интеграция), что может приводить к образованию новых вирусных частиц. Интеграция беспорядочна и может привести (1) к мутациям, (2) к образованию онкогенов, (3) к усиленной работе эмбриональных генов (которые в норме во взрослом организме не функционируют).
Теломеры и теломеразы
Метод культуры клеток in vitro широко распространен. Если в эти условия поставить опухолевые клетки, то они делятся бесконечно долго – иммортализованные клетки. Нормальные клетки делятся ограниченное количество раз (это установил Л.Хэйфлик), есть предел деления – лимит Хэйфлика.
Напр., клетка новорожденного может делиться митозом 80-90 раз, взрослого – 60-70 раз, стариков – 20-30 раз, затем репликация нарушается и клетка гибнет.
В 1998 г. американские ученые смогли заставить нормальные клетки делить в 2 раза больше лимита Хэйфлика. В этом участвовали вещества теломеры и ферменты теломеразы.
Теломеры – это специализированные концевые районы хромосомной ДНК, состоящие из многократно повторяющихся коротких нуклеотидных последовательностей. Предполагалось, что эти вещества состоят из 6-8 нуклеотидов: TTAGGG – этот блок повторяется многократно, в результате длина их составляет 2-20 тысяч пар оснований.
Во время репликации в структуре ДНК имеется праймер – короткий РНК-олигонуклеотид, к которому присоединяется ДНК-полимераза. С этого места начинается репликация. Затем происходит удаление праймера и 5'-конец оказывается короче 3'-конца. Возникает эффект недорепликации (Оловников). Образовавшиеся нити ДНК наращиваются с помощью теломеразы. Теломераза синтезирует теломеры. Теломераза – РНК-содержащий фермент, она синтезирует по принципу обратной транскрипции концевой участок, а ДНК-полимераза наращивает другую цепь.
Т.к. теломераза синтезирует теломеры, то она повышает длительность жизни клетки. Повышенная активность теломераз делает клетку бессмертной. Активность теломеразы в различных клетках различна. По активности теломераз выделяют:
1. Соматические клетки. Теломеры их содержат 10-12 тысяч пар нуклеотидов и отсутствует теломеразная активность. Но в макрофагах и лейкоцитах теломераза активна.
2. Половые клетки. Теломеразная активность высокая, теломеры содержат больше – 15-20 тысяч –пар нуклеотидов. То же и в стволовых клетках.
3. Раковые клетки. Длина теломер не очень большая (8-10 тысяч пар нуклеотидов), но высокая теломеразная активность (у 80% раковых клеток).
Т.о., современная биохимия имеет задачей:
а) увеличение теломеразной активности в отдельных клетках, напр., в клетках кожи для восстановления ее после ожогов;
б) снижение теломеразной активности в раковых клетках.
Патология белкового обмена
Нарушения обмена белков могут наблюдаться на различных этапах:
1. На этапе поступления питательных белков в организм. В сутки человеку требуется около 100 г белка. Т.к. белки содержат незаменимые АК, то недостаточное поступление их ведет к снижению или даже к отсутствию синтеза белков в организме.
ЛИЗ – тошнота, головокружение, повышенная чувствительность к шуму; недостаток
ТРИ – снижение массы тела, гипопротеинемия;
ГИС – снижение гемоглобина в крови;
МЕТ – развитие жирового перерождения печени и почек.
Общее снижение кол-ва белка → белковая недостаточность → отрицательный азотистый баланс, гипопротеинемия.
Тяжелая форма белковой недостаточности – квашиоркор. Сначала снижается общий белок, снижение альбумина ведет к отекам (из-за изменения онкотического давления), снижение гемоглобина ведет к анемии, а само снижение синтеза белка приводит к гипераминоацидемии (повышение АК в крови) и к аминоацидурии. Также снижается синтез ферментов поджелудочной железой (трипсин, химотрипсин, полипептидазы – тоже белки), что ведет к снижению усвоения белка в кишечнике.
2. Нарушение на этапе пищеварения.
2.1. В желудке. Возможна гипоацидитас и анацидитас – ахлоргидрия (снижение и отсутствие кислотности в желудке соответственно). При ахлоргидрии начинается гниение белков.
Гиперацидитас – усвоение белка не нарушается, но может быть поражение слизистой желудка, переходящее в язву.
2.2. В тонкой кишке. Нарушение усвоения белка при панкреатитах, снижении секреции трипсина, химотрипсина.
2.3. В толстой кишке. Повышение процессов гниения белка, напр., при запорах, непроходимости кишечника.
3. Нарушение обмена белков в тканях, т.е. на уровне межуточного обмена. Может быть связано нарушением обмена АК.
3.1. Приобретенные нарушения обмена связаны с дефицитом витаминов; особенно В6 – нарушение процессов переаминирования и дезаминирования АК, развивается аминоацидурия. Либо связаны с гормональными нарушениями обмена АК.
3.2. Наследственные нарушения обмена АК.
Пример 1: в норме фенилаланин (ФЕН) под действием фенилаланингидроксилазы (ФАГ) окисляется кислородом до тирозина (ТИР).
При наследственной патологии (нарушении образования ФАГ) ФЕН накапливается в тканях и затем превращается в фенилпируват, который может превращаться в фениллактат или в фенилацетат. Они накапливаются в тканях и выделяются с мочой (фенилкетонурия). Эти соединения токсичны для ткани мозга, их накопление вызывает нарушения физического и умственного развития. При дефиците ФАГ развивается фенилпировиноградная олигофрения. Если она развилась по гомозиготному типу, то ребенок умственно отсталый и нуждается в помещение в специализированное учреждение. Необходима ранняя диагностика фенилкетонурии (первые 7-10 дней после рождения). Если ребенку ставится этот диагноз, то ему назначается диета, обедненная фенилаланином. Диета сохраняется до 16-18 лет (средний уровень развития).
Пример 2: Генетические нарушения обмена тирозина (ТИР). В организме ТИР образуется из ФЕН (катализируется ФАГ). Затем ТИР может превращаться: (1) в меланин, (2) в тиреоидные гормоны, (3) в ДОФА, а затем в адреналин, (4) в гомогентизиновую к-ту, а затем в конечные продукты (в мочу). Если нарушается блок "ТИР → меланин" (катализируется тирозиназой), то наблюдается альбинизм (отсутствие пигмента кожи меланина). Если блок "гомогентизиновая к-та → конечные продукты" (катализируется оксидазой в присутствии аскорбиновой к-ты), то наблюдается алкаптонурия: моча приобретает темно-бурую окраску, вплоть до черной). Также алкаптонурия может быть приобретенной – при авитаминозе С.
Пример 3: Гистидинемия – повышение ГИС в крови. В норме ГИС под действием гистидазы превращается в уроканиновую к-ту (5-формиминотетрагидрофолиевую к-ту). Накапливающийся ГИС приводит к нарушению умственного и физического развития.
4. Нарушения на стадии биосинтеза белка. Чаще всего наблюдается усиленный синтез белка к.-л. клеткой (злокачественное новообразование).
Механизмы развития раковой опухоли
Рак – генетическое заболевание, т.е. повреждение генов.
Виды повреждений генов:
2) собственно повреждение гена,
3) активация гена,
4) инактивация гена,
5) привнесение генов извне (внедрение добавочных генов).
В каждой клетке находится около 100'000 генов. В настоящее время признано, что ряд генов может превращаться в гены, несущие информацию о белках опухолевой клетки – онкогены. Часто это нормальные гены, но в норме функционирующие только в эмбриональном периоде или малоактивные, которые стали активными.
Механизмы активации генов представлены: а) мутацией генов и б) активацией генов.
В настоящее время выделено более 100 онкогенов. Помимо онкогенов есть еще антионкогены – гены-супрессоры опухолей (ГСО). Белковые продукты этих генов препятствуют превращению нормальной клетки в опухолевую. Наиболее часто онкогены и ПСО встречаются среди генов белков-передатчиков сигналов регуляции роста и размножения клеток.
1) среди генов факторов роста,
2) среди R факторов роста,
3) среди белков-передатчиков сигнала внутрь клетки,
4) среди факторов транскрипции,
5) среди генов белков, связанных с ростом и размножением клетки.
Активация одного онкогена или потеря функций одного гена-супрессора недостаточна для превращения нормальной клетки в опухолевую; подсчитано, что клетке человека необходимо для этого 10 мутаций. Но выявлены гены, появление которых способствует опухолевому росту, так перерождение гена Р53 – в 50%. Ген Р53 кодирует информацию о белке клеточного роста. Это ген апоптоза – ген, приводящий к гибели поврежденную клетку. Если этот ген поврежден, то сохраняются клетки с мутационными изменениями, что приводит к накоплению мутаций. Это объясняет возникновение опухолевого роста у пожилых людей.
Считается, что вирусы вносят в клетку новые онкогены, которые повышают вероятность развития опухоли. Также число мутаций повышают физические и химические факторы.
5. Нарушение обмена белка на стадии образования конечных продуктов.
5.1. Чаще всего нарушения в орнитиновом цикле мочевинообразования. При этом нарушения на разных уровнях приводят к накоплению разных продуктов (предшествующих нарушенному процессу). Напр., нарушение образования карбомаилфосфата ведет к гипераминоацидемии (повышению АК в крови), накоплению аммиака. Либо нарушение аргининосукцинатсинтазной реакции ведет к накоплению цитруллина.
Все нарушения орнитинового цикла приводят к слабоумию (напр., аргининосукцинатное слабоумие).
5.2. Нарушение выделения продуктов белкового обмена. Напр., цистиноз – нарушение реабсорбции АК (особенно цистина и цистеина) – цистинурия (в 20-30 раз ! ).
1970 г. – американский ученый Тёмин открыл фермент ревертазу (обратную транскриптазу), которая катализирует синтез РНК → кДНК (комплементарная ДНК, не содержащая интронов).
Генная инженерия – это искусственное создание активных генетических структур (рекомбинантных ДНК). Первая работа – 1972 г. – амер. Пол Берт.
Предпосылки генной инженерии
1) изучение (в деталях) матричных биосинтезов;
2) установление возможности обмена между двумя молекулами ДНК (т.е. рекомбинанции);
3) открытие ферментов рестриктаз (1970), разрезающих ДНК в определенных участках с образованием фрагментов с "липкими концами";
4) открытие ферментов ревертаз (1970);
5) обнаружение маленьких кольцевых ДНК в плазмидах.
Основные этапы генной инженерии:
1. получение необходимого гена:
а) с помощью рестриктаз "нарезается" ДНК, затем выделяется нужный фрагмент;
б) с помощью ревертаз по имеющейся мРНК синтезируется комплементарная ДНК (кДНК).
Читайте также: