Какая температура является оптимальной для культивирования пневмококка

Глава 15. Стрептококки

К роду Streptococcus относятся: Streptococcus pyogenes (гемолитический) и Streptococcus pneumoniae (пневмококк). Впервые стрептококки были обнаружены Бильротом (1874), Л. Пастером (1879). Изучены они были Э. Розенбахом (1884).

Морфология. Стрептококки - это кокки, имеющие шаровидную форму. Диаметр каждого кокка в среднем 0,6-1 мкм, однако для них характерен полиморфизм: встречаются мелкие и крупные кокки, строго шаровидные и овальные. Стрептококки располагаются цепочкой, что является результатом деления их в одной плоскости. Длина цепочек разная. На плотной питательной среде цепочки обычно короткие, на жидких - длинные. Стрептококки неподвижны, не имеют спор (см. рис. 4) Свежевыделенные культуры иногда образуют капсулу. На ультратонких срезах видна микрокапсула, под ней расположена трехслойная клеточная стенка и трехслойная цитоплазматическая мембрана. Грамположительны.

Культивирование. Стрептококки - факультативные анаэробы. Растут при температуре 37° С и рН среды 7,6-7,8. Оптимальными средами для их выращивания являются среды, содержащие кровь или сыворотку крови. На плотных питательных средах колонии стрептококков мелкие, плоские, мутные, сероватого цвета. На агаре с кровью некоторые разновидности стрептококков образуют гемолиз. β-Гемолитические стрептококки образуют четкую зону гемолиза, α-гемолитические стрептококки образуют небольшую зеленоватую зону (результат перехода гемоглобина в метгемоглобин). Встречаются стрептококки, не дающие гемолиза.

На сахарном бульоне стрептококки растут с образованием пристеночного и придонного мелкозернистого осадка, бульон при этом остается прозрачным.

Ферментативные свойства. Стрептококки обладают сахаролитическими свойствами. Они расщепляют глюкозу, лактозу, сахарозу, маннит (не всегда) и мальтозу с образованием кислоты. Протеолитические свойства у них слабо выражены. Они свертывают молоко, желатин не разжижают.

Токсинообразование. Стрептококки образуют ряд экзотоксинов: 1) стрептолизины - разрушают эритроциты (О-стрептолизин обладает кардиотоксическим действием); 2) лейкоцидин - разрушает лейкоциты (образуется высоковирулентными штаммами); 3) эритрогенный (скарлатинозный) токсин - обусловливает клиническую картину скарлатины - интоксикацию, сосудистые реакции, сыпь и пр. Синтез эритрогенного токсина детерминирован профагом; 4) цитотоксины - обладают способностью вызывать гломерулонефрит.

Антигенная структура и классификация. У стрептококков обнаружены различные антигены. В цитоплазме клетки содержится видовой нуклеопротеидной природы антиген - единый для всех стрептококков. На поверхности клеточной стенки расположены протеиновые типовые антигены. В клеточной стенке стрептококков обнаружен полисахаридный групповой антиген.

По составу полисахаридной группоспецифической фракции антигена все стрептококки делятся на группы, обозначаемые большими латинскими буквами А, В, С, D и т. д. до S. Кроме групп, стрептококки разделены на серологические типы, которые обозначаются арабскими цифрами.

Группа А включает 70 типов. В эту группу входит большинство стрептококков, вызывающих различные заболевания у человека. Группа В включает в основном условно-патогенные для человека стрептококки. Группа С включает патогенные для человека и животных стрептококки. Группа D состоит из непатогенных для человека стрептококков, однако в эту группу входят энтерококки, которые являются обитателями кишечного тракта человека и животных. Попадая в другие органы, они обусловливают воспалительные процессы: холециститы, пиелиты и др. Таким образом, их можно отнести к условно-патогенным микробам.

Принадлежность выделенных культур к одной из серологических групп определяют с помощью реакции преципитации с групповыми сыворотками. Для определения серологических типов используют реакцию агглютинации с типоспецифическими сыворотками.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Стрептококки довольно устойчивы в окружающей среде. При температуре 60° С погибают через 30 мин.

В высушенном гное и мокроте они сохраняются месяцами. Обычные концентрации дезинфицирующих веществ губят их через 15-20 мин. Энтерококки значительно устойчивее, дезинфицирующие растворы убивают их только через 50-60 мин.

Восприимчивость животных. К патогенным стрептококкам чувствителен рогатый скот, лошади, собаки, птицы. Из лабораторных животных чувствительны кролики и белые мыши. Однако стрептококки, патогенные для человека, не всегда патогенны для экспериментальных животных.

Источники инфекции. Люди (больные и носители), реже животные или инфицированные продукты.

Пути передачи. Воздушно-капельный и воздушно-пылевой, иногда пищевой, возможен контактно-бытовой.

Заболевания могут возникать в результате экзогенного заражения, а также эндогенно - при активации условно-патогенных стрептококков, обитающих на слизистых оболочках зева, носоглотки, влагалища. Снижение сопротивляемости организма (охлаждение, голодание, переутомление и пр.) может привести к возникновению аутоинфекций.

Большое значение в патогенезе стрептококковых инфекций имеет предварительная сенсибилизация - как следствие ранее перенесенного заболевания стрептококковой этиологии.

При проникновении в кровяное русло стрептококки обусловливают тяжело протекающий септический процесс.

Заболевания у человека чаще вызывают β-гемолитические стрептококки серологической группы А. Они продуцируют ферменты патогенности: гиалуронидазу, фибринолизин (стрептокиназу), дезоксирибонуклеазу и др. Кроме того, у стрептококков обнаруживают капсулу, М-протеин, обладающие антифагоцитарными свойствами.

Стрептококки вызывают у человека различные острые и хронически протекающие инфекции, как с образованием гноя, так и не нагноительные, различающиеся по клинической картине и патогенезу. Нагноительные - флегмоны, абсцессы, раневые инфекции, ненагноительные - острые инфекции верхних дыхательных путей, рожистое воспаление, скарлатина, ревматизм и др.

Стрептококки часто вызывают вторичные инфекции при гриппе, кори, коклюше и других заболеваниях и нередко осложняют раневые инфекции.

Иммунитет. По характеру иммунитет - антитоксический и антибактериальный. Постинфекционный антимикробный иммунитет малонапряженный. Это объясняется слабой иммуногенностью стрептококков и большим количеством сероваров, не дающих перекрестного иммунитета. Кроме этого, при стрептококковых заболеваниях наблюдается аллергизация организма, чем объясняют склонность к рецидивам.

Профилактика. Сводится к санитарно-гигиеническим мероприятиям, укреплению общей резистентности организма. Специфическая профилактика не разработана.

Лечение. Применяют антибиотики. Чаще используют пенициллин, к которому стрептококки не приобрели устойчивости, а также эритромицин и тетрациклин.

Значение стрептококка в этиологии ревмокардита. Патогенез ревмокардитов изучен недостаточно. Но в пользу роли стрептококка в развитии этого заболевания говорит ряд фактов:

1. У больных ревмокардитом из зева высевают В-гемолитический стрептококк.

2. Ревматизм часто возникает после перенесенной ангины, тонзиллитов, фарингитов, сенсибилизирующих организм.

3. В сыворотке крови больных обнаруживают антистрептолизин, антистрептогиалуронидазу - антитела к стрептококковым ферментам, токсинам.

4. Косвенным подтверждением роли стрептококка является успешное лечение пенициллином.

В последнее время в возникновении хронических форм ревмокардита придают значение L-формам стрептококка.

Профилактика обострений ревмокардита сводится к предупреждению стрептококковых заболеваний (например, весной и осенью проводят профилактический курс введения пенициллина). Лечение сводится к применению антибактериальных препаратов - пенициллина.

Значение стрептококка в этиологии скарлатины. Г. Н. Габричевский (1902) впервые высказал предположение о том, что гемолитический стрептококк является возбудителем скарлатины. Но так как стрептококки, выделяемые при других заболеваниях, не отличались от возбудителей скарлатины, то это мнение не всеми разделялось. В настоящее время установлено, что скарлатину вызывают стрептококки группы А, вырабатывающие эритрогенный токсин.

У переболевших возникает иммунитет - стойкий, антитоксический. Его напряженность определяют постановкой реакции Дика - внутрикожным введением эритрогенного токсина. У не болевших вокруг места введения возникают гиперемия и отек, что характеризуется как положительная реакция (отсутствие антитоксина в сыворотке крови). У переболевших такая реакция отсутствует, так как образовавшийся у них антитоксин нейтрализует эритрогенный токсин.

Профилактика. Изоляция, госпитализация. Контактным, ослабленным детям вводят гамма-глобулин. Специфическая профилактика не разработана.

Лечение. Используют пенициллин, тетрациклин. В тяжелых случаях вводят антитоксическую сыворотку.

Цель исследования: выявление стрептококка и определение его серовара.

1. Слизь из зева (ангина, скарлатина).

2. Соскоб с пораженного участка кожи (рожа, стрептодермия).

5. Кровь (подозрение на сепсис; эндокардит).

Способы сбора материала

Современные подходы к повышению элективных свойств питательных сред для культивирования пневмококков

Л.И. Железова, А.С. Кветная

В ФГБУ НИИДИ ФМБА России разработан способ приготовления питательной среды, основанный на замене нативной сыворотки животного стандартным препаратом – лецитином, производным холина. Добавление лецитина к питательному бульону в пределах 0,1 – 0,01 г/л оказывало стимулирующий эффект на размножение пневмококков, стабилизацию популяции in vitro. Четырех-пятикратное пассирование штамма на данной среде (в отличие от широко используемого 20% сывороточного бульона) приводило к усилению капсулообразования, повышению вирулентности и выраженной ß-гемолитической активности.

Ключевые слова : пневмококк, пневмококковые инфекции, диагностика, лецитин.

Заболевания, вызываемые пневмококком, являются серьезной проблемой здравоохранения во всем мире в связи с повсеместным распространением, разнообразием клинических форм (менингит, пневмония, сепсис, отит, синусит и др.), развитием инвазивных форм, нередко с осложненным течением (20-40%%) и высокой частотой формирования бактерионосительства (до 60-70%%) [1, 2, 3, 4, 5]. Пневмококковая инфекция (ПИ) признается ВОЗ ведущей причиной заболеваемости и смертности во всех регионах мира. Особенно актуальна проблема ПИ среди детей первых лет жизни, пожилых людей и лиц с хроническими болезнями. Наибольшая частота заболеваемости приходится на детей первых 2 лет жизни и пожилых людей [1,2,3,4,5]. Пневмококк – это условно патогенный микроорганизм, колонизирующий слизистые оболочки верхних дыхательных путей его колонизация сдерживается механизмами местной иммунной защиты. Морфологически Streptococcus pneumonia представлен как инкапсулированный грамположительный диплококк, окруженный полисахаридной капсулой – главным фактором патогенности и вирулентности микроорганизма, основанный на способности ослаблять фагоцитоз клеток пневмококка [6,7,8]. Разнообразие клинических форм пневмококковых инфекций (ПИ) и высокая частота носительства в детских дошкольных учреждениях объясняется неоднозночной восприимчивостью к развитию генерализованных форм ПИ, так и неодинаковой способностью разных штаммов возбудителя колонизировать слизистые и инвазироваться во внутреннюю среду организма. В этой связи значимость приобретают вопросы, связанные с изучением физиологических свойств пневмококка. Установлено, что пневмококк отличается высокой прихотливостью к условиям культивирования. Он требует для своего развития максимально обогащенных искусственных питательных сред с содержанием большого набора аминокислот. Однако, основной питательной потребностью пневмококка, как известно, является холин. Добавление к жидким или плотным питательным основам 10-15% нормальной лошадиной сыворотки обеспечивает в той или иной степени его потребность в холине. Развитие пневмококка на плотных питательных средах стимулируется повышенным содержанием СО₂ в атмосфере, поэтому пневмококк относится к факультативным анаэробам, так как не имеет цитохрома и может утилизировать кислород атмосферы при помощи энзиматической системы флавопротеина. Необходимо заметить, что около 10% штаммов вообще не развивается без избытка углекислоты. В результате дыхания образуется перекись водорода, которую микроорганизм не в состоянии обезвредить, так как не содержит каталазы. Поэтому в состав питательных сред для культивирования пневмококка включают кровь (эритроциты), субстракт, содержащий этот фермент. Предпочтительным для пневмококка являются среды с пониженным парциальным давлением кислорода (бульон, заполняющий большую часть пробирки, полужидкий агар, тиогликолевые среды), на которых он может развиваться и без добавления крови, источника каталазы. Оптимум для культивирования пневмококка — рН 7,6 и 35-37 0 С, но рост возможен в пределах рН 7,0-7,8 и при температурных границах роста — 25-42 0 С [5, 6, 7].

Учитывая биологическую потребность пневмококка в холине, изучение эффективности действия препарата фосфотидилхолина (лецитина) на биологические свойства пневмококка с использованием питательной среды с лецитином явилось целью нашего исследования.

II . Цель исследования

Разработать и изучить эффективность питательной среды с фосфотидилхолином (лецитином) для выделения и культивирования Streptococcus pneumoniae .

Таким образом, постоянный поиск путей совершенствования питательных сред для выделения и культивирования пневмококка обусловлен высокой прихотливостью этого микроорганизма к условиям культивирования. Впервые разработанная в НИИДИ (Санкт-Петербург, Россия) питательная среда на основе бульона Хоттингера (аминный азот, pH 7,2-7,4) с добавлением лецитина в пределах от 0,1 до 0,01 г/л обладает высокими элективными свойствами по отношению к пневмококку и может использоваться, во- первых - для накопления чистых культур пневмококка, свободных от балластных белков крови, во-вторых - для эффективного выделения пневмококка при исследовании материала из закрытых полостей (ЦСЖ, отделяемого ушей, плевральной жидкости и крови). Полученные результаты позволяют считать лецитин поставщиком холина – основного структурного компонента тейхоевой (С-карбогидрат) и липотейхоевой кислот, составляющих клеточную стенку пневмококка. Потребность пневмококка в холине, хотя и не имеет непосредственного отношения к детерминантам патогенности, однако, видимо, существенна для экспрессии вирулентности пневмококка в связи с обеспечением функции питания .

1. CDC. Preventing Pneumococcal Disease Among Infants and Jung Children. MMWR-2000.-V 49. - № RR- 9.- H.1-24.

2. Козлов Р.С. Пневмококки: прошлое, настоящее и будущее. Смоленск: Смоленская государственная медицинская академия, 2005. - 128 с.

4. Таточенко, В.К. Пневмококковая инфекция: современный взгляд на проблему и профилактику / В.К.Таточенко // Вопросы современной педиатрии. – 2007.- Т. 5. - № 1. – С. 107-112.

5. Ряпис Л.А. Проблема пневмококковых инфекций в России / Л.А. Ряпис, Н.И. Брико //Эпидемиология и инфекционные болезни. 2010.- № 1.- С.4-8.

7. Выделение, идентификация и определение чувствительности кантибиотикам Streptococcus pneumonia / Л.С.Страчунский, О.И.Кречикова, Р.С.Козлов, Т.М.Богданович, О.У.Стецюк, М.М.Суворов, Л.К.Катосова, Л.А.Вишнякова, М.Е.Фаустова // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2000. - Т.2, № 1. С.88-98.

9. Кветная, А.С. Экспериментальное обоснование эффективности фосфотидилхолина (лецитина) на физиологию пневмококка / А.С. Кветная, Л.И. Железова // Журн. Медицинский алфавит. Эпидемиология и гигиена. – 2013.- № 1.- С. 18-21.

Сведения об авторах:

Железова Людмила Ильинична, кандидат медицинских наук,

ст.н.с. отдела микроэкологии человека

Кветная Ася Степановна, доктор медицинских наук, профессор,

Таксономия.Семейство Streptococcaceae, род Streptococcus, вид St. pneumoniae.

Пневмококки впервые описаны Р. Кохом (1871)

Морфология. Пневмококки – это диплококки, у которых стороны клеток, обращенные друг к другу, уплощены, а противоположные стороны вытянуты, поэтому они имеют ланцетовидную форму напоминающую пламя свечи. Размер пневмококков 0,75-0,5 х 0,5-1 мкм, располагаются они парами, в мокроте и гное обнаруживаются единичные кокки или короткие цепочки (4). В жидких питательных средах часто образуют короткие цепочки, приобретая сходство со стрептококками. Пневмококки неподвижны, не имеют спор, в организме человека и животных образуют капсулу, окружающую оба кокка. В капсуле содержится термоустойчивое вещество антифагин. При росте на искусственных питательных средах пневмококки утрачивают способность к капсулообразованию. Пневмококки грамположительны. В старых культурах встречаются грамотрицательные бактерии.

Культивирование. Пневмококки – факультативные анаэробы. Растут при температуре 36-37 о С и рН среды 7,2-7,4. Рост улучшается при повышенном содержании СО₂, анаэробные условия также усиливают рост пневмококка. Они требовательны к средам, так как не могут синтезировать многие аминокислоты, поэтому растут только на средах с добавлением нативного белка. На агаре с сывороткой образуют мелкие, круглые, нежные, довольно прозрачные колонии, поначалу куполообразные, а при старении – с плоским верхом (центром) и приподнятыми краями. На агаре с кровью вырастают влажные колонии зеленовато-серого цвета, окруженные зеленой зоной, что является результатом перехода гемоглобина в метгемоглобин (α-гемолиз, но он очень сильный и его иногда принимают за β-гемолиз). Пневмококки хорошо растут в бульоне с добавлением 0,2% глюкозы и в бульоне с сывороткой. Рост в жидких средах характеризуется диффузным помутнением и пылевидным осадком на дне. Основную часть энергии пневмококк получает при ферментации глюкозы, при этом образуется большое количество молочной кислоты, которая угнетает рост пневмококка. Поэтому при культивировании пневмококка в сахарном бульоне нужно периодически (через 6 часов после посева) нейтрализовать бульонную культуру щелочью (1N раствором). При старении у пневмококков появляется тенденция к спонтанному лизису (аутолиз – была колония и нет ее, остается только зона гемолиза), который усиливают ПАВ.

Ферментативные свойства. Пневмококки обладают довольно выраженной сахаролитической активностью. Они расщепляют: лактозу, глюкозу, сахарозу, мальтозу, инулин с образованием кислоты, но не ферментируют маннит. Протеолитические свойства у них выражены слабо: молоко они свертывают, желатин не разжижают, индол не образуют. Пневмококки растворяются в 10% бычьей желчи в течение нескольких минут или при добавлении 2% дезоксихолата натрия, легко лизируются ПАВами. Расщепление инулина, растворение в желчи, чувствительность к оптохину (гидрохлорид этилгидрокупреина) являются важными диагностическими признаками, используемыми для дифференциации пневмококка от зеленящего стрептококка.

Токсинообразование и факторы патогенности. Пневмококки образуют эндотоксин, гемолизин, лейкоцидин. Вирулентность пневмококков связана также с наличием в капсуле антифагина. Пневмококки продуцируют гиалуронидазу, фибринолизин и др.

Антигенная структура и классификация. У пневмококков отсутствует полисахаридный антиген в клеточной стенке, поэтому они относятся к негруппируемым стрептококкам. В цитоплазме пневмококков имеется общий для всей группы протеиновый антиген, а в капсуле – полисахаридный антиген. По полисахаридному антигену все пневмококки разделяют на 84 серовара. Среди патогенных для человека наиболее часто встречаются I, II, III серовары. У взрослых до 80% приходится на 1-8 и 18 типы, которые дают более половины летальных сходов при пневмококковой бактериемии, а детей – 6, 14, 19, 23. Любая популяция пневмококка содержит небольшое количество микроорганизмов, которые не продуцируют капсульный полисахарид и часть колоний может быть в R-форме (3-5%).

Устойчивость к факторам окружающей среды. Пневмококки относятся к группе нестойких микроорганизмов. Температура 60 о С губит через 3-5 мин. К низким температурам и высушиванию они довольно устойчивы. В высушенной мокроте сохраняют жизнеспособность до 2 мес. На питательной среде они сохраняются не более 5-6 дней. Поэтому при культивировании необходимо делать пересевы через каждые 2-3 дня. Обычные растворы дезинфицирующих веществ губят их через несколько минут. Устойчивы к гентамицину и мономицину.

Восприимчивость животных. Естественным хозяином пневмококков является человек. Однако пневмококки могут вызвать заболевания у телят, ягнят, поросят, собак и обезьян. Из экспериментальных животных к пневмококку высокочувствительны белые мыши.

Источники инфекции. Больной человек и бактерионоситель (20-40%, до 70% людей являются носителями вирулентных пневмококков).

Пути передачи. Воздушно-капельный путь, может быть воздушно-пылевой.

Входные ворота. Слизистая оболочка верхних дыхательных путей, глаз и уха. Слизистая оболочка человека в норме обладает естественной резистентностью к пневмококку. Снижению ее способствуют патологические изменения дыхательных путей, другие инфекции (вирусные), патологическое скопление слизи (при аллергических заболеваний), закупорка бронхов (при ателектазе), повреждении дыхательных путей раздражающими веществами, алкогольная или лекарственная интоксикация, сосудистые нарушения (отек легких, сердечная недостаточность), нарушение питания, гипохромная анемия.

Заболевания у человека. Пневмококки могут вызвать гнойно-воспалительные заболевания разной локализации. Специфическими для пневмококков являются:

1. Крупозная пневмония

2. Ползучая язва роговицы

Наиболее частым заболеванием является крупозная пневмония, захватывающая одну, реже две или три доли легкого. Заболевание протекает остро, сопровождается высокой температурой, кашлем. Заканчивается обычно критически. Пневмококки-лидеры в этиологии острых пневмоний, эмпиемы легких, могут вызывать синуситы, менингиты и другие заболевания, редко эндокардиты.

Иммунитет. После перенесенного заболевания остается нестойкий иммунитет, так как пневмония характеризуется рецидивами.

Профилактика. Сводится к санитарно-профилактическим мероприятиям. Специфическая профилактика не разработана.

Лечение.Используют антибиотики – пенициллин, тетрациклин и др.

Вопросы для самоконтроля:

1. Как окрашиваются по Граму стрептококки и пневмококки?

2. К какому роду они относятся?

3. Как располагаются в мазках стрептококки?

4. Что по форме напоминают пневмококки?

5. Как располагаются пневмококки в мазках?

6. Подвижны ли стрептококки и пневмококки?

7. При каких условиях пневмококк образует капсулу?

8. Какова роль капсулы у пневмококка?

9. За счет содержания какого вещества в капсуле пневмококка он защищен от фагоцитоза?

10. Требовательны ли стрептококки и пневмококки к питательным средам?

11. Растут ли стрептококки на простых питательных средах?

12. Какие среды используют для культивирования стрептококка и пневмококка?

13. Какие 3 группы стрептококков различают в зависимости от их гемолитической активности?

14. Каков характер роста стрептококка на сахарном или сывороточном бульоне?

15. Какие токсины выделяют стрептококки?

16. Назовите ферменты патогенности, выделяемые стрептококками.

17. Какое количество серогрупп стрептококков по Ленсфильд Вы знаете?

18. Как они обозначаются?

19. Какая серогруппа включает в себя большинство патогенных для человека стрептококков?

20. Какие заболевания, вызываемые St. pyogenes, относят к нагноительным?

21. Назовите ненагноительные заболевания, вызываемые стрептококками группы А.

22. Почему стрептококки группы В считают бичом родильных отделений?

23. По какому признаку стрептококки объединены в группу негруппируемых стрептококков?

24. Кто может быть источником инфекции при стрептококковых инфекциях?

25. Каковы пути передачи заразного начала при этих заболеваниях?

26. В какую серологическую группу включены пневмококки?

27. Растут ли пневмококки на простых питательных средах?

28. Какие колонии дают пневмококки на кровяном агаре?

29. Какие вещества вызывают и усиливают аутолиз колоний пневмококка?

30. Какие биохимические тесты используют для дифференциации зеленящего стрептококка от пневмококка?

31. Какие заболевания вызывают пневмококки?

32. Какое заболевание наиболее часто вызывают пневмококки?

33. Кто может быть источником пневмококковой инфекции?

34. Каковы пути передачи заразного начала при пневмококковых инфекциях?

35. Какие антибиотики применяются для лечения стрептококковых инфекций?

36. Проведение каких мероприятий предусматривает профилактика стрептококковых инфекций?

а) Питательные основы сред для выделения и культивирования пневмококка. Для выделения и культивирования пневмококка используют среды на высокопитательных основах с обязательным добавлением нормальной сыворотки или крови. В качестве основы применяют триптические перевары белка — мяса, бычьего сердца, сои, казеина, плаценты, кровяных сгустков с конечным содержанием 1,6-1,8 г/л аминного азота. Рекомендовано добавление к основам экстракта кормовых дрожжей (ЭКД).

Из питательных основ лабораторного изготовления чаще всего используют агар на триптическом переваре мяса по Хоттингеру. Специально для пневмококка разработан рецепт питательного агара ВНИИП.

б) Питательный агар ВНИИП. Из питательных основ лабораторного изготовления чаще всего используют агар на триптическом переваре мяса. Специально для пневмококков разработан рецепт питательного агара ВНИИП, основа которого содержит:

70-75% гидролизата мяса по Хоттингеру или казеина (1,8-2,0 г/л аминного азота);
20-25% гидролизата бычьих сердец (1,4-1,6 г/л аминного азота);
1,7-2,0% агара;
pH 7,6.

Стерилизация при 112°С 20 мин. Перед употреблением к расплавленной и остуженной до 45°С среде асептично добавляют 0,5% стерильного раствора ЭКД (вместе с сывороткой или кровью).

в) Кровяной агар, неселективный и селективный. К расплавленной и остуженной до 45°С питательной агаровой основе для пневмококка добавляют 5,0-7,0% свежей дефибринированной крови барана, лошади или кролика. Среду разливают в чашки Петри. Цвет готовой среды — ярко-красный; среда непрозрачна.

Для облегчения выделения пневмококка из полимикробного материала (мокрота — 1:10, бронхиальные смывы, отделяемое среднего уха, слизь из носоглотки) с целью подавления посторонней флоры на участок засеянного кровяного агара стерильным пинцетом накладывают стандартный диск с антибиотиками — мономицином или гентамицином. После инкубации в термостате через 22-24 ч вокруг диска вырастают преимущественно колонии пневмококка.

Можно приготовить селективный кровяной агар с гентамицином. К расплавленной и остуженной до 45°С питательной агаровой основе для пневмококка добавляют 5,0-7,0% дефибринированной крови и раствор гентамицина из расчета создания его конечной концентрации в среде 5 мкг/мл.

г) Сывороточный агар. Используется не только для посевов стерильных в норме жидкостей (СМЖ, плевральная, асцитическая, синовиальная и т.д.), но и является основной средой для культивирования и изучения выделенных чистых культур пневмококка. К расплавленному и остуженному до 45°С питательному агару для пневмококка добавляют 20% нормальной сыворотки лошади или крупного рогатого скота, стерильной или с консервантом хлороформом. Смесь перемешивают и разливают в чашки Петри или в пробирки по 3,0-3,5 мл для получения скошенного агара. Среда полупрозрачна, имеет кремово-желтоватый цвет.

Чашки с кровяным и сывороточным агарами можно сохранять в холодильнике не более 2 сут.; пробирки со скошенным сывороточным агаром — не более 5 сут.

д) Тесты для дифференциации пневмококка и сходных с ним α-гемолитических стрептококков и энтерококков:

2. Желчный тест. Для постановки теста используют желчь крупного рогатого скота без консервантов (лучше взятую стерильно на бойне) или свежевзятую желчь кролика.

Метод диска. На 20-22-часовую испытуемую культуру, выросшую в результате густого посева газоном на кровяном агаре, накладывают стерильный диск фильтровальной бумаги (диаметром 1,0 см), свежепропитанный 20%-ным раствором желчи. Чашку снова помещают в термостат на 2-3 ч. По истечении этого времени вокруг диска наблюдается зона (1-2 мм) полного исчезновения колоний пневмококка; рост колоний других стрептококков и энтерококков не нарушается.

Желчный бульон. В пробирку с 3,0 мл мясопептонного бульона с 10% желчи добавляют 1,0 мл взвеси (или бульонной культуры) испытуемого штамма; смесь помещают в термостат на 1 ч. Для контроля эту же взвесь испытуемой культуры вносят в другую пробирку с бульоном, но без желчи. Если через 1 ч в опытной пробирке заметно просветление (по сравнению с контролем), то тест положителен, т.е. испытуемая культура чувствительна к желчи. При нечетко выраженном результате обе пробирки могут быть оставлены на одни сутки при комнатной температуре.

Желчь в бульоне может быть заменена дезоксихолатом натрия в конечной концентрации 10%.

3. Термическая проба. Взвесь суточной испытуемой 24-часовой культуры в изотоническом растворе натрия хлорида прогревают в водяной бане при 60°С 30 мин. После остывания при комнатной температуре из прогретой взвеси делают высев на кровяной (или сывороточный) агар для пневмококка. Для контроля делают высев из непрогретой взвеси. Если через 1 сут. инкубации высев из прогретой взвеси оказался положительным, как и в контроле, то испытуемая культура не является пневмококком.

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 25.2.2020

Пневмококки впервые описаны Р. Кохом (1871).

Морфология. Пневмококки - это диплококки, у которых стороны клеток, обращенные друг к другу, уплощены, а противоположные стороны вытянуты, поэтому они имеют ланцетовидную форму, напоминающую пламя свечи (см. рис. 4). Размер пневмококков 0,75-0,5 × 0,5-1 мкм, располагаются они парами. В жидких питательных средах часто образуют короткие цепочки, приобретая сходство со стрептококками. Превмококки неподвижны, не имеют спор, в организме образуют капсулу, окружающую оба кокка. В капсуле содержится термоустойчивое вещество антифагин (защищающий пневмококк от фагоцитоза и действия антител). При росте на искусственных питательных средах пневмококки утрачивают капсулу. Пневмококки грамположительны. В старых культурах встречаются грамотрицательные бактерии.

Культивирование. Пневмококки - факультативные анаэробы. Растут при температуре 36-37° С и рН среды 7,2-7,4. Они требовательны к средам, так как не могут синтезировать многие аминокислоты, поэтому растут только на средах с добавлением нативного белка (крови или сыворотки). На агаре с сывороткой образуют мелкие, нежные, довольно прозрачные колонии. На агаре с кровью вырастают влажные колонии зеленовато-серого цвета, окруженные зеленой зоной, что является результатом перехода гемоглобина в метгемоглобин. Пневмококки хорошо растут в бульоне с добавлением 0,2% глюкозы и в бульоне с сывороткой. Рост в жидких средах характеризуется диффузным помутнением и пылевидным осадком на дне.

Ферментативные свойства. Пневмококки обладают довольно выраженной сахаролитической активностью. Они расщепляют: лактозу, глюкозу, сахарозу, мальтозу, инулин с образованием кислоты. Не ферментируют маннит. Протеолитические свойства у них выражены слабо: молоко они свертывают, желатин не разжижают, индол не образуют. Пневмококки растворяются в желчи. Расщепление инулина и растворение в желчи является важным диагностическим признаком, отличающим Streptococcus pneumoniae от Streptococcus pyogenes.

Факторы патогенности. Пневмококки продуцируют гиалуронидазу, фибринолизин и др.

Токсинообразование. Пневмококки образуют эндотоксин, гемолизин, лейкоцидин. Вирулентность пневмококков связана также с наличием в капсуле антифагина.

Антигенная структура и классификация. В цитоплазме пневмококков имеется общий для всей группы протеиновый антиген, а в капсуле - полисахаридный антиген. По полисахаридному антигену все пневмококки разделяют на 84 серовара. Среди патогенных для человека наиболее часто встречаются I, II, III серовары.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Пневмококки относятся к группе нестойких микроорганизмов. Температура 60° С губит их через 3-5 мин. К низким температурам и высушиванию они довольно устойчивы. В высушенной мокроте сохраняют жизнеспособность до 2 мес. На питательной среде они сохраняются не более 5-6 дней. Поэтому при культивировании необходимо делать пересевы через каждые 2-3 дня. Обычные растворы дезинфицирующих веществ: 3% фенол, сулема в разведении 1:1000 губят их через несколько минут.

Особенно чувствительны пневмококки к оптохину, который убивает их в разведении 1:100000.

Источники инфекции. Больной человек и бактерионоситель.

Пути передачи. Воздушно-капельный путь, может быть воздушнопылевой.

Входные ворота. Слизистая оболочка верхних дыхательных путей, глаз и уха.

Заболевания у человека. Пневмококки могут вызвать гнойновоспалительные заболевания разной локализации. Специфическими для пневмококков являются:

1) крупозная пневмония; 2) ползучая язва роговицы;

Лечение. Используют антибиотики - пенициллин, тетрациклин и др.

Контрольные вопросы 1. Морфология пневмококков. Культивирование и ферментативные свойства.

2. Какие факторы обусловливают патогенность пневмококков и что защищает пневмококки от фагоцитоза?

3. Что является основными воротами пневмококковой инфекции. Какие заболевания вызывают пневмококки?

Цель исследования: выявление пневмококка.

Материал для исследования

1. Мокрота (пневмония).

2. Слизь из зева (ангина).

3. Отделяемое из язвы (ползучая язва роговицы).

4. Выделение из уха (отит).

6. Плевральный пунктат (плеврит).

7. Кровь (подозрение на сепсис).

Способы сбора материала

Способы сбора материала

1 (Лучше брать утреннюю мокроту (при специфической пневмонии мокрота имеет ржавый цвет).)

Основные методы исследования

Ход исследования

Первый день исследования

Первый день исследования

Биологическая проба. Немного (3-5 мл мокроты) эмульгируют в стерильном бульоне, 0,5 мл этой смеси вводят внутрибрюшинно белой мыши. Через 6-8 ч у мыши отмечаются признаки заболевания. В это время пневмококк уже можно обнаружить в экссудате брюшной полости. Экссудат берут стерильным шприцем. Из него делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Для выделения чистой культуры экссудат засевают на агар с сывороткой. Если мышь погибает или заболевает, делают посев крови из сердца на агар с сывороткой крови для выделения чистой культуры. Посевы ставят в термостат.

Ускоренный метод определения типа пневмококка (реакция микроагглютинации). 4 капли экссудата из брюшной полости зараженной мыши наносят на предметное стекло. К первой капле прибавляют агглютинирующую сыворотку I типа, ко второй - сыворотку II типа, к третьей - III типа, к четвертой - изотонический раствор натрия хлорида (контроль).

Сыворотки I и II типа предварительно разводят в соотношении 1:10, а сыворотку III типа - 1:5. Все капли размешивают, высушивают, фиксируют и окрашивают разведенным фуксином. При положительном результате в одной из капель отмечается скучивание микробов (агглютинация).

Второй день исследования

Посевы вынимают из термостата, просматривают и из подозрительных колоний делают мазки. При наличии в мазках грамположительных ланцетовидных диплококков 2-3 колонии выделяют на скошенный агар с сывороткой для получения чистой культуры. Посевы помещают в термостат. Из бульона делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют.

Третий день исследования Посевы вынимают из термостата. Проверяют чистоту культуры - делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии в выделенной культуре грамположительных ланцетовидных диплококков проводят идентификацию выделенной культуры путем посева:

1) на среды Гисса (лактоза, глюкоза, сахароза, мальтоза) проводят посев обычным способом - уколом в среду;

2) на среду с инулином; 3) на среду с оптохином;

4) ставят пробу с желчью.

Проба на инулин. Исследуемую культуру засевают на питательную среду, содержащую инулин и лакмусовую настойку, и ставят в термостат. Через 1824 ч посевы вынимают из термостата. При наличии пневмококков среда окрашивается в красный цвет (стрептококки консистенцию и цвет среды не меняют).

Определение чувствительности к оптохину. Выделенную культуру засевают на 10% агар с кровью, содержащий оптохин 1:50000. Пневмококки, в отличие от стрептококков, не растут на средах, содержащих оптохин.

Проба с желчью. В агглютинационные пробирки наливают по 1 мл исследуемой бульонной культуры. В одну из них добавляют каплю кроличьей желчи, вторая пробирка служит контролем. Обе пробирки помещают в термостат. Через 18-24 ч наступает лизис пневмококков, который выражается в просветлении мутного бульона. В контроле взвесь остается мутной.

Пробу с желчью можно поставить на плотной питательной среде. Для этого на колонию пневмококков, выросших в чашках с агаром и сывороткой, наносят крупинку сухой желчи - колония растворяется - исчезает.

Четвертый день исследования Производят учет результатов (табл. 26).

Таблица 26. Дифференциация пневмококка от зеленящего стрептококка

Примечание. к - расщепление углеводов с образованием кислоты.

В настоящее время широко используются серологические методы исследования (РСК и РИГА) для определения стрептококковых антител. Определение группы и серовара выделенной культуры производят с помощью флюоресцирующих антител.

Определение вирулентности пневмококка. Суточную бульонную культуру пневмококка разводят 1% пептонной водой от 10 -2 до 10 -8 , 0,5 мл каждого разведения вводят двум белым мышам. Культуру, вызвавшую гибель мышей в разведении 10 -7 , оценивают как вирулентную, в разведении 10 -4 -10 -

6 считают средневирулентной. Культура, не вызвавшая гибель мышей, авирулентна.

1. Какие методы выделения чистой культуры пневмококков Вы знаете?

2. Какое животное наиболее чувствительно к пневмококку?

3. Какие реакции ставят с экссудатом зараженной мыши и с какой целью?

4. От каких представителей гноеродных кокков следует дифференцировать пневмококк и с помощью какой пробы?

5. Как определить вирулентность пневмококков? Задание

Составьте схему исследования мокроты, указав его этапы по дням.

Питательные среды

Агар с сывороткой (см. главу 7).

Бульон с сывороткой (см. главу 7).

Агар с кровью (см. главу 7).

Среды Гисса (сухие).

Среда для пробы с инулином. К 200 мл дистиллированной воды прибавляют 10 мл инактивированной бычьей сыворотки, 18 мл лакмусовой настойки и 3 г инулина. Стерилизуют текучим паром при 100° С 3 дня подряд. Желчный бульон (см. главу 7).

Глава 16. Менингококки

Род Neisseria включает два вида микробов, патогенных для человека: N. meningitidis и N. gonorrhoeae. Neisseria meningitidis были выделены из цереброспинальной жидкости больного Вексельбаумом (1887).

Морфология. Менингококки - это парные кокки, состоящие из двух бобовидных кокков, лежащих вогнутыми сторонами друг к другу, наружные стенки у них выпуклые (см. рис.4). Размер каждого кокка 0,6-0,8 × 1,2-1,5 мкм. Они полиморфны. Менингококки неподвижны, не имеют спор, образуют капсулу. Грамотрицательны. В чистых культурах располагаются тетрадами и в виде отдельных кокков без определенного порядка, а в мазках, приготовленных из спинномозговой жидкости, чаще располагаются попарно. В гнойном материале находятся внутри лейкоцита.

Культивирование. Менингококки - аэробы. Они требовательны к питательным средам, размножаются только на средах, содержащих нативный белок (сыворотку, кровь). Растут при температуре 36-37° С (при 25° С рост прекращается), рН среды 7,4-7,6. Для их размножения необходима влажная среда и повышенное количество углекислоты (фактор, стимулирующий их рост). Посев следует производить на свежеприготовленную среду.

На плотных питательных средах менингококки образуют небольшие 2-3 мм в диаметре, нежные, полупрозрачные, голубоватые, вязкие колонии. В бульоне с сывороткой менингококки дают легкую муть и небольшой осадок. Свежевыделенные штаммы в S-форме. Старые культуры могут диссоциировать, образовывать шероховатые R-формы колоний.

Ферментативные свойства. Биохимически менингококки мало активны. Они расщепляют глюкозу и мальтозу с образованием кислоты. Протеолитические свойства у них не выражены (не створаживают молоко, желатин не разжижают).

Патогенность менингококков обусловливается наличием капсулы, которая препятствует фагоцитозу, пи лей, способствующих прикреплению микроба к поверхности эпителиальных клеток, и образованием ферментов: гиалуронидазы и нейраминидазы.

Токсинообразование. При разрушении бактериальных клеток высвобождается сильный термоустойчивый эндотоксин, который является липополисахаридом клеточной стенки. При заболевании он обнаруживается в крови и в спинномозговой жидкости больных. Тяжесть заболевания часто зависит от количества накопившегося токсина.

Антигенная структура. По полисахаридному (капсульному) антигену менингококки разделяют на серогруппы: А, В, С, D, X, Y U-135 29E (всего девять серогрупп).

Согласно международной классификации основными группами являются А, В и С. Менингококки группы А часто вызывают генерализованные процессы и имеют наибольшее эпидемиологическое значение. Менингококки групп В и С вызывают спорадические заболевания. Остальные серогруппы мало изучены.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Менингококки малоустойчивы. Температура 70° С губит их через 2-3 мин, 55° С - через 5 мин. В отличие от других кокков этой группы они плохо переносят низкую температуру, особенно чувствительны к температурным колебаниям.

Обычные концентрации дезинфицирующих растворов губят их быстро.

Восприимчивость животных. В естественных условиях животные не чувствительны к менингококкам. Но при субдуральном введении менингококков обезьянам можно вызвать у них заболевание.

Внутрибрюшинное заражение морских свинок и белых мышей вызывает их гибель за счет действия эндотоксина.

Источники инфекции. Больной человек и бактерионоситель.

Пути передачи. Основной путь воздушно-капельный.

Заболевания у человека:

3) цереброспинальный эпидемический менингит.

Патогенез. Попав на слизистую оболочку носоглотки, менингококки могут там локализоваться, обусловив носительство или вызвать острый назофарингит. Если они проникают в лимфатические сосуды, кровь и генерализуются, то вызывают глубокие изменения в паренхиматозных органах за счет действия эндотоксина. Развивается менингококкцемия. При проникновении менингококков в мозговые оболочки возникает гнойное воспаление - менингит. При менингококковом менингите спинномозговая жидкость мутная (в отличие от туберкулезного менингита). При спинномозговой пункции жидкость вытекает струей вследствие повышенного внутричерепного давления. Менингеальные явления характеризуются головной болью, ригидностью затылка, рвотой и т. д. Менингитом чаще болеют дети. У взрослых чаще заражение ограничивается носительством или назофарингитом.

Иммунитет. Постинфекционный иммунитет напряженный, он обусловливается опсонинами, комплементсвязывающими и бактериоцидными антителами. От интенсивности образования антител к полисахаридным и белковым антигенам зависит течение заболевания.

Профилактика. Сводится к раннему выявлению носителей, изоляции заболевших назофарингитом. Больные подлежат госпитализации.

Специфическая профилактика. Разработана химическая вакцина, состоящая из полисахаридов серогрупп А и С. Для экстренной профилактики используется иммуноглобулин.

Лечение. Антибактериальные препараты - пенициллин, левомицетин, ампициллин.

Контрольные вопросы

1. Каковы морфологические свойства менингококков?

2. На каких средах выращивают менингококки и какие условия необходимы для их размножения?

3. Какова биохимическая активность менингококков и их устойчивость во внешней среде?

4. Какие заболевания вызывают менингококки?

5. По какому антигену делят менингококки на серогруппы?

Читайте также: