Питательная среда для молочнокислого стрептококка

Глава 15. Стрептококки

К роду Streptococcus относятся: Streptococcus pyogenes (гемолитический) и Streptococcus pneumoniae (пневмококк). Впервые стрептококки были обнаружены Бильротом (1874), Л. Пастером (1879). Изучены они были Э. Розенбахом (1884).

Морфология. Стрептококки - это кокки, имеющие шаровидную форму. Диаметр каждого кокка в среднем 0,6-1 мкм, однако для них характерен полиморфизм: встречаются мелкие и крупные кокки, строго шаровидные и овальные. Стрептококки располагаются цепочкой, что является результатом деления их в одной плоскости. Длина цепочек разная. На плотной питательной среде цепочки обычно короткие, на жидких - длинные. Стрептококки неподвижны, не имеют спор (см. рис. 4) Свежевыделенные культуры иногда образуют капсулу. На ультратонких срезах видна микрокапсула, под ней расположена трехслойная клеточная стенка и трехслойная цитоплазматическая мембрана. Грамположительны.

Культивирование. Стрептококки - факультативные анаэробы. Растут при температуре 37° С и рН среды 7,6-7,8. Оптимальными средами для их выращивания являются среды, содержащие кровь или сыворотку крови. На плотных питательных средах колонии стрептококков мелкие, плоские, мутные, сероватого цвета. На агаре с кровью некоторые разновидности стрептококков образуют гемолиз. β-Гемолитические стрептококки образуют четкую зону гемолиза, α-гемолитические стрептококки образуют небольшую зеленоватую зону (результат перехода гемоглобина в метгемоглобин). Встречаются стрептококки, не дающие гемолиза.

На сахарном бульоне стрептококки растут с образованием пристеночного и придонного мелкозернистого осадка, бульон при этом остается прозрачным.

Ферментативные свойства. Стрептококки обладают сахаролитическими свойствами. Они расщепляют глюкозу, лактозу, сахарозу, маннит (не всегда) и мальтозу с образованием кислоты. Протеолитические свойства у них слабо выражены. Они свертывают молоко, желатин не разжижают.

Токсинообразование. Стрептококки образуют ряд экзотоксинов: 1) стрептолизины - разрушают эритроциты (О-стрептолизин обладает кардиотоксическим действием); 2) лейкоцидин - разрушает лейкоциты (образуется высоковирулентными штаммами); 3) эритрогенный (скарлатинозный) токсин - обусловливает клиническую картину скарлатины - интоксикацию, сосудистые реакции, сыпь и пр. Синтез эритрогенного токсина детерминирован профагом; 4) цитотоксины - обладают способностью вызывать гломерулонефрит.

Антигенная структура и классификация. У стрептококков обнаружены различные антигены. В цитоплазме клетки содержится видовой нуклеопротеидной природы антиген - единый для всех стрептококков. На поверхности клеточной стенки расположены протеиновые типовые антигены. В клеточной стенке стрептококков обнаружен полисахаридный групповой антиген.

По составу полисахаридной группоспецифической фракции антигена все стрептококки делятся на группы, обозначаемые большими латинскими буквами А, В, С, D и т. д. до S. Кроме групп, стрептококки разделены на серологические типы, которые обозначаются арабскими цифрами.

Группа А включает 70 типов. В эту группу входит большинство стрептококков, вызывающих различные заболевания у человека. Группа В включает в основном условно-патогенные для человека стрептококки. Группа С включает патогенные для человека и животных стрептококки. Группа D состоит из непатогенных для человека стрептококков, однако в эту группу входят энтерококки, которые являются обитателями кишечного тракта человека и животных. Попадая в другие органы, они обусловливают воспалительные процессы: холециститы, пиелиты и др. Таким образом, их можно отнести к условно-патогенным микробам.

Принадлежность выделенных культур к одной из серологических групп определяют с помощью реакции преципитации с групповыми сыворотками. Для определения серологических типов используют реакцию агглютинации с типоспецифическими сыворотками.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Стрептококки довольно устойчивы в окружающей среде. При температуре 60° С погибают через 30 мин.

В высушенном гное и мокроте они сохраняются месяцами. Обычные концентрации дезинфицирующих веществ губят их через 15-20 мин. Энтерококки значительно устойчивее, дезинфицирующие растворы убивают их только через 50-60 мин.

Восприимчивость животных. К патогенным стрептококкам чувствителен рогатый скот, лошади, собаки, птицы. Из лабораторных животных чувствительны кролики и белые мыши. Однако стрептококки, патогенные для человека, не всегда патогенны для экспериментальных животных.

Источники инфекции. Люди (больные и носители), реже животные или инфицированные продукты.

Пути передачи. Воздушно-капельный и воздушно-пылевой, иногда пищевой, возможен контактно-бытовой.

Заболевания могут возникать в результате экзогенного заражения, а также эндогенно - при активации условно-патогенных стрептококков, обитающих на слизистых оболочках зева, носоглотки, влагалища. Снижение сопротивляемости организма (охлаждение, голодание, переутомление и пр.) может привести к возникновению аутоинфекций.

Большое значение в патогенезе стрептококковых инфекций имеет предварительная сенсибилизация - как следствие ранее перенесенного заболевания стрептококковой этиологии.

При проникновении в кровяное русло стрептококки обусловливают тяжело протекающий септический процесс.

Заболевания у человека чаще вызывают β-гемолитические стрептококки серологической группы А. Они продуцируют ферменты патогенности: гиалуронидазу, фибринолизин (стрептокиназу), дезоксирибонуклеазу и др. Кроме того, у стрептококков обнаруживают капсулу, М-протеин, обладающие антифагоцитарными свойствами.

Стрептококки вызывают у человека различные острые и хронически протекающие инфекции, как с образованием гноя, так и не нагноительные, различающиеся по клинической картине и патогенезу. Нагноительные - флегмоны, абсцессы, раневые инфекции, ненагноительные - острые инфекции верхних дыхательных путей, рожистое воспаление, скарлатина, ревматизм и др.

Стрептококки часто вызывают вторичные инфекции при гриппе, кори, коклюше и других заболеваниях и нередко осложняют раневые инфекции.

Иммунитет. По характеру иммунитет - антитоксический и антибактериальный. Постинфекционный антимикробный иммунитет малонапряженный. Это объясняется слабой иммуногенностью стрептококков и большим количеством сероваров, не дающих перекрестного иммунитета. Кроме этого, при стрептококковых заболеваниях наблюдается аллергизация организма, чем объясняют склонность к рецидивам.

Профилактика. Сводится к санитарно-гигиеническим мероприятиям, укреплению общей резистентности организма. Специфическая профилактика не разработана.

Лечение. Применяют антибиотики. Чаще используют пенициллин, к которому стрептококки не приобрели устойчивости, а также эритромицин и тетрациклин.

Значение стрептококка в этиологии ревмокардита. Патогенез ревмокардитов изучен недостаточно. Но в пользу роли стрептококка в развитии этого заболевания говорит ряд фактов:

1. У больных ревмокардитом из зева высевают В-гемолитический стрептококк.

2. Ревматизм часто возникает после перенесенной ангины, тонзиллитов, фарингитов, сенсибилизирующих организм.

3. В сыворотке крови больных обнаруживают антистрептолизин, антистрептогиалуронидазу - антитела к стрептококковым ферментам, токсинам.

4. Косвенным подтверждением роли стрептококка является успешное лечение пенициллином.

В последнее время в возникновении хронических форм ревмокардита придают значение L-формам стрептококка.

Профилактика обострений ревмокардита сводится к предупреждению стрептококковых заболеваний (например, весной и осенью проводят профилактический курс введения пенициллина). Лечение сводится к применению антибактериальных препаратов - пенициллина.

Значение стрептококка в этиологии скарлатины. Г. Н. Габричевский (1902) впервые высказал предположение о том, что гемолитический стрептококк является возбудителем скарлатины. Но так как стрептококки, выделяемые при других заболеваниях, не отличались от возбудителей скарлатины, то это мнение не всеми разделялось. В настоящее время установлено, что скарлатину вызывают стрептококки группы А, вырабатывающие эритрогенный токсин.

У переболевших возникает иммунитет - стойкий, антитоксический. Его напряженность определяют постановкой реакции Дика - внутрикожным введением эритрогенного токсина. У не болевших вокруг места введения возникают гиперемия и отек, что характеризуется как положительная реакция (отсутствие антитоксина в сыворотке крови). У переболевших такая реакция отсутствует, так как образовавшийся у них антитоксин нейтрализует эритрогенный токсин.

Профилактика. Изоляция, госпитализация. Контактным, ослабленным детям вводят гамма-глобулин. Специфическая профилактика не разработана.

Лечение. Используют пенициллин, тетрациклин. В тяжелых случаях вводят антитоксическую сыворотку.

Цель исследования: выявление стрептококка и определение его серовара.

1. Слизь из зева (ангина, скарлатина).

2. Соскоб с пораженного участка кожи (рожа, стрептодермия).

5. Кровь (подозрение на сепсис; эндокардит).

Способы сбора материала

Группа компаний "Униконс"

Продвижение и реализация пищевых добавок, антисептиков и другой продукции НПО Альтернатива.

"Бесплатные образцы"

Комплексные пищевые добавки "Униконс".

Для всех отраслей пищевой промышленности!

"Петритест"

Микробиологические экспресс-тесты. Первые результаты уже через 4 часа.

• Вы здесь:
• Библиотека технолога
  
• Микробиология
  
• Микроорганизмы, влияющие на качество мясных и молочных продуктов

Молочнокислые бактерии (стрептококки)

Молочнокислые бактерии в определенных условиях могут вызывать порчу многих пищевых продуктов (мяса, молока, вина, овощей и пр). Они относятся к семейству Lactobacillaceae. По морфологическим признакам их делят на стрептококки и палочки. В каждой группе имеются как гомо-, так и гетероферментативные бактерии. Бактерии из семейства Lactobacillaceae широко распространены в природе: в почве, на растениях, гниющих остатках животного и растительного происхождения, в кишечнике человека и животных, в молочных и мясных продуктах.

Молочнокислые стрептококки

Кмолочнокислым стрептококкамотносят мезофильные стрептококки Streptococcus lactis, Str. cremoris и ароматобразующие Str. diacetilactis, Str. acetoinicus, Str. paracitrovorus (Leuconostoc citrovorum), Str. citrovorus (Leuconostoc citrovorum ); термофильные Str. thermophilus; энтерококки (молочнокислые стрептококки кишечного происхождения) Str. liquefaciens, Str. faecalis, Str. zymogenes, Str. faecium, Str. durans, Str. bovis.

Это грамположительные кокки (рис. 27), образующие короткие или длинные цепочки. Неподвижны, спор и капсул не образуют. Они относятся к факультативно-анаэробным микроорганизмам (микроаэрофилам). Большинство из них не обладают протеолитической активностью, не образуют каталазу. Вызывают расщепление углеводов гомо- или гетероферментативным путем (такое деление связано с количеством получаемых при молочнокислом брожении побочных продуктов — летучих кислот, эфиров, спирта, диацетила и пр.).

Для лучшего выделения молочнокислых стрептококков из объектов внешней среды в питательные среды необходимо добавлять аминокислоты, витамины и другие сложные вещества.

Мезофильные стрептококки

Мезофильные стрептококки. К ним относятся Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris и ароматобразующие стрептококки. Морфологические, культурные и ферментативные свойства этих микроорганизмов одинаковые.

Str. lactis (молочнокислый стрептококк ). Клетки Str. lactis имеют круглую форму, располагаются в виде овальных, попарно соединенных клеток (диплококков) или коротких цепочек. При росте на поверхности твердых питательных сред образует мелкие, росинчатые колонии; глубинные колонии лодочкообразные или в форме чечевицы. Хорошо растут в присутствии глюкозы или лактозы. На гидролизованном агаре с мелом вокруг колоний образуют зоны просветления (в результате выделения молочной кислоты происходит растворение мела). Благоприятной средой для развития стрептококков является гидролизованное молоко. По росту на кровяном агаре относится к гамма-типу. Оптимальная температура роста 30°С. При этой температуре они свертывают молоко за 10—12 ч. Сгусток ровный, плотный, колющейся консистенции, имеет чистый кисломолочный вкус и аромат. Некоторые расы (разновидности) образуют сгусток тягучей консистенции и поэтому непригодны для выработки большинства кисломолочных продуктов. Str. lactis никогда не сбраживают рамнозу, сахарозу, раффинозу. Часто разлагают казеин. Предельная кислотность, создаваемая в молоке при культивдровании Str. lactis, колеблется в пределах НО— 120° Т (иногда 130° Т), однако встречаются и малоактивные штаммы, предельная кислотность которых достигает в молоке 90—100°Т. Некоторые разновидности Str. lactis продуцируют весьма активный антибиотик низин. Отдельные штаммы молочнокислых стрептококков могут вызывать пороки молочных продуктов: тягучесть, горечь (вследствие пептонизации молока) и др.

Str. cremoris (сливочный стрептококк) . Он отличается от Str. lactis тем, что его клетки чаще располагаются в виде цепочек. Форма и величина колоний аналогична форме и величине колоний Str. lactis. Оптимальная температура развития Str. cremoris 20-25°С, максимальная 35—38°С. Через 12 ч в молоке образует прочный сгусток сметанообразной консистенции. Предельная кислотность, образуемая Str. cremoris в молоке, ПО-115°Т. Ферментативные свойства также идентичны. Str. cremoris отличается от Str. lactis по способности сбраживать мальтозу, декстрин, сахарозу. Str. cremoris не растет при 40°С в среде с 4% NaCl при рН 9,2. Str. cremoris не разлагает казеина, иногда и салицина.

Ароматообразующие стрептококки

Ароматообразующие стрептококки. К ним относятся Str. diacetilactis, Str. acetoinicus, Str. paracitrovorus (Leuconostoc citrovorum), Str. citrovorus (Leuconostoc citrovorum). Клетки их несколько мельче, чем у Str. lactis и Str. cremoris; располагаются в мазках, в виде диплококков, одиночных клеток или цепочек различной длины.

При росте на плотных питательных средах ароматобразующие стрептококки образуют сходные со Str. lactis и Str. cremoris круглые или каплевидные колонии; глубинные колонии лодочкообразные. Оптимальная температура развития ароматобразующих бактерий 25-30°С.

Ароматобразующие бактерии выделяют в молоке и молочных продуктах повышенное количество летучих, кислот (уксусная и пропионовая) и ароматических веществ (эфиры, диацетил). Большинство из них содержит фермент цитритазу, поэтому способны сбраживать лимонную кислоту; за эту способность их называют цитроворусами. Для культивирования чистых культур ароматобразующих бактерий рекомендуется делать посев на агар, содержащий лимоннокислый кальций. Вокруг колоний образуются зоны просветления в результате сбраживания лимоннокислого кальция. Колонии других молочнокислых бактерий не имеют зон просветления.

У ароматобразующих бактерийэнергия кислотообразования неодинакова. Так, Str. diacetilactis — наиболее сильный кислотообразователь; его предельная кислотность около 100°Т. Он вызывает образование сгустка в молоке через 16-18 ч, а менее активные штаммы — через 48 ч; Str. paracitrovorus свертывает молоко при оптимальной температуре и кислотности не более 80°Т в течение 2-3 дней. Str. citrovorus не вызывает свертывания молока, так как он слабый кислообразователь. Предельная кислотность, образуемая в молоке Str. acetoinicus, ПО—115°Т.

Термофильные стрептококки

Термофильные стрептококки. К ним относятся Streptococcus thermophilus. Термофильные стрептококки по сравнению с мезофильными лучше развиваются при повышенной температуре. Термофильные стрептококки в отличие от мезофильных сбраживают сахарозу. Поэтому для их выделения из посевного материала к безуглеводной питательной среде добавляют сахарозу. Форма и расположение клеток в мазках идентична морфологии и расположению клеток Str. cremoris. Клетки несколько крупнее, располагаются в виде цепочек разной длины. Но Str. thermophilus имеет и свои особенности (оптимальная температура развития 40-45°С, максимальная 45-50°С).

При росте на твердых питательных средах Str. thermophilus образует округлой формы с зернистой структурой поверхностные и глубинные лодочкообразные, иногда с выростом колонии. При оптимальной температуре развития термофильный стрептококк свертывает молоко за 3,5-6 ч, образуя ровный, прочный сгусток сметанообразной консистенции; предельная кислотность 110-120°Т. Некоторые штаммыстрептококкавыделяют диацетил. Термофильный стрептококк не сбраживает мальтозы, декстрина и салицина; не разлагает казеина.

Энтерококки — молочнокислые стрептококки кишечного происхождения

Многие энтерококки образуют короткие цепочки или располагаются попарно. Клетки имеют округлую или яйцевидную форму. Они могут развиваться как при 10, так и при 45°С. Устойчивы к поваренной соли (6,5%), метиленовой сини и желчи (40%), к щелочной реакции среды (рН 9,6), к пенициллину в концентрации 0,3 ед. в 1 мл, к высокой температуре. Выдерживают нагревание при 65°С в течение 30 мин. Ферментируют большинство углеводов.

Str. liquefaciens (Mammococcus). Имеет некоторое сходство со Str. lactis. Оптимальная температура роста 37°С. Маммококк образует не только молочную кислоту (110-115°Т), но и выделяет фермент типа сычужного, вследствие этого свертывание молока наступает при низкой кислотности 35-40°Т. Сгусток вначале прочный, ровный, затем под действием сычужного фермента стягивается (выделяется значительное количество сыворотки). Сбраживает сорбит и глицерин. Разлагает казеин и разжижает желатин. Молочные продукты при попадании маммококков приобретают горький вкус в результате накопления большого количества пептонов.

Str. faecalis. Располагается в виде диплококков коротких цепочек. Способен ферментировать маннит, сорбит, редко арабинозу; восстанавливает лакмусовое молоко. На агаре с кровью вызывает гемолиз. Гидролизует белки (особенно в сырах, придавая им специфический запах).

Str. zymogenes. По морфологии и культуральным свойствам сходен с Str. liquefaciens. Он частично разлагает казеин. В отличие от других энтерококков вызывает р-гемолиз эритроцитов, поэтому на кровяном агаре вокруг колоний образуются прозрачные зоны. Гемолиз эритроцитов считают признаком патогенности микроорганизма.

Str. faecium. Его свойства аналогичны свойствам Str. faecalis, сбраживает арабинозу, сахарозу, редко сорбит; частично восстанавливает лакмусовое молоко. Не разлагает казеина.

Str. durans (вариант Str. faecium). Сбраживает лактозу, глюкозу, мальтозу. Редко сбраживает сахарозу, салицин, маннит. Не сбраживает инулина, сорбита, раффинозы.

Str. bovis. По своим свойствам, сходен с термофильным стрептококком. Некоторые штаммы этого стрептококка подвижны. Отличаются от других стрептококков большой чувствительностью к поваренной соли, желчи, щелочной среде и метиленовой сини. Не способен расти при 10°С. Лакмусовое молоко не свертывает, вызывает лишь частично его восстановление. Не сбраживает арабинозу, но часто ферментирует ксилозу.

Глюкозо-сывороточный бульон. К свежему стерильному МПБ (рН 7,4-7,6) добавляют 10% нормальной инактивированной сыво­ротки крови лошади и 1% глюкозы. Сыворотку и глюкозу предпо­чтительнее стерилизовать фильтрацией.

Глюкозо-кровяной агар. К расплавленному МПА с температурой около 45°С добавляют 1% глюкозы и 5—10% стерильной дефибринированной крови барана или кролика. Приготовленный агар разли­вают в чашки Петри.

Среда Эдварда (пропись фирмы Oxoid, 1982). В 1 л дистиллирован­ной воды растворяют 10 г пептона, 10 г сухого мясного экстракта, 1 г эскулина, 5 г натрия хлорида, 0,0013 г кристаллвиолета, 0,33 г таллия сульфата и 15 г агара; устанавливают рН 7,4, Стерилизуют при 115° С 20 минут. К охлажденному до 45° С агару добавляют 5% стерильной дефибринированной крови овцы или крупного рогатого скота и разли­вают в чашки Петри. Среда обладает селективными свойствами. Используют для выде­ления S. agalactiae.

Кровяной агар с азидом натрия (пропись фирмы Oxoid, 1982). В 1 л дистиллированной воды растворяют 10 г триптозы, 3 г сухого мясного экстракта, 5 г натрия хлорида, 0,2 г азида натрия, 12 г агара; устанавливают рН 7,2, автоклавируют при 121°С 15 минут. К расплав­ленному агару с температурой 45°С добавляют 5% стерильной крови овцы, перемешивают и разливают в чашки Петри. Среда предназначена для выделения патогенных стрептококков из материалов, контаминированных посторонней микрофлорой. Азид натрия подавляет рост многих грамотрицательных бактерий.

Селективная среда с антибиотиками (пропись фирмы Oxoid, 1982). В расплавленную и охлажденную агаровую среду добавляют 7% дефибринированной крови барана и антибиотики (на 1000 мл среды): налидиксовой кислоты - 7,5 мг, полимиксина В - 17000 ЕД, неомицина (или неомицина сульфата) - 2,12 мг. Каждый антибиотик пред­варительно растворяют в 20 мл стерильной дистиллированной воды, Готовую среду используют в течение 48 ч при хранении в холодиль­нике (4-8°С). На среде ингибируется рост стафилококков, синегнойной палоч­ки, энтеробактерий, клебсиелл и предотвращается роение протея. Если после засева на поверхность среды положить полоски фильт­ровальной бумаги (диски), пропитанные бацитрацином (10 ЕД), то можно дифференцировать стрептококки серогруппы А (чувствитель­ные к бацитрацину) от (3-гемолитических стрептококков других групп, устойчивых к бацитрацину (Streatmer et al., 1962).

Молочная среда с полимиксином по Калине (для энтерококков). К 85 мл расплавленного МПА с температурой 45°С добавляют 1,25 мл 0,01%-ного водного раствора кристаллвиолета, 0,5 мл 10%-ного вод­ного раствора 2,3,5-ТТХ, 15 мл стерильного обезжиренного молока, 20-40 ЕД/мл полимиксина М. Среда, разлитая в чашки Петри, пригод­на для использования в течение 7—10 дней при условии хранения в хо­лодильнике (4°С). Типичные колонии энтерококков имеют округлую форму, ровные края, блестящую поверхность, диаметр 1,5-2 мм, крас­новатую окраску с зоной протеолиза на светло-голубом фоне.

Желчно-кровяной агар Беленького (для энтерококков). К 600 мл 3%-ного расплавленного МПА добавляют 400 мл нативной профиль­трованной желчи. Стерилизуют при 115°С 30 минут. К охлажденному до 45°С агару добавляют 5% дефибринированной крови и разливают по чашкам Петри. На среде растут энтерококки, но не растут гноерод­ные и оральные стрептококки.

Энтерококковая дифференциально-диагностическая среда. К 1000 мл расплавленного МПА, имеющего температуру 45-50°С, перед употреблением добавляют 0,1 г ТТХ (2,3,5-трифенилтетразолийхлорид), 12,5 мл 0,01%-ного водного раствора кристаллвиолета, 0,1 кислоты, 20% обезжиренного молока, 1% глюкозы, 5% стерильной дефибринированной крови. Компоненты перемешива­ют и разливают по чашкам Петри. ТТХ и налидиксовую кислоту предва­рительно растворяют в небольшом количестве МПБ. Колонии S. faecalis вишнево-красного цвета, S. faecium — бесцветные или белого.

Щелочно-полимиксиновая среда Г. П. Калины (для энтерококков). Готовят отдельно три раствора.

Раствор 1: 23 мл МПБ, 1 г глюкозы, 0,5 г натрия хлорида, 2 г дрожжевого экстракта.

Раствор 2: 25 мл дистиллированной воды, 0,53 г Nа₂СО₃.

Раствор 3: 25 мл дистиллированной воды, 0,25 г двухосновного фосфата калия. Смеси стерилизуют раздельно при 112°С 12 минут.

После стерилизации все три раствора смешивают, устанавливают рН 10-10,2, добавляют воды до 100 мл, 1,6%-ного спиртового раство­ра бромтимолового синего, 200 ЕД/мл полимиксина М. Среду раз­ливают по 5 мл в пробирки.

Среда Эндо (фуксин-сульфитный агар с полимиксином и кристаллвиолетом для энтерококков). К расплавленной среде Эндо добавляют 200 ЕД/мл полимиксина М и 1,25 мл 0,01%-ного водного раствора кристаллвиолета на 100 мл среды. Колонии энтерококков ярко-крас­ного цвета.

Желчно-цитратная среда (для энтерококков). К 100 мл МПА до­бавляют 20 мл дрожжевого автолизата, 100 мл желчи, 40 г цитрата натрия. Смесь кипятят на водяной бане, добавляют 0,1 г трифенилтетразолия хлористого и 200 ЕД/мл полимиксина М. Колонии энтеро­кокков розово-красного цвета.

В специальных научно-производственных лабораториях выделяют штаммы молочнокислых микроорганизмов, изучают их свойства, селекционируют, составляют и получают закваски, которые направляют на предприятия молочной промышленности, где вырабатывают производственные закваски.

В цехах по производству заквасок готовят сухой и жидкий бактериальные концентраты, маточные закваски в виде сухих и жидких заквасок, а также получают натуральные и сухие кефирные грибки (зерна).

Сухой бактериальный концентрат в нашей стране чаще вырабатывают трех видов: мезофильных молочнокислых стрептококков, термофильных молочнокислых стрептококков и ацидофильных молочнокислых палочек. Жидкий бактериальный концентрат готовят из мезофильных молочнокислых стрептококков.

Процесс приготовления сухого бактериального концентрата включает следующие основные этапы: выращивание заквасочных микроорганизмов, бактофугирование полученной культуры, высушивание суспензии клеток, фасование бакконцентрата. бактерия стрептококк кисломолочный

Питательной средой для выращивания молочнокислых бактерий является молочная сыворотка с добавлением кукурузного экстракта (или аминокислотно-микроэлементно-витаминного комплекса), буферных солей и стимуляторов роста. В качестве буферных солей используют цитрат натрия или ацетат натрия. Стимуляторами роста молочнокислых бактерий являются сульфат марганца, аскорбиновая кислота и др.

Молочнокислые бактерии различаются по потребности в стимуляторах роста, в связи с этим предложены различные питательные среды для выращивания мезофильных, термофильных молочнокислых стрептококков и ацидофильных палочек.

В Приложении №1 представлены рецептуры питательных сред (на 1000 дм 3 ) для наращивания клеток молочнокислых бактерий различных видов.

При приготовлении среды в сыворотке устанавливают рН 4,5-4,6 (оптимальную для выделения белков), нагревают ее до 95 ?С и выдерживают 60 мин для более полного выделения белков. После этого сыворотку осветляют путем сепарирования.

В осветленную сыворотку добавляют компоненты среды согласно рецептуре, устанавливают оптимальную рН, стерилизуют при 0,05 МПа в течение 60 мин и охлаждают до температуры, оптимальной для роста микроорганизмов.

Стерилизация и охлаждение питательной среды, а также наращивание клеток молочнокислых бактерий осуществляются в ферментере, имеющем мешалку, в котором автоматически регулируются температура и рН на заданном уровне.

В подготовленную стерильную среду, охлажденную до оптимальной температуры развития того или иного вида молочнокислых бактерий, подают закваску в количестве 5-8 % (на сывороточной среде) или 3-5 % (на обезжиренном молоке).

Наращивание клеток мезофильных молочнокислых стрептококков ведут в ферментере при температуре 30 ?С в течение 10-12 ч, термофильных молочнокислых стрептококков и ацидофильных палочек - при 40 °С на протяжении 8-9 ч при автоматическом поддерживании рН. При этом рН культуральной жидкости достигает для стрептококков 6,5-6,8, для ацидофильных палочек 5,7-6,0.

После окончания выращивания культуру охлаждают до 3-8°С и направляют на бактофугирование для получения бактериальной массы.

Отделение клеток от среды осуществляют в конце логарифмической фазы роста, когда в культуральной жидкости (в 1 см 3 ) содержатся сотни миллионов - единицы миллиардов активных клеток. Бактериальную массу из культуральной жидкости выделяют на бактофуге. Для этой цели можно использовать центрифугу и молокоочиститель.

Бактериальная масса после бактофугирования содержит сотни миллиардов клеток в 1 см 3 ; выход бакмассы составляет 0,5-0,8 %. Полученную бактериальную массу смешивают с защитной средой в соотношении 1 : 2 - 1 : 4. В состав защитной среды для мезофильных молочнокислых стрептококков входят: обезжиренное молоко с содержанием 16 % сухих веществ - 30% и 70 % водного раствора, содержащего сахарозу (5%), желатозу (5%), цитрата натрия (5%), глутамата натрия (2%). В состав защитной среды для ацидофильной палочки вместо цитрата натрия вносят 5 % уксуснокислого натрия. Защитная среда для термофильного стрептококка включает 20 % обезжиренного молока и 80 % водного раствора, содержащего по 2,2 % сахарозы, желатозы, лимоннокислого натрия и 1,2 % глутамата натрия.

Желатоза представляет собой желатин после стерилизации под давлением 0,15 МПа в течение 2,5-3,0 ч. После стерилизации желатин теряет способность образовывать гель.

Полученную суспензию клеток молочнокислых бактерий высушивают. Для этого ее разливают на лотки слоем 6-8 мм или фасуют по 2 см 3 во флаконы. Суспензию высушивают в установке для сублимационной сушки сначала при низкой отрицательной температуре --35-(-45)°С, досушивание -- при положительной температуре (40-45 °С). Продолжительность сушки суспензии на лотках 6-12 ч, во флаконах

24-42 ч. Сухой бактериальный концентрат, высушенный на лотках, размельчают и фасуют во флаконы порциями по 1-1,5 г.

Концентрат содержит от 150 до 300 млрд клеток в 1 г. Массовая доля влаги в нем не должна превышать 3,5 %. Допускается наличие посторонней непатогенной микрофлоры не более 10 клеток в 1 г.

Продолжительность свертывания молока при внесении одной порции концентрата на 1 дм 3 молока при оптимальной температуре составляет: у мезофильных стрептококков 4,0-5,5 ч, у термофильных молочнокислых стрептококков 3,0-4,5, а у ацидофильных палочек 2.5-3,5 ч.

Срок хранения концентрата при температуре 3-10 °С 8 мес со дня выработки.

Жидкий бактериальный концентрат мезофильных молочнокислых стрептококков так же как и сухой, применяется при производстве творога и сметаны. Его готовят так же, как и сухой. Приготовление отличается лишь исключением двух операций: замораживания и сушки. Концентрат разливают во флаконы по 5±0,5 см 3 (полпорции) и по 10 ± 0,5 см 3 (порция), укупоривают, охлаждают до температуры +8-(-5) °С и хранят не более двух месяцев со дня выработки. Жидкий бактериальный концентрат содержит не менее 150 млрд. клеток в 1 см 3 . Допускается содержание посторонней непатогенной микрофлоры не более 20 клеток в 1 см 3 .

Кефир -- кисломолочный продукт смешанного брожения, для приготовления которого используются кефирные грибки. Они имеют определенную структуру и ведут себя биологически, как живой саморегулирующийся организм: растут, делятся и обладают наследственностью.

При гистологическом исследовании срезов видны переплетения нитей, которые образуют строму грибка, удерживающую остальную группу микроорганизмов, состоящую из:

• 1) из мезофильных молочнокислых стрептококков (Str. lactis);
• 2) из мезофильных молочнокислых палочек (Beta- и Strepto- bacterium);
• 3) из термофильных молочнокислых палочек (L. casei);
• 4) из молочных дрожжей, прочно связаных со стромой гриба.

Молочнокислые бактерии, гидролизуя лактозу, снабжают

молочные дрожжи кислотой, необходимой им для жизнедеятельности, а дрожжи, вызывая спиртовое брожение, насыщают продукт углекислотой, что придает кефиру особый вкус.

Методика приготовления грибковой кефирной закваски: в пастеризованное и охлажденное до температуры +20°С молоко вносят 5% кефирных зерен, заквашивание происходит в течение 10-12 ч. Затем грибковую закваску процеживают через сито и используют как производственную закваску для приготовления потребительского кефира, у которого определяют вкус, запах и качество сгустка.

Качество закваски регулярно проверяют, определяют активность (скорость сквашивания, кислотность), органолептические качества, наличие посторонней микрофлоры путем просмотра микроскопического препарата в 10 полях зрения микроскопа.

Кефирные грибки (зерна) представляют естественную симбиотическую закваску для кефира. В них входят молочнокислые стрептококки, палочки, дрожжи и уксуснокислые бактерии (приложение № 2).

Процесс получения натуральных кефирных грибков включает подготовку молока, культивирование кефирных грибков, отделение, фасование, укупоривание, маркирование и хранение. Для культивирования кефирных грибков используют обезжиренное молоко, пастеризованное при температуре 92-95 °С в течение 20-30 мин, в которое помещают грибки в соотношении 1:20. Выращивание проводят при температуре 18-22 °С. Ежедневно молоко меняют, т. е. грибки заливают свежими порциями питательной среды. Молоко, в котором культивировались кефирные грибки, представляет собой уже культуральную кефирную закваску, содержащую ту же микрофлору, что и кефирный грибок.

По мере роста грибков 1-2 раза в неделю их отделяют от закваски, фасуют порциями в стерильные флаконы, заливают обезжиренным молоком или сывороткой. Срок хранения кефирных грибков составляет 10 дней при температуре 8-10 °С.

Сухие кефирные грибки получают из натуральных (живых) кефирных грибков путем высушивания в защитной среде, состоящей из молочной сыворотки с добавлением 0,5 % сахара и 0,01 % аскорбиновой кислоты.

Отделенные от культуральной закваски грибки помещают в защитную среду в соотношении 1:20 и выдерживают в ней 5-6 ч при температуре 20-22 °С для наращивания дрожжей, которые являются наиболее чувствительными к замораживанию и высушиванию. После этого грибки отделяют от защитной среды, укладывают на стерильные лотки слоем 8 мм, закрывают стерильной марлей и помещают в морозильный шкаф при температуре -- 20-25 °С на 1,5-2 ч. Грибки сушат в установке сублимационной сушки. Температура в начале сушки 15-20°С, конечная температура досушивания 30-35°С. Продолжительность сушки 8-10 ч.

Сухие кефирные грибки фасуют порциями по 10, 20, 50, 100 г в пакеты из полиэтилен-целлофана и запаивают. Срок хранения кефирных грибков 3 мес при температуре не выше 8 °С. Сухие кефирные грибки содержат не более 4,5 % влаги.

Продолжительность сквашивания молока при соотношении грибка и молока 1 : 40 и температуре 18-22 °С для натуральных грибков составляет 16-18 ч, ддя сухих -- 24-28 ч. Кислотность сгустка 90-110 °Т. В микроскопическом препарате наблюдаются диплококки, короткие цепочки, единичные палочки и клетки дрожжей.

Состав микрофлоры кефирной закваски (производственной и грибковой) определяют методом предельных разведений путем посева различных разведений в стерильное обезжиренное молоко и культивирования их в течение 3 сут. После этого микроскопируют препараты, приготовленные из содержимого пробирок со свернувшимся молоком. На основании полученных результатов составляют числовую характеристику и определяют количество лактококков и лактобактерий по методике, описанной при определении молочнокислых бактерий в молоке.

Ароматобразующие молочнокислые стрептококки выявляют на плотной среде с цитратом кальция при посеве различных разведений закваски. Посевы культивируют при 26 °С в течение 3-5 сут. Затем учитывают колонии, образующие зоны просветления в данной среде.

Дрожжи определяют чашечным методом на сусловом агаре при посеве различных разведений закваски и последующем выращивании при 24 °С в течение 3-5 сут.

Уксуснокислые бактерии определяют методом предельных разведений путем посева разведений в стерильное обезжиренное молоко и термостатирования их при 30 °С в течение 3-5 сут. Учет положительных результатов проводят по желтому кольцу, образующемуся на поверхности свернутого молока.

Требования к закваскам, регламентируемые Санитарными правилами и нормами, представлены в Приложении № 3.

Наличие бактериофага устанавливают посевом закваски в стерильное обезжиренное молоко с добавлением раствора метиленового синего. Если в процессе культивирования после обесцвечивания метиленового синего через 4-5 ч снова наблюдается посинение молока, это указывает на наличие в закваске бактериофага.

Установление причин нарушения процесса сквашивания. Основными причинами нарушения процесса сквашивания является наличие в молоке ингибирующих веществ или бактериофага.

Для выявления причин несквашивания наблюдают за развитием молочнокислых стрептококков в молоке в первые часы после внесения закваски. Если молоко содержит ингибирующие вещества, развитие микроорганизмов закваски не наблюдается с самого момента заквашивания, если же причиной несквашивания является развитие бактериофага, то сначала наблюдается увеличение количества клеток, а через 2-3 ч - их исчезновение в результате лизиса.

Определение стафилококкового токсина в твороге и сметане.

Оборудование и реактивы: те же, что и при определении токсина в молоке, и 1 н раствор едкого натрия.

Ход определения. Определяют кислотность продукта по Тернеру. В стеклянный стаканчик (на 20-25 мл) вносят 5 г продукта (сметаны или творога) и вливают 10 мл физиологического раствора. Содержимое тщательно растирают стеклянной палочкой. Затем, если кислотность продукта не превышает 100Т, в пробирку добавляют 0,3 мл 1 н раствора едкого натрия, а если кислотность выше 100°Т, то добавляют 0,5 мл 1 н раствора едкого натрия.

Содержимое пробирок центрифугируют при 2000 об./мин 10 мин, затем отсасывают жидкость над осадком. В пробирку наливают 2 мл надосадочной жидкости и добавляют по одной капле разведенных эритроцитов кроликов.

Дальнейшее исследование (за исключением центрифугирования) и оценку ведут так же, как и при исследовании стафилококкового токсина в молоке.

На приборе Клевер 1 М автоматически, точно и быстро можно определить в молоке и сливках жирность, СОМО и удельный вес согласно прилагаемой инструкции.