Сибирская язва и бактериофаги

Можно ли с помощью вирусов бороться с бактериями? Гуманно ли проводить опыты на животных? Как работается ученым-микробиологам в сегодняшних ВУЗах? Об этом и много другом мы поговорили с деканом ветеринарного факультета Ульяновской сельскохозяйственной академии имени П. А. Столыпина Сергеем Золотухиным.

– Вот тут у нас микроскопы, — продолжает экскурсию декан, проводя нас мимо стеллажей с книгами и приборами. На стенах вися знаки биологической опасности, предупреждения о том, что вход в лабораторию осуществляется только в костюмах защиты. — Самый старый, наверное, еще Левенгук изобрел — тогда препарат не на столик клали, а одевали на иглу. Литература очень старая у нас тут есть по микробиологии, ветеринарии. Вот 1889 года, прошлый век. Долго собирали: покупали, где-то кто-то выбрасывал. Сейчас это достаточно ценная коллекция.

– Как вы сами стали микробиологом?

– Я сколько себя помню, знал, что буду работать с животными. И поэтому, когда встал выбор, куда мне поступать, у меня не было никаких сомнений, что стану ветеринарным врачом. Где-то в седьмом классе я делал уже простые операции, кастрации. Я держал в деревне много животных: начиная от коз, овец, коров и заканчивая черепахами, хомяками. Не родители держали, а именно я. Поступив на факультет, закончил его с отличием, пошел работать в хозяйство при вузе. Затем меня забрали в армию, после которой опять вернулся в хозяйство, работал практикующим врачом. Чувствовал, что не все меня устраивает. А тут предложили должность ассистента на кафедре. Так получилось, что это была кафедра микробиологии. Я согласился, ушел с зарплаты в 350 рублей на 120 и из коттеджа в общежитие. Жена до сих пор простить не может. Пошел ассистентом без окончания аспирантуры. Соискателем выполнил диссертацию по ветеринарной микробиологии, защитил ее. Потом выполнил докторскую диссертацию по двум специальностям биологического профиля: микробиология и биотехнология. Работа с микроорганизмами — это особая работа. А микробиологи — это штучный товар. С одной стороны, это быстрорастущие микроорганизмы. Поэтому, если за растениями, за животными нужно долго наблюдать, дожидаясь смены поколений, то микробы размножаются каждые 10-20 минут. Можно увидеть результат, воспроизвести, какой-то биологический эксперимент поставить в сотни раз быстрее, чем с животными.

– Какие-то забавные случаи были в вашей практике?

– А какими качествами должен обладать микробиолог?

– Микробиолог должен быть усидчивым и очень часто возвращаться к началу работы. Многие аспиранты жалуются, что у них ничего не получается. Начинаешь разбираться, видишь, что они неправильно подходят к работе. Это биологически живой объект, то есть если я стал с ним работать, то нельзя останавливаться. Инженер может заглушить машину, уйти, вернуться через месяц. У нас этого не получается. Если уж начал эксперимент, то будь добр довести до конца, пока не получишь результат. А какой это будет результат неизвестно. Если это поисковое исследование, то это будет очень долго. Вот я работал по выделению бактериофага, у меня не получалось буквально года два или три. Потом, когда выделил первый фаг, они пошли лавиной. Называют это везением, но это кропотливый труд, который можно осилить, только ежедневно работая с микроорганизмами в боксе.

– У вас руки не опускались в течение этих двух лет? Не хотелось все бросить?

– Аспиранты сейчас за свой счет препараты покупают? Как вообще строится финансирование лаборатории?

– Покупают за счет грантов кафедры и, частично идет софинансирование академии. Конечно, многое из того, что куплено на кафедре, без помощи ректора сделать было бы невозможно. Многие гранты идут через софинансирование. Выиграли мы, например, 2,5 млн рублей. Но там условие, что столько же должен вложить университет. Ректорат идет на это, потому что знает, что если этого не будет, то ничего не будет. Вот с расходными материалами труднее. Если кто-то заказывает какую-то работу, то мы сразу озвучиваем, сколько будет стоить это, сколько это. Говорим, что проведем исследование, если материалы нам предоставят. Это нам интересно, потому что один из конечных продуктов ученого — это публикации различного уровня.

– Какие крупные достижения лаборатории можете отметить?

– Сколько вообще лабораторий, кафедр по этому направлению работает в России?

– Какие препараты были разработаны в лаборатории?

– Коммерческое направление как раз и позволяет лаборатории существовать. На рынке мы отрабатываем препараты для ускорения минерализации сточных вод. Еще по заказу выделяем бактериофаги из внешней среды, для микроорганизмов заказчика, а они уже доводят препараты до промышленного производства. Потому что невозможно всем одновременно заниматься: начиная от исследований, заканчивая производством и реализацией.

– А какие вообще направления исследований?

– Интересное направление по профилактике болезни растений — вместо того, чтобы применять химические препараты, обрабатывать именно бактериофагами. Интересное направление — борьба с насекомыми с помощью бактерий. Например, против колорадского жука применяют бациллу. На основе ее делают биопрепараты, которые совершенно безопасны для теплокровных. Большинство противопаразитарных препаратов сейчас изготавливается на основе микробных токсинов, которые безопасны для животных и человека. Еще мы можем продлить срок годности любого продукта, если подобрать бактериофаг против тех микроорганизмов, которые вызывают их порчу. А что это значит? Продлить на 2-3 дня срок хранения, это значит, что товар можно дальше увезти, на тысячи километров расширить зоны реализации. Недавно наши студенты случайно выделили бактериофагов сибирской язвы. Вот теперь думаем, куда дальше передать для исследований.

– Препараты только для животных производите или для человека тоже?

– В настоящее время мы работаем с Институтом Габричевского. Я являюсь научным сотрудником лаборатории клинической микробиологии и биотехнологии бактериофагов. Они используют штаммы наших фагов для производства биологически активных добавок для людей. Мы по их заказу выделяем штаммы бактериофагов, которые будут использоваться не только как добавки для людей для профилактики желудочно-кишечных заболеваний, но и для снижения контоминации возбудителей в пищевых продуктах. Например, у норвежцев была проблема со ввозом рыбы в Россию. И не из-за санкций, а из-за ужесточения санитарных правил. По ним, количество листерий должно равняться нулю, а у них не было таких правил. Большие партии рыбы забраковывались. Но обрабатывать какой-то химией тоже нехорошо, потому что остаточные вещества остаются в рыбе. Они стали обрабатывать рыбу листериозным бактериофагом, который уничтожает листерий, не оставляет никаких химических остатков и совершенно безвреден для человека.

– Ваши препараты использовались во время крупных вспышек заболевания?

– Да, я сам работал с возбудителем желудочно-кишечных болезней молодняка. Это большая проблема, когда животное рождается и для того, чтобы эти болезни предупредить, применяют антибиотики. Доприменялись до того, что уже обычные возбудители стали невосприимчивы. Буквально 20-30 антибиотиков уже не действуют на них. Мы либо подбираем препарат, либо наш бактериофаг.

– Как происходит процедура патентования?

– Это очень длительный процесс. Сначала находим новый бактериофаг, затем его нужно депонировать во всероссийскую коллекцию. За это отвечает Центр сертификации и стандартизации ветеринарных препаратов. Там мы проводим комиссионные испытания, подтверждаем свойства какого-то штамма микроорганизма и получаем справку о депонировании. По ней мы получаем патент. Но это еще не все. Чтобы получить препарат, нужно пройти большую бюрократическую процедуру. Очень часто мы ограничиваемся испытаниями нашего препарата в качестве опытной партии. Это допускается, по договоренности с предприятием. На его базе мы проводим исследование препарата и, если таких исследований накапливается много, то можем подавать заявку на выпуск этого препарата. Гораздо проще дела идут по диагностическим препаратам, потому что лечение не происходит, введение препарата не проводим, а лишь используем для проведения диагностических тестов. Таких наработок у нас тоже очень много, они используются, как раз, в качестве рекомендаций. Можно применять наши препараты, наши методы для уточнения диагноза.

– На животных опыты проводите?

– Как таковые опыты мы проводим только по изучению лечебной эффективности чего-то, какого-то препарата. В качестве лабораторных животных мы используем белых мышей. Ну, это для определения патогенности, безвредности нашего препарата на первом этапе. А вот таких острых клинических опытов не проводим. Я когда-то в конце 80-х доказывал этиологическую структуру некоторых возбудителей, которые не признавали таковыми. Мы доказали, что микроорганизмы, которые принимали за грязь, могут вызывать некоторые болезни. Вот тогда пришлось потратить несколько десятков новорожденных поросят. Но это было для того, чтобы выделить бактериофаг и применить его с лечебной целью. Мы стараемся не задействовать животных.

– Лаборатория все-таки привузовская, как сочетаются образовательная деятельность с исследованиями?

– Нашей основной задачей является проведение 900 часов учебного времени, плюс вторая половина дня отведена под методическое обеспечение занятий и каждый преподаватель ведет по 7-10 дисциплин. Это очень трудно, поэтому все совместители: кроме того, что преподаватели, еще и исследователи. Вот мы и занимаемся тем, чем можем. А уж дальше, производством и реализацией должны заниматься те, кто это может сделать. Такие люди сами нас ищут, перспективы вырисовываются неплохие. Нам предлагали перенести производство бактериофагов в Питер. А это значит, что мы преподавателей должны туда отправить на два-три года. А потом что будет? Вернуться сюда они не смогут. Работаем пока в таком исследовательском режиме, где максимальное зарабатывание денег идет по грантовой тематике. Конечно, помощь производству, особенно в ветеринарных исследованиях. Если идет непонятное заболевание, мы помогаем разобраться, подбираем препараты, даже из наших бактериофагов, если они могут помочь. Если производственник заинтересован в этом, он направляет нам заказ на проведение актированных испытаний. Если кто-то хочет получить что-то большее, то мы готовы сотрудничать.

– Последние изменения в системе образования вас затронули?

– Есть такая проблема у вас, ведь наша микробиология конкурентоспособна в мире?

– Мы долгое время работали в изоляции, многие методики, которые мы используем, пусть они даже и прогрессивные, не воспринимаются там. И когда мы свои публикации туда посылаем, возникает много вопросов. То есть они даже не понимают, о чем мы пишем. Поэтому публикация должна быть вылизана, подогнана, но вот эту разницу методик, различные подходы и даже отношение к одним и тем же закономерностям, они разные. Но все равно, будем работать, если надо. Такие условия придумали, будем выполнять.

Первые клинические эксперименты с бактериофагами начались сто лет назад, и казалось, что этот новый метод терапии обречен на успех: с научной точки зрения он выглядел безупречным, и результаты применения выглядели многообещающими.

Почему же в последующие десятилетия интерес к терапевтическому применению бактериофагов в мире упал? Почему он возник вновь, и почему эта замечательная идея до сих пор не реализована в полной мере? И практические врачи, и их пациенты сегодня должны четко представлять не только суть, но и все сильные и слабые стороны этого перспективного вида терапии

Бактериофаги – это не обычные лекарства. Они не являются простыми химическими веществами, как антибиотики и большинство других препаратов, но их вряд ли можно считать и полноценными живыми организмами, так как они, как и все остальные вирусы, могут размножаться только в клетке-хозяине. По сути, это нанороботы с генетической программой, способные проникнуть внутрь бактериальной клетки и там размножиться, разрушив ее.

Поэтому к бактериофагам не всегда применимы стандартные для фармакологии нормы и подходы. И хотя фаговые препараты сегодня производятся и используются в медицине, наши знания о многообразии этих вирусов, механизмах их взаимодействия с бактериями и конкуренции с себе подобными пока недостаточны, чтобы в полной мере использовать их мощный терапевтический потенциал.

Безопасно и эффективно

Фаготерапия родилась едва ли не сразу после открытия самих бактериофагов, однако широкие испытания этих противобактериальных средств начали проводиться в СССР только в конце 1930-х гг. В результате была доказана эффективность препаратов бактериофагов как профилактического средства при борьбе с эпидемиями дизентерии и холеры, а использование их при лечении ран и гнойно-воспалительных процессов показало их потенциал как альтернативы антибиотикам.

Однако результаты исследований тех времен были зачастую противоречивы: иногда фаги сразу подавляли развитие инфекционных процессов, но иногда оказывались бесполезными. Специалисты сразу поняли, в чем причина: лечение было успешным лишь тогда, когда использовались фаги, способные инфицировать именно тот бактериальный штамм, который и вызвал заболевание. Поэтому при возникновении эпидемии требовалось выделить инфекционный агент, проверить на нем имеющиеся фаговые препараты и запустить в производство в качестве препарата наиболее эффективный бактериофаг.

К сожалению, результаты подобных исследований, проводившихся в СССР, не были должным образом документированы и описаны в научной литературе, к тому же они проводились по схемам, не соответствующим принятым на сегодня протоколам клинических испытаний. Тем не менее главные результаты этой работы были бесспорны: фаги доказали свою безопасность и высокую эффективность в реальных условиях и с тех пор используются в нашей стране в клинической практике наряду с обычными лекарственными средствами.

С появлением антибиотиков интерес к фагам на Западе был утрачен, но после появления антибиотикоустойчивых штаммов бактерий в разных странах начали разрабатывать фаговые препараты и проводить испытания, которые, по сути, повторяли исследования, уже проведенные в СССР. Результаты этих работ вновь подтвердили безопасность препаратов бактериофагов, что, в частности, отметило и Управление по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (FDA).

В Великобритании успешно проведены эксперименты по лечению бактериофагами хронического отита, вызванного нечувствительной к антибиотикам синегнойной палочкой Pseudomonas aeruginosa, а в рамках проекта Phagoburn семь медицинских центров Франции, Бельгии и Швейцарии проводят клинические испытания коктейля фагов для предотвращения инфекций при ожогах. Об испытаниях собственных оригинальных коктейлей фагов для лечения широкого спектра заболеваний сообщает и ряд американских фирм (Intralytix, Enbiotix, AmpliPhi). Правда ни одно из этих масштабных клинических испытаний пока не доведено до конца.

В России препараты бактериофагов можно приобрести в обычной аптеке. Но при этом нужно понимать, что в отличие от других лекарств с точной химической формулой и концентрацией действующих компонентов препарат бактериофага представляет собой нестандартный раствор, содержащий живые вирусные частицы. Даже препарат с одним и тем же названием, но произведенный на разных предприятиях или в разное время, может содержать отличающиеся комбинации и (или) пропорции фагов.

Поэтому покупать препарат бактериофага, чтобы лечиться самостоятельно, не стоит. Назначить лечение и выбрать лекарство должен специалист. Спектр заболеваний, которые можно лечить бактериофагами широк: трофические язвы, ожоговые и раневые инфекции, инфекции органов дыхания, мочеполовой системы и желудочно-кишечного тракта, остеомиелит и т. п. Возбудителями болезней во всех этих случаях служат такие печально известные бактерии, как золотистый стафилококк, включая лекарственно устойчивые штаммы, синегнойная палочка, патогенные формы кишечной палочки, сальмонеллы, протеи, стрептококки и др. В принципе в природе можно найти бактериофаг против любой бактерии, включая возбудителей чумы и сибирской язвы. Можно применять бактериофаги и для профилактики бактериальных инфекционных болезней, например, они были успешно использованы в детских садах и школах для предотвращения эпидемии дизентерии.

Основная же и главная причина неудач – неумелый подбор фагов для лечения конкретных пациентов. Каждый конкретный фаг эффективен против одного или максимум нескольких штаммов бактерий, а у разных пациентов схожая по внешнему проявлению инфекция, например, ангина может быть вызвана разными штаммами стрептококка. Чтобы вылечить больного, необходимо выделить культуру патогена и протестировать ее на чувствительность к конкретным фагам. То есть терапия бактериофагами должна проводиться с использованием принципов персонализированной медицины, к чему современная медицина практически не готова.

На пути к персонализированной Фаготерапии

Опыт СССР, Грузии и Польши показал, что для успешного применения бактериофагов нужны не только клиника, но и производственно-лабораторный участок, располагающий коллекцией фагов и специалистами, способными идентифицировать бактерии, подбирать и выделять бактериофаги для конкретного пациента.

Но в таком случае имеет ли смысл масштабное производство фаговых препаратов? Ответ – да, потому что проблема узкой специфичности фагов частично решается производством фаговых коктейлей из нескольких (иногда десятков) разных фагов, поражающих разные штаммы целевого возбудителя. Ведь подобрать для больного нужный фаговый коктейль быстрее и проще, чем тестировать отдельные фаги из большой коллекции.

И все же не надо думать, что бактериофаги полностью заменят антибиотики – эти препараты дополняют друг друга, и применяться они должны в разных ситуациях. Когда больной находится в тяжелом состоянии, и есть уверенность, что причиной служит бактериальная инфекция, времени на эксперименты и подбор препаратов нет. Единственно правильное решение в этой ситуации – антибиотик широкого спектра действия.

Но в ситуации хронической инфекции или инфекции, вызванной бактериями со множественной устойчивостью к антибиотикам, предпочтение следует отдавать бактериофагу. В случае таких затяжных болезней, как отит, у врача есть время, чтобы использовать фаговый коктейль или специально подобрать фаг. Или же, когда после операции больной поражается антибиотикоустойчивым бактериальным штаммом, и его состояние быстро ухудшается, фаготерапия может стать единственным спасением.

Богатый опыт применения бактериофагов в клинической практике, накопленный за последние сто лет, свидетельствует о перспективности фаговых медицинских технологий. Дальнейшая работа специалистов из множества компаний, работающих сегодня в этой области, и применение методов синтетической биологии обязательно приведут к созданию препаратов с несравненно большей эффективностью по сравнению с современными фаговыми коктейлями.

Тем не менее, биотехнологи, также как ученые и медики, надеются, что безвредные и эффективные препараты все же займут свое законное место в арсенале терапии инфекционных заболеваний.

Алешкин А. В. Бактериофаги в инфекционной патологии: прошлое, настоящее и будущее // Лекции по исследованию и применению бактериофагов. 2016. Ульяновск. С. 11—51.

Козлова Ю. Н., Репин В.Е., Анищенко В.В., Власов В.В. и др. Штамм бактериофага Pseudomonas aeruginosa, используемый в качестве основы для приготовления асептического средства против синегнойной палочки. // Патент РФ №2455355. 2012.

Козлова Ю. Н., Морозова В. В., Тикунова Н. В. и др. Штамм бактериофага Staphylococcus aureus SA20, обеспечивающий разрушение биопленок, образуемых бактериями рода Staphylococcus // Патент РФ № 2565824. 2015.

Морозова В. В., Козлова Ю. Н., Тикунова Н. В. и др. Штамм бактериофага Citrobacter freundii CF17, способный лизировать патогенные штаммы Citrobacter freundii // Патент РФ № 2565559. 2015.

Тикунова Н. В., Морозова В. В. Фаговый дисплей на основе нитчатых бактериофагов: применение для отбора рекомбинантных антител // Аcta Naturae. 2009. № 3. С. 6—15.

Тикунова Н. В. и Власов В. В. Бактериофаги – враги наших врагов // Наука из первых рук. 2013. № 2(50). С. 58—69.

Покровская М. П. Каганова Л. С., Морозенко М. А. и др. Лечение ран бактериофагом. М.: НАРКОМЗДРАВ СССР, МЕДГИЗ. 1941. 57 с

Górski A. et al. Phages targeting infected tissues: novel approach to phage therapy. // Future Microbiol. 2015. V. 10. P. 199—204.

Międzybrodzki R. et al. Clinical aspects of phage therapy // Adv. Virus. Res. 2012. V. 83. P. 73—121.

В публикации использованы иллюстрации из книги Лечение ран бактериофагом. М.: НАРКОМЗДРАВ СССР, МЕДГИЗ. 1941. 57 с.