Соп по серологии бруцеллез туляремия
Таксономия: Возбудители бруцеллеза B.melitensis, B.abortus, B.suis, B.canis, B.ovis относятся к отделу Gracilicutes, роду Brucella.
Морфологические и тинкториальные свойства: Мелкие, грамотрицательные палочки овоидной формы. Не имеют спор, жгутиков, иногда образуют микрокапсулу.
Культуральные свойства: облигатные аэробы. B.abortus для своего роста нуждается в присутствии 5—10 % углекислого газа. Оптимальными для роста являются температура 37С. Требовательны к питательным средам и растут на специальных средах (печеночных, кровяной агар). Их особенностью является медленный (в течение 2 нед) рост. В жидких средах – равномерное помутнение с небольшим осадком. На плотных – мелкие, круглые гладкие голубые колонии. Диссоциация от S- к R-формам колоний.
Биохимическая активность: очень низкая; содержат каталазу и оксидазу, нитраты редуцируют в нитриты, цитраты не утилизируют, продуцируют Н2S.
Антигенная структура. O-антиген – соматический, и капсульный антигены. Две разновидности О-антигена — А(абортус) и М(мелитензис).Иногда обнаруживают К-антиген.
Факторы патогенности: Образуют эндотоксин, обладающий высокой инвазивной активностью. Продуцируют один из ферментов агрессии — гиалу-ронидазу. Их адгезивные свойства связаны с белками наружной мембраны.
Резистентность. Быстро погибают при кипячении, при действии дезинфицирующих веществ, устойчивы к низкой температуре: в замороженном мясе они сохраняются до 5 мес, в молочных продуктах — до 1,5 мес.
Эпидемиология. Зоонозная инфекция. Источник - крупный и мелкий рогатый скот, свиньи, овцы, выделяющие B.melitensis. Люди более восприимчивы к этому виду возбудителя. Реже заражение происходит от коров (B.abortus) и свиней (B.suis). Больные люди не являются источником заболевания.
Патогенез. Проникают в организм через слизистые оболочки или поврежденную кожу, попадают сначала в регионарные лимфатические узлы, затем в кровь, разносятся по всему организму и внедряются в органы ретикулоэндотелиальной системы (печень, селезенку, костный мозг). Там они могут длительное время сохраняться и вновь попадать в кровь. При гибели освобождается эндотоксин, вызывающий интоксикацию.
Клиника: Инкубационный период составляет обычно 1—3 нед. Длительная лихорадка, озноб, потливость, боли в суставах, радикулиты.
Иммунитет: После перенесенного заболевания формируется непрочный иммунитет. Клеточно-гуморальный, нестерильный, относительный.
Микробиологическая диагностика:
Микробиологическая диагностика обычно проводится путем серологических исследований (реакция Райта и Хеддлсона).
Бактериологическое исследование. Для получения гемокультуры кровь засевают в два флакона печеночного бульона. Один из них (для выделения культуры В. melitensis) инкубируют в обычных аэробных условиях, другой (для выделения первичной культуры В. abortus) —с СО2. В первых генерациях бруцеллы растут очень медленно. На агаре бруцеллы образуют бесцветные колонии, в бульоне — помутнение и слизистый осадок. В мазках, окрашенных по Граму, обнаруживаются мелкие грамотрицательные формы. Они неподвижны, спор не образуют, в определенных условиях появляется видимая капсула.
Для быстрой идентификации бруцелл ставят реакцию агглютинации со специфическими агглютинирующими сыворотками на стекле и определяют чувствительность к специфическому фагу. Все виды бруцелл не ферментируют углеводы. Их дифференцируют по образованию H2S, чувствительности к СО2, действию анилиновых красителей (основной фуксин).
Для серодиагностики используют РПГА, РИФ, РСК, метод определения неполных антител. В поздние периоды заболевания процент положительных серологических реакций (агглютинации, РПГА и РСК) начинает снижаться и большее диагностическое значение приобретают кожно-аллергическая проба и реакция Кумбса.
Биопроба.Применяется для выделения чистой культуры из материала, загрязненного посторонней микрофлорой. Исследуемый материал вводят морским свинкам подкожно в паховую область. Кусочки органов и лимфатических узлов засевают на питательные среды для получения чистой культуры и ее идентификации.
Кожно-аллергическая проба (реакция Бюрне).На предплечье внутрикожно вводят 0,1 мл бруцеллина. При наличии аллергии уже через 6 ч. могут появиться гиперемия кожи и болезненная отечность. Учет реакции производят через 24 ч. Реакция обладает высокой чувствительностью.
Лечение: Антибиотики широкого спектра действия. Специфическая иммунотерапия убитой лечебной бруцеллезной вакциной или бруцеллина (фильтрат бульонных культур В. melitensis, B.abortus, В.suis, убитых нагреванием. При острых формах – бруцеллезный иммуноглобулин.
Профилактика: Живая бруцеллезная вакцина получена штамма ВА-19А, полученную из В. abortus, создает перекрестный иммунитет против других видов бруцелл.
Бруцеллезный единый диагностикум.Взвесь убитых бруцелл, окрашенных метиленовым синим, применяется при серологической диагностике бруцеллеза постановкой реакции агглютинации Райта и Хеддлсона.
Накожная сухая живая бруцеллезная профилактическая вакцина.Взвесь вакцинного штамма. В. abortus применяется для профилактики бруцеллеза.
Бруцеллез. Микробилогическая диагностика. Материалом для исследования служат: кровь, пунктат красного костного мозга, моча, испражнения, молоко и молочные продукты, кусочки органов.
Для диагностики бруцеллеза используют все методы микробиологической диагностики. Серодиагностику и аллергические пробы проводят в базовых лабораториях, чистую культуру бруцелл выделяют и идентифицируют в специальных лабораториях с соблюдением правил техники безопасности. Посев крови для выделения гемокультуры проводят в первые дни болезни при наличии лихорадки; при отрицательных результатах исследование многократно повторяют (бактериемия может наблюдаться в течение года и более). Учитывая медленный рост бруцелл, полсевы выдерживают в термостате до 1 месяца. Пунктат котсного мозга засевают на те же среды,миелокультуры при бруцеллезе удается получить в 1,5—2 раза чаще, чем гемокультуру. Миелокультуры могут быть получены в остром, подостром и даже хроническом периоде заболевания. Мочу для выделения урино культуры предварительно центрифугируют, из осадка делают посевы. Уринокультуры выделяют как при остром бруцеллезе, так и в пери- реконвалесценции. Процент высеваемости невелик и зависит от периода заболевания (5-14%). Аналогичным образом поступают с молоком. Копрокультуры выделяют крайне редко. Нередко культура бруцелл выделяется из желчи. Незначительный процент положительных результатов дают бактериологические исследования мокроты, суставной жидкости, влагалищных выделений и др. Наибольшую высеваемость бруцелл, особенно из бактериально ,но загрязненного материала, получают при посевах исследуемого материала в желток свежего куриного яйца или в желточный мешок куриного эмбриона. Зараженные яйца выдерживают в термостате 5 дней, а затем делают посев на питательные среды. Для биопробы используют белых мышей, морских свинок. Животных заражают крово внутрибрюшинно; осадком мочи и молока — подкожно. Через 20—30 дней у зараженного животного берут кровь и ставят с ней реакцию агглютинации. Затем животных забивают, вскрывают и делают посевы крови из сердца, взвеси внутренних органов лимфатических узлов. Выделенные чистые культуры бруцелл дифференцируют по способности роста в отсутствие повышенной коннцентрации углекислого газа, выделению сероводорода, чувствительности к бруцеллезному фагу и бактериостатическому действию анилиновых красителей (фуксина и тионина). Приеимуществом биологического метода исследования является возможность выделения бруцелл из материалов, контаминированных сторонней микрофлорой или содержащих большое количество возбудителей. В сыворотке больных бруцеллезом накапливаются агглютинирующие (вначале IgM, за- л IgG), неполные блокирующие (IgA, IgG) опсонические (IgG) антитела. Для их вы- тения с диагностической целью используют реакцию Райта (развернутая агглютинация) Хеддельсона (пластинчатая агглютинация),
РПГА, РИФ, ИФА, реакцию Кумбса, опсоно- фагоцитарную реакцию. Реакция агглютинации — один из основных диагностических методов при бруцеллезе у людей и сельскохозяйственных животных. Агглютинины, как правило, появляются в крови в ранние сроки после заражения, поэтому наибольшую диагностическую ценность реакция агглютинации представляет при остром бруцеллезе. РСК также является специфической для бруцеллеза, она появляется позже, чем реакция агглютинации, но держится дольше, что повышает ее диагностическую ценность у больных хроническим бруцеллезом. Гемагглютинирующие антитела в РПГА можно обнаружить в 91—100% случаев у больных острым и подострым бруцеллезом; при хроническом бруцеллезе и резидуальных явлениях гемагглютинины обнаруживаются реже, однако значительно чаще, чем агглютинины. РИФ выявляет антитела в сыворотке при остром, подостром и хроническом бруцеллезе чаще, чем реакция агглютинации. Реакция Кумбса рекомендуется в качестве диагностического метода при хронических и латентных формах бруцеллеза. Опсонофагоцитарную реакцию проводят с 15—20-го дня болезни. Она основана на способности сегментоядерных нейтрофилов фагоцитировать бруцеллы благодаря наличию в крови человека специфических опсонинов, нарастающих в процессе бруцеллезной инфекции. Реакция специфична и чувствительна, однако не отражает количества опсонинов в крови. В условиях массового обследования на бруцеллез применяют пластинчатую реакцию агглютинации Хеддельсона в сочетании с кожно-аллер- гической пробой Бюрне. Рекомендуется определять состав сывороточных иммуноглобулинов в различные фазы заболевания. В ранние сроки после заражения появляются IgM, в более поздние— IgG. Эти иммуноглобулины дифференцируют с помощью цистеиновой пробы.
Аллергический метод применяют для выявления ГЗТ к бруцеллам, наблюдающейся у больных бруцеллезом, инфицированных бру- целлами лиц и привитых живой бруцеллезной вакциной. Ее ставят с 15—20-го дня болезни. Аллергическая реакция бывает положительной в течение многих лет после перенесенного заболевания и у привитых. Серологические реакции и кожно-аллергическая проба по своему диагностическому значению не равноценны, вследствие чего не могут заменить друг друга. Это обуславливает необходимость применения комплексного сероаллергичес- кого метода, являющегося наиболее надежным способом диагностики бруцеллеза.
Лечение. При остром и хроническом бруцеллезе с выраженными признаками активности необходимо назначение антибиотиков широкого спектра. Наиболее эффективно сочетание стрептомицина с препаратами широкого спектра действия. Антибиотики не действуют на бруцеллы, расположенные внутриклеточно, поэтому их можно назначать только при наличии бактериемии, а при хроническом бруцеллезе они неэффективны. Кроме того, антибиотики не предупреждают рецидивов бруцеллеза, поэтому широко применяется специфическая иммунотерапия убитой лечебной бруцеллезной вакциной (5—7 внутривенных вливаний в нарастающих дозах 1—2 раза в неделю) или бруцеллина (внутримышечно по 2 раза в неделю). При острых и рецидивирующих формах назначают бруцеллезный иммуноглобулин.
Туляремия.Микробиологическая диагностика. Материал для исследования — кровь, пунктат из бубона, соскоб из язвы, отделяемое конъюнктивы, налег из зева, мокрота и др. — определяется клинической формой болезни. Кроме того, на исследование можно брать воду и пищевые продукты. В природных очагах туляремии проводят плановые систематические исследования для выделения возбудителя туляремии от грызунов.
Для диагностики применяют все методы микробиологической диагностики. Исследование проводят в режимных лабораториях.
Бактериологический метод в диагностике туляремии у человека редко дает положительные результаты. Чистую культуру, как правило, выделяют после накопления ее на восприимчивых лабораторных животных. Для биопробы меняют белых мышей и морских свинок. Мышей заражают подкожно, морских свинок — внутрибрюшинно; животные погибают на 3—6-е си, иногда позднее. Зараженных животных гржат в особых условиях (как при диагностике чумы) и наблюдают за ними в течение 4 дней. Если экспериментальные животные протяжении 7—15 дней не погибают, их за- ают на 15—20-й день и трупы вскрывают, и наличии туляремии обнаруживают патотолоанатомические изменения в виде продуктивного процесса с некрозом. Чистую культуру выделяют из внутренних органов на желточной среде, глюкозоцистеиновом кровяном агаре, среде Емельяновой и др. При идентификации опираются на морфологию и тинкториальные свойства возбудителя, отсутствие роста на МПА, агллютинацию гомологичной сывороткой, патогенность для белых мышей и морских свинок. Чистую культуру можно выделить, заражая -дневные куриные эмбрионы в желточный шок. Для выделения чистой культуры воз- щгеля из воды последнюю центрифугируют и фильтруют через бактериальные фильтры полученным осадком заражают лабораторных животных. При исследовании пищевых продуктов их промывают мясопептонным бульон — МПБ, цетрифугируют и осадком заражают лабораторных животных. Параллельно с бактериологическим исследованием из исследуемого материала готовят мазки-отпечатки, которые окрашивают по омановскому—Гимзе. В мазках из органов можно обнаружить мелкие кокковидные и алочковидные бактерии, которые располагаются внутриклеточно и в виде скоплений, бразуя нежную капсулу. Для серодиагностики используют разверну- ую реакцию агглютинации, РПГА, РСК на холоде, РИФ.
Аллергические пробы применяют для ранней диагностики туляремии (с 5-го дня от начала болезни). Используют два вида тулярина I, соответственно, 2 способа их введения: «кожный и внутрикожный. Так как концен- грация аллергена в обоих видах тулярина раз- гачная, недопустимо использовать накожный гулярин для внутрикожной пробы и наоборот.
Результаты аллергической реакции учитывают в динамике через 24—36—48 ч. За положительный результат принимают инфильтрат диаметром не менее 5 мм. У вакцинированных или переболевших туляремией лиц в течение ряда лет аллергические пробы остаются положительными (анамнестическая реакция).
Лечение. Применяют антибиотики стрептомицинового и тетрациклинового ряда. В случаях затяжного течения заболевания проводят комбинированную антибиотикотерапию и вакцинотерапию с применением убитой лечебной вакцины, которая вводится различными путями в дозах от 1 до 15 млн микробных тел с интервалом 3—6 дней. Курс лечения 6—10 инъекций.
Профилактика. Проводится в направлении всех трех звеньев эпидемического процесса: мероприятия 1-й группы направлены на источник инфекции; мероприятия 2-й группы — на разрыв механизма и путей передачи; мероприятия 3-й группы — на восприимчивый коллектив. Для специфической профилактики применяют живую туляремийную вакцину, полученную отечественными учеными Б. Я. Эльбертом и Н. А. Гайским из штамма № 15. Вакцина обеспечивает прочный иммунитет при заражении европейским и голарктическим подвидами и эффективна против американской разновидности возбудителя. Вакцинацию проводят по эпидемическим показаниям, а также лицам, относящимся к группам риска. Допускается одновременная вакцинация против туляремии и бруцеллеза; туляремии и чумы; а также против туляремии и некоторых других инфекций.
Не специфическая профилактика такая же, как при других зоонозах, и направлена, в первую очередь, на борьбу с грызунами.
Эпидемиология, патогенез и методы микробиологической диагностики сибирской язвы. Дифференциация сибиреязвенных бацилл от антракоидов. Специфическое лечение и профилактика сибирской язвы.
Эпидемиология. Сибирская язва распространена повсеместно, особенно в районах с развитым животноводством. Источник инфекции — больные животные, чаще всего крупный рогатый скот, овцы, козы, лошади, олени, буйволы, верблюды и свиньи. Резервуар возбудителя — почва. Человек является биологическим тупиком. Как и для всех зоонозов, для сибирской язвы характерна множественность механизмов, путей и факторов передачи. Человек заражается чаще всего контактным путем, реже — алиментарно, аэ- рогенно и другими путями, при уходе за больными животными, убое, переработке животного сырья, употреблении мяса и других животноводческих продуктов. Восприимчивость к возбудителю относительно невысокая.
Патогенез. Входными воротами возбудителя сибирской язвы в большинстве случаев являются поврежденная кожа, значительно реже — слизистые оболочки дыхательных путей и желудочно-кишечного тракта. В основе патогенеза лежит действие экзотоксина возбудителя, отдельные фракции которого вызывают коагуляцию белков, отек тканей, приводят к развитию токсико-инфекционного шока. На месте внедрения возбудителя в кожу развивается сибиреязвенный карбункул — очаг геморрагически-некротического воспаления глубоких слоев дермы на границе с подкожной клетчаткой, сопровождающийся отеком и деструкцией тканей; в центре очага — некроз кожи с образованием буро-черной корки (anthrax — уголь), сопровождающейся отеком. Возбудитель из входных ворот заносится макрофагами в регионарные лимфатические узлы, в которых развивается воспаление без серьезных нарушений барьерной функции, в силу чего генерализация процесса не наступает или наступает в относительно поздние сроки от начала воспалительного процесса. При вдыхании пылевых частиц, содержащих сибиреязвенные споры, макрофаги захватывают возбудителя со слизистой дыхательных путей и заносят в трахеобронхиальные лимфатические узлы, в которых развивается воспаление с исходом в тотальный некроз, способствующий гематогенной генерализации инфекции.
Микробиологическая диагностика. Материалом для исследования служат: содержимое карбункула и пузырьков, мокрота, испражнения, кровь и моча. При патолого-анатомичес- ком исследовании забирают кусочки органов или целые органы. По эпидемиологическим показаниям исследуют различные объекты внешней среды, а также шерсть и щетину животных. Все образцы помещают в герметичные сосуды и транспортируют закупоренными в опломбированных боксах или деревянных ящиках в лаборатории особо опасных инфекций.
Микробиологическую диагностику проводят с соблюдением правил техники безопасности как при особо опасных инфекциях. Для диагностики применяют все пять методов микробиологической диагностики.
Первоначально из материала готовят мазки и окрашивают их по Граму и для обнаружения капсул (по Романовскому—Гимзе) и спор (по Ауэске). Наличие в мазках крупных грамполо- жительных стрептобацилл, окруженных капсулой, дает возможность поставить предварительный диагноз. Люминесцентная микроскопия применяется как дополнительный метод диагностики сибирской язвы, при этом сибиреязвенные бациллы, обработанные люминесци- рующей сывороткой, выглядят как палочки с ободком, светящиеся зеленоватым светом.
В биопробе патологический материал или испытуемую культуру вводят подкожно: морским свинкам в паховой области, мышам в корень хвоста. Обычно мыши погибают через 1—2 суток, морские свинки — через 2—4 суток. Наблюдение за животными продолжают в течение 10 дней. У павших животных исследуют печень, селезенку, лимфатические узлы, почки, кровь из полостей сердца, места введения исследуемого материала. О наличии возбудителя сибирской язвы свидетельствуют типичная патолого-анатомическая картина у подопытных животных: отек в месте введения исследуемого материала, темная не свернувшаяся кровь, кровоизлияния в клетчатке, рыхлая селезенка и плотная красная печень. В мазках-отпечатках из органов и крови — наличие грамположительных капсулированных палочек.
Серодиагностика проводится в тех случаях, когда не удается обнаружить возбудителя в материале. Для определения антител в сыворотке крови больного используют реакцию латексной агглютинации или РПГА с протективным сибиреязвенным АГ. Сибиреязвенные антигены определяют в РИФ, ИФА, РСК, РИГА, РП в геле и реакции термопреципитации по Асколи. Реакция Асколи имеет большое значение, так как позволяет обнаружить возбудитель при отрицательных результатах бактериологического исследования. Наличие сибиреязвенного антигена в разложившемся или мумифицированном трупе животного, коже (свежей, сухой, выделанной) и изделиях из нее, шкурках, мехе, шерсти определяют с помощью реакции термопреципитации по Асколи. Однако для прижизненной диагностики она не дает серьезных преимуществ перед бактериологическим и серологическим методами.
Для ретроспективной диагностики при эпидемиологических исследованиях ставят кожные аллергические пробы с антраксином. Антраксин вводят внутрикожно объемом 0,1 мл, результаты учитывают через 24—48 ч. Пробу считают положительной при наличии гиперемии диаметром более 16 мм и инфильтрата.
Лечение. Применяют антибиотики и сибиреязвенный иммуноглобулин. Для антибактериальной терапии препарат выбора — пенициллин, при его непереносимости — тетрациклин.
Профилактика. Проводится в направлении всех трех звеньев эпидемического процесса: мероприятия 1 группы направлены на источник инфекции, мероприятия 2 группы — на разрыв механизма и путей передачи, мероприятия 3 группы — на восприимчивый коллектив. Для специфической профилактики применяется живая сибиреязвенная вакцина СТИ (Санитарно-технический институт). Вакцина получена Н. Н. Гинсбургом с соавт. в 1942 г. Иммунизацию проводят по эпидемическим показаниям группам риска. Для экстренной профилактики назначают сибиреязвенный иммуноглобулин. Не специфическая профилактика такая же, как и при всех зоонозах, и сводится в основном к санитарно- ветеринарным мероприятиям:
* Изоляция больных и подозрительных животных.
* Сжигание трупов погибших животных и зараженных объектов (подстилка, навоз).
* Обеззараживание мест содержания больных животных.
* Осушение заболоченных участков (перепахивание, хлорирование).
* Организация скотомогильников. При невозможности сжигания трупов их хоронят на отдельных сухих и пустынных участках; глубина ямы должна быть не меньше 2 м, труп кладут на толстый слой хлорной извести и засыпают ею сверху слоем до 10 см. Все мероприятия по захоронению следует проводить с соблюдением санитарных норм.
* Санитарный надзор за предприятиями, занятыми переработкой животного сырья. Все поступающее сырье проверяют в реакции термопреципитации по Асколи, меховые изделия изготовляют только из сырья, давшего отрицательный результат в этой реакции.
4.1. Серологическая диагностика бруцеллеза заключается в обнаружении специфических
антител в сыворотке крови животных с помощью реакции агглютинации в пробирках (РА), реакции
связывания комплемента (РСК), реакции длительного связывания комплемента на холоде (РДСК),
пластинчатой реакции агглютинации с роз бенгал антигеном (роз бенгал проба - РБП) и в молоке
коров - кольцевой реакции (КР).
4.2. Постановка и учет результатов реакции агглютинации в пробирках (РА).
4.2.1. Реакцию агглютинации в пробирках с бруцеллезным антигеном применяют при
диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота, овец, коз, лошадей, буйволов, верблюдов, оленей,
собак, пушных зверей и животных других видов.
4.2.2. Компоненты реакции агглютинации:
испытуемые сыворотки крови (см. подпункт 2.3.1);
позитивная бруцеллезная сыворотка, изготовленная биопредприятием или полученная от
больного бруцеллезом животного. На этикетке флакона с такими сыворотками указывают титры в РА
и РСК и дату изготовления;
негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных), изготовленная биопредприятием
или полученная в лаборатории;
антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК (см. Приложение N 2, п. 6);
раствор хлорида натрия. При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, лошадей,
верблюдов, собак, пушных зверей и морских свинок для разведения испытуемых сывороток и
антигена используют фенолизированный (0,5-процентный) физиологический раствор хлорида
натрия (0,85-процентный), при исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов - 5-процентный
и оленей - 10-процентный фенолизированный раствор хлорида натрия (см. Приложение N 2, п. 1).
4.2.3. Постановка реакции агглютинации.
Реакцию агглютинации проводят в объеме 1 мл в четырех разведениях:
при исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов, оленей и собак - 1:25, 1:50, 1:100 и
крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов - 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;
пушных зверей и морских свинок - 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.
При массовых исследованиях допускается постановка реакции в первых двух разведениях.
Разлив компонентов реакции проводят индивидуальными мерными пипетками или
групповыми дозаторами Флоринского.
Для исследования каждой испытуемой сыворотки крови требуется 5 пробирок. В пробирках
первого ряда делают основное разведение. Для этого сыворотку крови крупного рогатого скота,
лошадей и верблюдов берут в дозе 0,1 мл, вносят в пробирки и добавляют к ней 2,4 мл
соответствующего раствора хлорида натрия, получают разведение сыворотки 1:25. Сыворотку крови
овец, коз, буйволов, оленей и собак берут в дозе 0,2 мл и добавляют 2,3 мл соответствующего
раствора хлорида натрия (разведение 1:12,5), а сыворотку крови пушных зверей и морских свинок
берут в дозе 0,3 мл и добавляют 1,2 мл соответствующего раствора хлорида натрия (разведение 1:5).
Таким образом делают основное разведение испытуемых сывороток в пробирках первого ряда
штатива (по 10 проб в ряду).
После приготовления основного разведения сывороток в первом ряду в пробирки третьего,
четвертого и пятого рядов вливают по 0,5 мл соответствующего раствора хлорида натрия. Затем из
пробирок первого ряда при помощи группового дозатора Флоринского переносят в пробирки второго
и третьего рядов по 0,5 мл основного разведения сывороток (1:25, 1:12,5 или 1:5). В пробирках
третьего ряда сыворотки смешивают с раствором хлорида натрия, по 0,5 мл этого разбавления
переносят в пробирки четвертого ряда и так же из пробирок четвертого ряда - в пятый. Из пробирок
пятого ряда по 0,5 мл жидкости удаляют. Таким образом делают последовательные двукратные
разведения одновременно 10 сывороток.
После этого в каждую пробирку второго, третьего, четвертого и пятого рядов с разведенными
сыворотками вносят при помощи группового дозатора Флоринского или другого дозирующего
устройства по 0,5 мл антигена, предварительно разбавленного в соотношении 1:10 соответствующим
раствором хлорида натрия. После добавления антигена разведение сывороток в каждой пробирке
удваивается и в зависимости от вида исследуемых животных будет составлять соотношения: 1:50,
1:100, 1:200 и 1:400; 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200 или 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.
В пробирки первого ряда бруцеллезный антиген не вносят, и они служат контролем качества
сыворотки. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты
реакции агглютинации не учитывают.
При массовых исследованиях сыворотки разливают индивидуальной микропипеткой (с грушей)
или групповыми дозаторами Флоринского в две пробирки в дозах 0,02 и 0,01 мл (сыворотки
крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов) или 0,04 и 0,02 мл (при исследовании сывороток
овец, коз, буйволов, оленей и собак). Затем в каждую пробирку добавляют по 1,0 мл антигена,
разведенного соответствующим раствором хлорида натрия в соотношении 1:20. При этом разведения
сывороток будут соответствовать соотношениям 1:50 и 1:100 или 1:25 и 1:50.
При постановке реакции агглютинации одновременно с испытуемыми сыворотками ставят
с негативной сывороткой в тех же разведениях, как с испытуемыми;
с позитивной бруцеллезной сывороткой в разведениях до ее предельного титра.
После добавления к испытуемым и контрольным сывороткам антигена штативы с пробирками
осторожно встряхивают и помещают в термостат при 37 - 38 °С на 16 - 20 часов, затем выдерживают
при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего проводят учет реакции.
4.2.4. Учет реакции агглютинации. Результаты реакции учитывают визуально и определяют в
крестах по следующей схеме:
++++ (4 креста) - полное просветление жидкости, микробные тела
осели на дно пробирки в виде "зонтика", при легком
встряхивании "зонтик" разбивается на хлопья и
а жидкость остается прозрачной (100% агглютинации);
+++ (3 креста) - неполное просветление жидкости и хорошо выраженный
"зонтик" (75% агглютинации);
++ (2 креста) - просветление жидкости, "зонтик" умеренно выражен
+ (1 крест) - едва заметное просветление жидкости, "зонтик"
слабо, при встряхивании заметно небольшое
хлопьев или комочков (25% агглютинации);
- (знак минус) - просветления жидкости и образования "зонтика" не
наступило, на дне пробирки виден "пунктик" осевших
микробов антигена, при легком встряхивании
За титр антител принимают последнее разведение сыворотки, в котором произошла
агглютинация не менее чем на 2 креста (++), что соответствует количеству международных единиц
(ME) антител в 1 мл сыворотки (например, сыворотка с конечным титром РА 1:100 содержит 100 ME,
1:200 - 200 ME и т.п.).
Для более объективной оценки результатов РА в крестах готовят стандарты мутности,
соответствующие 0 (нулю), 25, 50 и 75% просветления жидкости.
В четыре пробирки последовательно наливают 1, 2, 3 и 4 мл антигена, разведенного 1:10. Затем
в том же порядке в три первые пробирки добавляют 3, 2 и 1 мл фенолизированного
физиологического раствора. В четвертую пробирку раствор не добавляют. После встряхивания
пробирок жидкость из каждой из них переносят по 0,5 мл в серологические пробирки и добавляют по
0,5 мл фенолизированного физиологического раствора. Полученные стандарты соответствуют 75, 50
и 25% просветления жидкости. В последней, четвертой пробирке просветление отсутствует.
Стандарты мутности готовят каждый раз при постановке РА и выдерживают в термостате
одновременно с основной реакцией.
Степень просветления в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют визуально путем
сравнения со стандартами и результаты реакции выражают в крестах.
При массовых исследованиях сывороток в двух разведениях все сыворотки, давшие
агглютинацию с оценкой не менее чем на 2 креста (++) в каком-либо из указанных разведений,
исследуют повторно в четырех разведениях.
4.2.5. Диагностическая оценка реакции агглютинации.
Реакцию считают положительной при наличии агглютинации с сыворотками крови крупного
рогатого скота, лошадей и верблюдов начиная с разведения 1:100 (100 ME - международных единиц
антител), коз, овец, буйволов, оленей и собак - с разведения 1:50 (50 ME), пушных зверей и морских
свинок - с разведения 1:10 (10 ME) с оценкой не менее чем на 2 креста.
Реакцию считают сомнительной при наличии агглютинации только в разведении 1:50 (50 ME) с
сыворотками крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов и в разведении 1:25 (25 ME) с
сыворотками овец, коз, буйволов, оленей и собак с оценкой не менее чем на 2 креста.
При получении сомнительного результата реакции сыворотку крови данного животного
исследуют повторно через 3 - 4 недели.
На неблагополучных по бруцеллезу фермах животных, при исследовании которых будет
получена дважды сомнительная РА, относят к положительно реагирующим.
В заключении лаборатории о результатах исследования должна быть сообщена диагностическая
оценка каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и конечное разведение (титр)
сыворотки, в котором получен соответствующий результат, выраженное в международных единицах
(например: конечный титр сыворотки крови крупного рогатого скота 1:100 с оценкой 2 креста или
более - "положительная 100 ME"; конечный титр сыворотки 1:50 с оценкой 2 креста или более -
"сомнительная 50 ME").
Суммарные результаты исследования испытуемых сывороток, серию антигена, срок его
годности, а также предельный титр позитивной сыворотки записывают в журнал серологических
4.3. Постановка и учет реакции связывания комплемента (РСК) и реакция длительного
связывания комплемента на холоде (РДСК).
4.3.1. Реакцию связывания комплемента применяют при диагностике бруцеллеза у крупного
рогатого скота, овец, коз, свиней, лошадей, оленей, собак, пушных зверей и животных других видов.
Реакцию длительного связывания комплемента, как более чувствительную, применяют вместо
РСК при исследовании на бруцеллез сывороток животных указанных видов, а также при диагностике
инфекционного эпидидимита баранов.
4.3.2. Компоненты реакций и их подготовка к работе:
испытуемые сыворотки крови (см. подпункт 2.3.1);
позитивная бруцеллезная или овисная сыворотка, изготовленная на биофабрике или полученная
от больного животного. На этикетках флаконов с сыворотками указывают титр в РСК (РДСК) и дату
негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных), изготовленная на биофабрике
или полученная в лаборатории.
Испытуемые и контрольные (позитивную и негативную) сыворотки инактивируют в водяной
бане в день постановки реакции: для РСК - при 60 - 62 °С в течение 30 мин. (сыворотки крови ослов
и мулов - при 64 - 65 °С, буйволов - при 62 - 64 °С в течение 30 мин., свиней - при 60 - 62° в течение
50 мин.); для РДСК сыворотки крови животных всех видов - при 63 - 64 °С в течение 30 мин.;
антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК или овисный для РДСК в рабочем титре,
указанном предприятием, его изготовившим (см. Приложение N 2, п. 6);
комплемент - сыворотка крови морской свинки (свежая, консервированная добавлением 4%
борной кислоты или лиофильно высушенная). При использовании в качестве комплемента свежей
или консервированной сыворотки и при получении каждой новой серии сухого комплемента
проводят титрование его в гемолитической системе для определения активности (см. Приложение N
Сухой биофабричный комплемент растворяют в физиологическом растворе, как указано на
этикетке. Берут такое количество ампул (флаконов), в которых содержится необходимое для
проведения всего опыта количество комплемента. Содержимое ампул (флаконов) сливают в одну
пробирку, осторожно смешивают, берут 0,5 мл и разводят физиологическим раствором 1:20 для
титрования. Остальное количество комплемента хранят в холодильнике при плюс 2 - 4 °С;
гемолитическая сыворотка (гемолизин) - для РСК в удвоенном титре, для РДСК - в утроенном.
Титрование гемолизина проводят периодически один раз в 3 месяца и при использовании каждой
новой серии (см. Приложение N 2, п. 5);
эритроциты барана - 2,5-процентная от осадка взвесь эритроцитов в физиологическом растворе
для РСК и 3-процентная для РДСК (см. Приложение N 2, п. 3).
Для приготовления гемолитической системы соответствующую взвесь эритроцитов и
гемолитическую сыворотку в рабочем разведении смешивают в равных объемах и выдерживают в
термостате при 37 °С в течение 15 - 20 мин. При смешивании гемолизин вливают во взвесь
физиологический раствор - 0,85-процентный раствор химически чистого хлорида натрия в
дистиллированной воде рН = 7,3 - 7,4 или физиологический раствор, содержащий ионы магния и
кальция (см. Приложение N 2, п. 2).
Рабочие разведения всех компонентов для РСК или РДСК готовят перед постановкой реакции
и проверяют их на антикомплементарность и гемотоксичность по следующей схеме:
¦ Комплемент в разведении ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ - ¦ - ¦ -
¦ Гемолизин в рабочем титре ¦ 0,2 ¦ - ¦ 0,2 ¦ - ¦ -
¦ Антиген в рабочем титре ¦ 0,4 ¦ - ¦ - ¦ 0,4 ¦ -
¦ Эритроциты (2,5% или 3%) ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2
¦ Физиологический раствор ¦ - ¦ 0,6 ¦ 0,6 ¦ 0,2
¦ водяная баня 10 минут при 37 -
¦ Результат: гемолиз полная задержка
В реакциях используют компоненты, не обладающие антикомплементарными и
4.3.3. Постановка реакции связывания комплемента.
Реакцию проводят в водяной бане при 37 - 38 °С в объеме 1 мл (по 0,2 мл каждого компонента -
сыворотки, антигена, комплемента, гемолизина и эритроцитов).
Перед постановкой главного опыта проводят титрование комплемента в бактериолитической
системе на позитивной (бруцеллезной) сыворотке, негативной сыворотке крови того вида животных,
которых исследуют, и одной сыворотке, взятой из исследуемой партии.
Каждую сыворотку разводят 1:5 физиологическим раствором (1 мл сыворотки + 4 мл
физиологического раствора), инактивируют, как указано в подпункте 4.3.2, и разливают по 0,2 мл в
два ряда по 10 пробирок. Затем в пробирки каждого ряда вносят комплемент (разведенный 1:20) в
возрастающих дозах от 0,02 мл до 0,2 мл с интервалом 0,02 мл и недостающее до 0,2 мл (в каждой
пробирке) количество физиологического раствора.
После разлива комплемента в первый ряд пробирок с каждой сывороткой вносят по 0,2 мл
антигена в рабочем разведении, а во второй ряд - по 0,2 мл физиологического раствора. Пробирки
ставят в водяную баню при 37 - 38 °С на 20 мин. Затем во все пробирки добавляют по 0,4 мл
гемолитической системы, встряхивают их и вновь ставят в водяную баню на 20 мин., после чего
Схема титрования комплемента в бактериолитической системе (на примере негативной
Читайте также: