Среда карташова для стрептококков
Таблица 6 - Экология и патогенные свойства стрептококков
Лабораторная диагностика стрептококкозов
Ранее в род Streptococcus включали пиогенные стрептококки, энтерококки и молочнокислые стрептококки, которые в настоящее время отнесены соответственно в самостоятельные роды Streptococcus, Еnterococcus и Lactococcus. В данном разделе рассматриваются вопросы лабораторной диагностики болезней, вызываемых видами родов Streptococcus и Еnterococcus.
Виды рода Streptococcus имеют клетки сферические или овальные, диаметром 0,5-2 мкм, при росте в жидкой питательной среде клетки парные или в виде цепочек. Клетки грамположительные, неподвижные, неспорообразующие, иногда имеют капсулу. Факультативные анаэробы, каталазоотрицательные, растут в диапазоне температур 25-45° С.
| Вид стрептококка | Естественная среда обитания | Вызываемая патология |
| S. рneumoniае ' | Верхние дыхательные пути | Септицемия, воспаление суставов, при подостром течении пневмония, воспаление кишечника у телят, ягнят, реже у поросят |
| S. руoqenes | Верхние дыхательные пути | Иногда маститы у коров, лимфангит жеребят |
| S. equi sudsp. equi | Миндалины лошадей | Лошади - маститы, мыт |
| S. equi sudsp . equisimilis | Вагина и кожа лошадей | Маститы, эндометриты лошадей |
| S. equi zooepidemicus | Слизистые и кожа свиноматок, овец, кур, вагина и кожа лошадей | Крупный рогатый скот - маститы и метриты; свиньи — септицемия и артриты у 1-3-недельных поросят; ягнята- пневмонии; птица — септицемия; лошади - аборты, маститы, пневмонии |
| S. agalactiae | Молочные каналы | Крупный рогатый скот, овцы, козы - маститы; собаки - септицемия щенков; кошки - маститы |
| S. dysagalactiae | Гениталии и носовая полость крупного рогатого скота, овец | Крупный рогатый скот - маститы, эндометриты; ягнята - полиартриты |
| S. dysagalactiae equisimilis | Вагина и кожа лошадей | Лошади - эндометриты, маститы |
| S. porcinus | Слизистые свиней | Свиньи - лимфадениты поросят |
| S. suis mun | Носовая полость, миндалины свиней | Свиньи — артриты, менингиты, септицемия молодняка |
| S. uderis 2 | Миндалины, вагина, кожа крупного рогатого скота | Крупный рогатый скот — маститы |
| S. canis | Слизистые, генитальный тракт плотоядных | Плотоядные - септицемия новорожденных, поражения гениталиев, кожи |
| S. bovis, S. equines 2 | Кишечный тракт многих видов животных | Возбудители оппортунистических инфекционных болезней |
Патогенные свойства и экология патогенных стрептококков представлены в табл. 6.
Энтерококки (Е. faecalis, E. faecium, E. durans) обитают в кишечном тракте многих видов животных, могут быть причиной оппортунистических инфекций и септицемии у кур, маститов коров, инфекций мочевого тракта у собак, эндокардитов у ягнят и крупного рогатого скота.
Лабораторная диагностика стрептококкозов основана на результатах бактериологического исследования.
Бактериологическое исследование. Для исследования на стрептококковую инфекцию животных в лабораторию направляют кровь сердца, печень, селезенку, головной мозг и трубчатую кость. При пневмониях дополнительно берут кусочки легкого на границе здоровой и пораженной тканей, средостенные лимфатические узлы, при артритах - синовиальную жидкость. Трупы мелких животных доставляют целиком. В случае маститов направляют секрет пораженной доли вымени, эндометритов — содержимое влагалища, взятое при помощи стерильных тампонов.
Учитывая малую устойчивость возбудителя материал должен быть доставлен не позднее 6 часов после гибели или убоя животного при условии транспортировки его в термосе со льдом (4-6°С). При более высокой температуре срок доставки материала не должен превышать 2-3 часа.
Микроскопическое исследование исходного материала. Готовят мазки, окрашивают по Граму, при подозрении на наличие капсулообразующих стрептококков препараты окрашивают на капсулы по Романовскому-Гимза, Ольту и др. Мазки из молока можно окрашивать по Граму, используя методы, нивелирующие присутствие жира и белка.
Клетки S. рneumoniае в окрашенных препаратах овальные или сферические, размером 0,5-1,25 мкм, обычно парные, причем соприкасающиеся стороны клеток уплощены, а наружные вытянуты и заострены (ланцетовидный диплококк). Также клетки могут располагаться одиночно, короткими цепочками, окружены капсулой.
Клетки S. equi сферической или овальной формы, размером
0,6-1,0 мкм, располагаются одиночно, парами, короткими цепочками, в мазках из гноя в виде длинных цепочек, имеют капсулу.
Клетки S. agalactiae (S. dysagalactiae) сферические, размером 0,6-
1,2 мкм, чаще располагаются в виде коротких или средней длины цепочек.
Клетки S. руoqenes сферические, размером 0,5-1,0 мкм, в виде коротких или длинных цепочек (в бульоне длинные цепочки). Энтерококки имеют овальную форму, размер 0,6-2,0х0,6-2,5 мкм, располагаются парами или короткими цепочками.
Результаты микроскопического исследования, с учетом полиморфизма бактерий на фоне лекарственной терапии, имеют ориентировочное диагностическое значение.
Культивирование. Стрептококки - факультативные анаэробы. Исследуемый материал высевают на кровяной, глюкозо-кровяной агар (кровь барана или крупного рогатого скота), глюкозо-сывороточный МПБ (рН 7,4-7,8). Контаминированный материал засевают на селективные среды: агар с антибиотиками, азидом натрия; образцы молока целесообразно высевать на среду Эдварда для выявления гемолиза и гидролиза эскулина.
Для обнаружения энтерококков используют специальные селективные среды: молочно-полимиксиновая среда Калины, желчно-кровяной агар Беленького и др. Посевы инкубируют при 37-38° С в течение 24-
48 часов.
Характер роста стрептококков на питательных средах. На глюкозо-кровяном агаре стрептококки в основном растут в виде мелких, прозрачных или слегка мутноватых колоний с ровными краями, как правило окруженных зоной гемолиза. Различают α- и β-гемолитические стрептококки.
Гемолиз типа α-: неполный гемолиз, часто с зеленоватым оттенком за счет перехода гемоглобина в метгемоглобин, далее обычно находится узкая зона β -гемолиза.
β -гемолиз - полный гемолиз эритроцитов. Отсутствие разрушения эритроцитов и гемоглобина обозначают как γ-гемолиз. Гемолитическая активность различных видов стрептококков представлена в табл. 7.
Номер патента: 326217
Текст
О П И С А Н И Е 3262 УИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Сокго Советскик Социалистическик РеспубликЗависимое от авт. свидетельстваЗаявлено 24.111,19 О ( 1418665/30-15с присоединением заявкиПриоритет Кл, С 121 т Номитет по делам аобретений н открытий прн Совете Министров СССР.616(088.8 ублнковано 19.1,каллетень4 Дата опубликования описания 1.111.1972 второбретени В. М. Карташова Всесоюзный научно-исследовательский институт ветеринарной санитарииявител И КАЦИ И ПАТО ГЕН Н Ы Х СТР ЕПТ 01(ОК В МОЛОКЕ КОЗ ДЛЯ льшеи чувсатогенныхи больны,льон (МПЬ) гато Изобретение относится к ветеринарии, среда предназначается для обнаружения и дифференциации патогенных стрептококков.Известна среда для индикации патогенных стрептококков в молоке, приготовленная на основе мясного питательного бульона, содержащая также индикатор, сульфат таллня и эскулин.Недостатком такой среды является дефицитность входящих в ее состав компонентов - эскулина и сульфата таллия, кроме того, на этой среде растут молочнокислые стрептококки группы Лг.-Яг, ЯегторИсв, 51 г.сгетоггз, 5 гг. 1 ггс 1 Ь и не растут 5 Й. группы А, Е и некоторые типы серогрушг В и С, а также рост мелких, бисерных колоний на плотной среде, с гемолизом и без него, не дает даже ориентировочной серогрупповой дифференциации стрептококков, а также. стафилококков. Микроскопия первичных посевов с плотных сред с целью дифференциации стрептококков от другой кокковой флоры тоже затруднительна, сомнительные колонии не всегда являются стрептококками. Гемолиз на кровяном агаре часто наблюдается от молока, содержащего бактериальные токсины.Это сильно усложняет работу и повышает ее трудоемкость.Целью изобретения является создание среды, обладающей элективными, дифференцирующими своиствами и бо твительностью для индикации п стрептококков в молоке здоровых х маститом коров.5 Предлагаемая среда обладает резко выраженными дифференцирующими свойствами, На ней не растут наиболее часто встречающиеся в молоке бактерии, кишечные инфекции, патогенные н ьсе патогенные стафилои кокки, молочнокислые палочки и стрептококкигруппы Лг, а также сноровые формы.Достигается это включением в среду следующих компонентов:Ыясо-пептонный бу 900 -1000,и г.Лактоза 4,5 - 6,0 г.Бромкрезолггурпур 1 спыртово-водгьый раствор 1: 100) 1,9 - 2,5 мл.Сыворотка крупного ро го скота или ло шадн 90 - 110 м,г.Неомнцин 45 - 51 едг,1 г,г среды.Для получения среды берут 1000 мл мясопептонного бульона с рН 7,5 - 7,8, добавляют 4,5 - 6 г лактозы н 1,9 - 2,5 м,г индикатора бромкрезолпурнура, осторожно смешивают и с 1 авят в холодную водяную баню, С момента кипения водяной бани отмечают время и ки.пятят в течение 5 - 10 мин, Смеси дают остыть до 50 - 56 С, добавляют сыворотку 90 - 110 мл о и 48 - 51 едггмг среды неомицина, Затем среду326217 Предмет изобретения Составитель Р. Махнюк Техред Л. Куклина Корректоры: А. Абрамова и В, ПетроваРедактор Н. спиридонова Заказ 345/18 1 Лзд. Ме 129 Тираж 448 ПодписноеЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССРМосква, Ж, Раушская наб д. 4/5 Типография, пр. Сапунова, 2 сразу разливают по пробиркам в стерильных условиях. Цвет среды фиолетово-синий.При росте стрептококков групп В, С, Е, А,6 среда изменяет цвет и становится лимонной, иногда с зеленоватым оттенком. Столбик среды обычно прозрачный, иногда наблюдается очень слабое нежное помутнение, осадок и часто пристеночный рост, При росте стрептококков группы Д (энтерококков) среда также приобретает лимонный цвет, но столбик ее имеет резкое диффузное помутнение, небольшой осадок и часто пленку.Для индикации патогенных стрептококков берут пробы молока от больных маститом или здоровых коров, высевают в пробирки со средой по 0,1 - 0,2 мл и ставят в термостат для инкубирования. Через 18 - 24 час производят учет реакции, Изменение цвета среды в лимонный или лимонно-зеленоватый свидетельствует о росте стрептококков. Сильное диффузное помутнение среды с изменением цвета в лимонный и осадок свидетельствует о росте стрептококков группы Д (энтерококков) . Прозрачный или слегка мутноватый столбик среды, осадок на дне пробирки, иногда пристеночный рост свидетельствуют 5 о росте стрептококков группы В или какойлибо другой группы (А, С, Е, Е, 6). 10 Среда для индикации патогенных стрептококков в молоке на основе мясо-пептонногобульона, отличающаяся тем, что, с цельюпридания элективных, дифференцирующихсвойств и повышения чувствительности, в ее15 состав входит:Мясо-пептонный бульон 900 - 1000 мл,Лактоза 4,5 - 6 г,Бромкрезолпурпур (спиртово-водный раствор 1:100) 1,9 - 2,5 мл.20 Сыворотка крупного рогатого скота или лош ади 90 - 110 мл,Неомицин 48 - 51 ед/мл среды.
Заявка
В. М. Карташова, Всесоюзный научно исследовательский институт ветеринарной
МПК / Метки
Код ссылки
Номер патента: 364668
. и другцс грамотрицателыыс протеолитические бактерии ооразуют колонии, цс отличающиеся от колонийбактерий группы кишечных палочек,Целью изобретения является создание питательной среды, ця которой можно Отделитькишсчцыс палочки от водцык сапрофитов изрода Асгогпоп;1 в,Г 1 реллагасмая пцтательцая среда дополниолоко и 1 рцсталлиссскиифиолетовый. Составленные компоненты взятыв соотношении: 0,01%-цьй водный растворкристаллического с 1 иолетового 1 - 2 ц,г, молоко 8 - 20 л,г ца 100 ц.г среды Э до. Оыть приготовлена из сукой среды аналогичного названия.Колонии бактерий группы кишечцытс палочек ца такой среде вырастают в виде круппы.; красцык с. металлическим блеском или без блеска, розовык, слизистык или оесцветнык колоний, а колошш.
Номер патента: 611933
. в горячуюсмесь дробными порциями добавляют сухойкристаллический двузамещенный фосфорнокислый натрий под контролем качественных проб на иов кальция и фосфаты-ион врастворе ао исчезновения положительнойреакции на кальций и появления слабо положительной рекацни на фосфат, Расход фос.фата составляет 8,1 г на 1 л концентрата Аминный азот 260 мг%Хлоридов в пересчетена хлор-ион 1,25%Фосфатов 20 мг%Сухих веществ 9%.В таком виде гидролизат пригоден дляиспользования в широкой бактериологическойпрактике в качестве основы для жидких иплотных питательных сред,В табл, 1 приведены данные роста патогенных микроорганизмов на полученнойоснове,навсего 120 г) рН смеси снижают до 9,3,оСмесь прогневают пои 70 С в течение15 мин и профильтровывают поа.
Номер патента: 904578
. пшеничные отруби 50,0-70,0;мел 5,0-5,5; ЛСУ 0,5-1,0; гуза-паиостальное,Кроме того, гуза-паи измельчаютдо размера частиц 0,1-5,0 мм, насыщают водой до полной влагоемкостии гидролиэуют целлюлозолитическимиферментами, а увлажнение пшеничныхотрубей, мела и ЛСУ проводят гидролизатом гуэа-паи.П р и м е р 1. Культивируют мицелий грибов РВепгоСцв авсгеа 1 цв ИАдаг 1 сцв Ь 1 врогцв на питательной серде, состоящей,вес.Ъ пшеничные отруби 70,0; мел 5,51 ЛСУ 0,5; гузапаи 24,0. Среду инокулируют О,ЗЪгрибницы и культивируют 24 ч в колбах на 750 мл.П р и м е р 2. Культивируют мицелий грибов, указанный в примере 1,на питательной среде, состоящей иэ,904578,Формула изобретения Составитель М.Дранишников,Редактор М.Товтин ТехредМ.Надь КорректорН.Швыдкая.
Номер патента: 1414316
. со всеми 24неподвижными слоями адсорбента. Этотклапан управляет добавлением и выведением исходного продукта, десорбента, промывочной среды, рафинатаи экстракта таким образом, что каждыйслой можно питать раздельными потоками десорбента, исходного продуктаипромывочной средыили же из каждогослоя можно выводить отдельные потоки 43164рафината, экстракта и промывочнойсреды путем поворота клапана.Проводят загрузку исходной смеси 58,2 мл/ч линолевой кислоты и 3,8 мл/чолеиновой кислоты в слой 9, Во времядобавления исходной смеси в слой 9,в слой 23 подают поток 1007 ацетона,со скоростью потока 186 мл/ч. Призагрузке исходной смеси и адсорбента в слои 9 и 23 из слоя 1 выводятрафинат со скоростью потока 38 мл/чи из слоя 16 - экстракт со.
Номер патента: 1497215
. что бластоцисты развиваются какйри 12-часовом, так ипри 24-часо-вом культивировании, причем рост является стабильным. Наилучшие результатыполучают при культивировании эмбрионов в среде 14, которая содержит4 мл желтка куриного яйца 2 мл ФБСДюльбекко и 4 мл стерилизованногокобыльего молока.Таким образом, устанавливают, чтовосьмисуточные лощадиные эмбрионы впериод 12-24 часового пребывания в 40культуральных средах, состоящих изсмеси желтка с кобыльим молокоми/или. Фосфатно-солевым буферным раствором Дюльбекко, продолжают интенсивно увеличиваться в размерах, 11 ри 45просмотре под микроскопом у большинства прокультивированных в этих средах зародышей не отмечают каких-либоотклонений от нормы. Клетки трофобласта и эмбриобласта четко.
Лабораторные методы исследования
1. Определение количества клеток в молоке
а) Метод Прескотта и Брида. Чистое предметное стекло кладут на лист бумаги, расчерченный на квадраты со стороной 1 см. Пробу молока (секрета) тщательно перемешивают, затем микропипеткой наносят на каждый квадрат предметного стекла 0,005 мл молока (секрета) и тщательно распределяют на площади квадрата. Мазок высушивают на воздухе, фиксируют метиловым спиртом или спирт-эфиром (лучше изобутиловым спиртом) в ванночке при вертикальном положении мазка, окрашивают 15-20 минут по Романовскому-Гимза (на 1 мл дистиллированной воды 1-2 капли краски). Вместо краски Романовского-Гимза можно окрашивать мазки по Ньюмансу раствором следующего состава: спирт абсолютный - 50 мл, хлороформ - 50 мл, ледяная уксусная кислота - 20 мл, фуксин основной - 0,1 г, метиленовая синь - 1 г.
Краски растворяют в смеси спирта и хлороформа, нагретой до 50°С. После охлаждения до комнатной температуры в раствор добавляют ледяную уксусную кислоту и выдерживают в течение 18 часов, а затем используют для окрашивания. После окрашивания препарат сушат и промывают трехкратно теплой водой (37-40°С). Мазок тщательно высушивают и просматривают под микроскопом.
В каждом мазке рассматривают по 100 полей зрения. Подсчитанное число клеток умножают на коэффициент для пересчета с учетом объектива и окуляра (для советского микроскопа МБ-1 при объективе 90 и окуляре 7 этот коэффициент равен 6260, при окуляре 10 - 10 200, при окуляре 15 - 33 200).
б) Камерный метод. Подсчету клеток в камере препятствуют жировые шарики, которые необходимо предварительно растворить синтанолом ДС-10.
К 100 мл 0,9%-ного раствора хлористого натрия добавляют 1% формальдегида, 12,5% этилового спирта и 1% синтанола ДС-10 и нагревают при 60°С в течение 20 минут. После растворения добавляют 1% насыщенного спиртового раствора основного фуксина и фильтруют через бумажный фильтр. В связи с тем, что при длительном хранении краситель из раствора выпадает, его добавляют к солюбилизирующему раствору непосредственно перед применением. Раствор солюбилизатора в герметическом сосуде сохраняется длительное время.
Для подсчета клеток в пробирки, содержащие 10 мл солюбилизирующего раствора с красителем, добавляют 0,1 мл молока, тщательно перемешивают и прогревают 30 минут на водяной бане при 80°С. После перемешивания каплю жидкости вносят под покровное стекло счетной камеры Фукса-Розенталя (при отсутствии последней можно использовать камеру Горяева, Тома, Предтеченского, Бюркера и т.д.). Подсчет клеток ведут под микроскопом при объективе 10Х-20Х. В поле зрения на прозрачном фоне видны четко прокрашенные клетки, легко поддающиеся подсчету.
2. Определение каталазы с помощью всплывания диска
Из хроматографической бумаги марки Ф-1 готовят диски диаметром 12 мм. Делают 3%-ный раствор перекиси водорода на 15 М фосфатном буфере pH 7,2 (готовят в день проведения пробы).
Анатомическим пинцетом захватывают бумажный диск и погружают его в тщательно смешанную пробу молока. Для удаления излишков молока диск поворачивают в вертикальное положение и, притрагиваясь к стенкам пробирки, как бы вытирают его. После этого диск погружают в раствор перекиси водорода, которого наливают 5 мл в пробирку размером 60х16 мм. Время, прошедшее от момента погружения диска в раствор до всплытия его на поверхность, отмечают по секундомеру.
При малом содержании клеток в молоке (до 100 тыс./мл) время всплытия диска равно 1-5 минутам, иногда больше.
При увеличении содержания лейкоцитов в молоке свыше 200 тыс./мл диск всплывает за 30-35 секунд. При заболевании маститом диск всплывает за 3-7 секунд или моментально. Данный метод определения каталазы можно использовать при проведении массовых исследований проб молока от коров непосредственно в хозяйствах.
3. Определение лизоцима молока
Из каждой четверти вымени в конце доения в стерильные пробирки надаивают по 5-10 мл молока. На подсушенный МПА (pH 7,2) в чашках Петри (по одной на каждую корову) высевают суточную бульонную культуру золотистого стафилококка штамма ВМ. Для этого культуру разводят физиологическим раствором 1:10 000, по 0,3-0,4 мл равномерно распределяют на агаре в чашках и оставляют на 30-40 минут на горизонтальной поверхности. В агаре каждой чашки делают 4 луночки диаметром 10 мл (пробочником N 5). В каждую луночку вносят стерильной пипеткой по 0,1 мл (2 капли) молока. Чашки выдерживают при комнатной температуре (18-22°С) 18 часов, а затем помещают в термостат на 5-6 часов. Если молоко содержит лизоцим М, то вокруг луночки наблюдается задержка роста стафилококков в виде кольца. По диаметру кольца задержки роста микроба определяют титр лизоцима в молоке. Задержка роста меньше 16 мм - молоко от коровы, больной маститом, 17-24 мм - сомнительное, более 25 мм - от здоровой коровы.
Для выявления и дифференциации основных возбудителей маститов необходимо проводить бактериологическое исследование секрета вымени.
Молоко (секрет) для бактериологического исследования отбирают непосредственно после доения в стерильные флаконы или пробирки с ватными пробками с соблюдением правил асептики. Для этого перед взятием молока (секрета) вымя подмывают и вытирают чистым полотенцем. Соски коровы и руки доярки протирают ватным тампоном, смоченным 70%-ным денатурированным спиртом. Нельзя допускать, чтобы сосок касался края посуды. Пробы отправляют в ветеринарную лабораторию, где их исследуют:
1) на чувствительность микрофлоры молока (секрета) к антибиотикам;
2) на наличие основных возбудителей мастита (патогенных стафилококков и агалактийного стрептококка).
Определение чувствительности микрофлоры молока к антибиотикам
Исследуемое молоко с соблюдением стерильных условий разливают по 2 мл в стерильные пробирки. Пробирок должно быть на две больше, чем дисков с антибиотиками.
В одной из пробирок определяют реакцию (pH) молока и добавляют в него 0,1 мл бромтимолблау (раствор бромтимолблау готовят так же, как и для диагностики маститов). В зависимости от pH молока смесь окрашивается от желтого (кислое молоко), салатного, зеленого до синего (щелочное молоко) цвета. Записав результат (цвет смеси), данную пробу исключают из опыта. В оставшиеся пробирки (кроме одной) добавляют по одному диску того или иного антибиотика.
Все пробирки с молоком выдерживают при 37°С в течение 18-20 часов в термостате или автоматически регулируемой водяной бане, после чего во всех пробирках проверяют кислотность молока раствором бромтимолблау.
Если кислотность молока в пробирке без антибиотиков до опыта и после выдерживания в течение 18-20 часов в термостате одинакова, патогенных бактерий в молоке нет. При наличии микрофлоры кислотность молока в пробирке без антибиотиков после выдерживания в термостате увеличивается. В этом случае проверяется кислотность молока в пробирках с антибиотиками.
Если кислотность молока с тем или иным антибиотиком (после выдерживания в термостате) не выше первоначальной (до выдерживания в термостате), значит, бактерии, находящиеся в молоке, высокочувствительны к данному антибиотику. Наоборот, если кислотность молока в пробирках с антибиотиками после выдерживания в термостате увеличивается, из этого следует, что находящиеся в молоке бактерии устойчивы к данному антибиотику, причем чем выше кислотность молока, тем устойчивее микроорганизмы.
Исследование молока (секрета) на наличие патогенных стафилококков и агалактийных стрептококков
Доставленные в лабораторию пробы молока (секрета) после смешивания высевают по 0,1 мл на мясопептонный агар, содержащий 5% отмытых эритроцитов барана (коровы), или на элективные среды: мясопептонный агар, содержащий 7,5% поваренной соли и 5% отмытых эритроцитов барана (коровы), для выделения стафилококков и среду В.М. Карташовой для индикации стрептококков. При отсутствии элективных сред можно использовать только 5%-ный кровяной МПА.
Для получения изолированных колоний 1-2 капли секрета наносят на край пластинки питательной среды в чашке Петри и растирают его по всей пластинке шпателем (согнутая над пламенем пастеровская пипетка). Засеянные чашки (крышкой вниз) выдерживают при температуре 37°С в течение 24 часов. Если на чашках получена однородная по морфологии популяция, для дальнейшего исследования достаточно брать по одной колонии с чашки. Если колонии на чашке различны по форме, размерам, окраске, типу гемолиза, следует брать по одной колонии каждого образца. Отобранные колонии отсевают и подвергают дальнейшему исследованию.
Исследование на наличие стафилококков. Большие и средние колонии белого, кремового и лимонно-желтого цвета, образующие хорошо выраженную зону гемолиза эритроцитов на кровяном агаре или на кровяно-солевом агаре, отсевают в пробирки, содержащие 3 мл мясопептонного бульона (лучше предварительно подогретый в термостате), и выращивают при температуре 37°С в течение 3 - 3 1/2 часов до помутнения.
Выросшие молодые бульонные культуры окрашивают по Граму и микроскопируют. При обнаружении стафилококков определяют их патогенные свойства реакцией плазмокоагуляции, лизоцимную и дезоксирибонуклеазную (ДНК-азной) активность и отношение к манниту, из которых реакции плазмокоагуляции и гемолиза строго обязательны.
Кровяно-солевой агар готовят следующим образом. Готовый (стерилизованный в автоклаве) МПА, содержащий 7,5% хлористого натрия, растапливают и охлаждают до 45°С. Прибавляют 5% отмытых эритроцитов барана или крупного рогатого скота, осторожно перемешивают, чтобы не образовывалось пены, и разливают в чашки Петри. Среду можно хранить в холодильнике в течение нескольких дней.
Реакция плазмокоагуляции служит основным методом определения патогенных стафилококков. Для этого кровь, взятую из сердца кролика, выливают в пробирку со стерильным раствором лимоннокислого натрия и центрифугируют.
Полученную плазму разводят стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:4 и разливают в агглютинационные пробирки по 0,5 мл. 12-18-часовую бульонную культуру испытуемого стафилококка вносят по 2 капли в пробирки с разведенной плазмой. Для контроля в одну пробирку с плазмой не вносят культуры, а в другую засевают заведомо плазмокоагулирующий стафилококк. Пробирки помещают в термостат при 37°С и через каждый час в течение 3 часов учитывают результаты. При положительной реакции образовавшийся сгусток не выпадает из пробирки даже при переворачивании или плавает в плазме.
Кроме того, для выявления патогенных стафилококков применяют и другие методы.
Определение лизоцимной активности стафилококков. В качестве тест-культуры используют взвесь живой или убитой 15-минутным кипячением культуры Micrococcus lysodeicticus. Преимущество использования убитой культуры в том, что в этом случае можно пользоваться стандартным препаратом (взвесь убитых микробов можно хранить в холодильнике в течение месяца и более).
В пробирки с 15 мл растопленного и охлажденного до 50°С 0,7%-ного агара, приготовленного на переваре Хоттингера, вносят взвесь убитой культуры микрококка из расчета 1 млрд микробных клеток на 1 мл среды (по оптическому стандарту). При использовании живой культуры на 1 мл среды добавляют 100 млн микробных тел. Содержимое пробирок выливают в чашки Петри и на поверхность застывшего и подсушенного агара бляшками (размазанная петлей капля) наносят 3-4-часовые бульонные культуры испытуемых штаммов стафилококков. На одной чашке можно испытать 7-8 штаммов.
После инкубации посевов в течение суток при 37°С вокруг бляшек с ростом культур, продуцирующих лизоцим, появляются зоны лизиса, которые значительно увеличиваются после дополнительного пребывания посевов при комнатной температуре в течение 48 часов.
Определение дезоксирибонуклеазной (ДНК-азной) активности стафилококков. К 150 мл расплавленного стерильного готового 2%-ного МПА (pH 8,6) добавляют 300 мг дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), то есть 2 мг/мл, предварительно растворенной в 15 мл подщелоченной 3 каплями 10%-ного раствора едкого натра дистиллированной воды. После перемешивания среду прогревают в течение 1/2 часа в кипящей бане. К немного остывшей среде добавляют 1,2 мл 10%-ного стерильного хлористого кальция, разливают в чашки, подсушивают и засевают бульонными культурами (штрихами). После 18-часовой инкубации при 37°С поверхность чашки заливают 7 мл 1 н. HCl, выдерживают 15 минут, сливают кислоту и учитывают результаты. Появление зон просветления (деполимеризация ДНК) вокруг культур указывает на положительную ДНК-азную реакцию.
Определение отношения к манниту. 3-4 капли испытуемой бульонной культуры стафилококка засевают в пробирку со средой, содержащей 0,5% маннита. В качестве такой среды можно использовать полужидкий агар с индикатором ВР (готовые, сухие среды) или жидкую среду с индикатором Андредэ. Изменение цвета индикатора после 24-часового инкубирования в термостате указывает на ферментацию маннита.
Исследование молока (секрета) на наличие патогенных стрептококков. При учете роста колоний на чашках Петри с кровяным или сывороточным агаром (второй день исследования) отсевают росинчатые мелкие однотипные колонии, характерные для роста стрептококков, на элективную питательную среду для стрептококков (среда В.М. Карташовой), которая готовится следующим образом: к 500 мл МПБ с pH 7,2-7,3 добавляют 2,5 г лактозы, 1 мл спиртового или водного раствора 1:100 бромкрезолпурпура (1 г порошка растворяют в 50 мл спирта и добавляют 50 мл дистиллированной воды). Затем МПБ ставят в водяную баню, доводят до кипения и кипятят 5-7 минут. После остывания до 50-55°С в колбу добавляют 50 мл стерильной сыворотки без консерванта и 0,5 мл раствора неомицина, в котором содержится 25 000 ЕД антибиотика (500 000 ЕД неомицина растворяют в 10 мл физиологического раствора). В стерильных условиях среду разливают по 5 мл в пробирки. Цвет ее сине-фиолетовый. Посевы инкубируют в течение 24 часов при 37°С.
Изменение сине-фиолетового цвета среды в лимонный или желто-зеленый указывает на рост стрептококков. Из пробирок с измененным цветом среды готовят мазки и окрашивают по Граму. При наличии стрептококков проводят их дальнейшую дифференциацию с помощью КАМП-теста.
Постановка КАМП-теста. Суточную культуру бета-гемолитического стафилококка высевают на агар с 5% крови крупного рогатого скота или барана. Посев делают петлей сплошной линией по диаметру чашки. Перпендикулярно к линии посева стафилококка, не доходя 5-6 мм, высевают ровным штрихом испытуемую культуру стрептококков. На одной чашке можно проверить 8-10 культур. Чашки помещают в термостат на 24 часа при 37°С. КАМП-тест считается положительным, если четко выражен гемолиз испытуемого стрептококка в виде усеченного треугольника или полукруга в зоне бета-гемолитического стафилококка.
Положительный КАМП-тест дают только агалактийные стрептококки. На этих же чашках кровяного агара учитывают и тип гемолиза стрептококков. Светлая зона вокруг штриха культуры стрептококков указывает на бета-гемолиз, зеленая зона - на альфа-гемолиз (зеленящие стрептококки).
Для дифференциации непатогенных стрептококков (группа D-фекальные стрептококки и группа N-молочнокислые стрептококки) делают высевы на бульон с 6,5% хлористого натрия, на бульон с 40% желчи крупного рогатого скота и на стерильное обезжиренное молоко с добавлением метиленовой сини 1:1000 (на 5 мл молока 0,5 мл 1%-ного раствора метиленовой сини). Посевы инкубируют в термостате при 37°С и на другой день проводят учет по следующей схеме:
Читайте также: