Тест-системы пцр на сибирскую язву
1. ВВЕДЕНИЕ.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
2.1. Эпизоотическая ситуация по сибирской язве.
2.2. Общая характеристика возбудителя сибирской язвы.
2.3. Патогенез и клинические проявления болезни
2.4. Характеристика природных плазмид бацилл.
2.5. Диагностика сибирской язвы
2.6. Применение реакции латексагглютинации в диагностике инфекционных болезней.
2.7. Идентификация возбуди теля сибирской язвы на основе
анализа генома.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Материалы.
3.1.1. Штаммы
3.1.2. Ферменты.
3.1.3. Реактивы
3.1.4. Растворы и питательные среды
3.1.5. Животные
3.1.6. Лабораторное оборудование.
3.2. Методы
3.2.1. Выращивание бактерий
3.2.2. Определение культуральноморфологических свойств
возбудителя сибирской язвы
3.2.3. Выделение хромосомной ДНК.
3.2.4. Электрофорез ДНК и полипептидов.
3.2.5. Иммуноблоттинг
3.2.6. Постановка полимеразной цепной реакции
3.2.7. Постановка реакции латекс агглютинации
3.2.8. Серологические исследования.
3.2.9. Компьютерный анализ, сравнение первичных структу р
нуклеиновых кислот и расчет олигонуклеотидов
4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
4.1. Идентификация сибиреязвенных штаммов методом полимеразной цепной реакции
4.1.1. Разработка ПЦР для индикации возбудителя сибирской язвы.
4.1.1.1. Выявление капсулообразующих штаммов возбудителя сибирской язвы методом ПЦР.
4.1.1.2 Выявление возбудителя сибирской язвы методом ПЦР
на основе праймеров, комплементарных гену токсина
4.2. олучение растворимых антигенов Вас. апШгааз.и изучение их
специфической активности.
4.3. Разработка реакции латексагглютинации для выявления специфических антител и антигенов к возбудителя сибирской язвы.
4.3.1. Получение очищенных антигенов и
4.3.2. Отработка реакции латексагглютинации для выявления специфических антител к возбудителя сибирской язвы .
4.3.3. Отработка реакции латексагглютинации для дифференциации бацилл
4.4. Изучение возбудителя сибирской язвы, выделенного из органов павших животных и проб почв.
4 .4.1. Биологические свойства полевого изолята сибирской язвы.
4.4.2.Изучение диагностической ценности ПЦР для выявления ДНК
возбудителя сибирской язвы в пробах почвы скотомог ильника
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
6. ВЫВОДЫ
7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
9. ПРИЛОЖЕНИЕ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИИ
АТ антитело
агар КД сухая питательная среда на основе ферментативного гидролизата кормовых дрожжей
а.о. аминокислотный остаток
ГВП гииервариабельпые повторы
дсн додецилсульфат натрия
ДПС жидкая споруляциоиноростовая среда на основе пептона и дрожжевого экстракта
ед. единица
ИФА иммуноферментный анализ
КРС крупный рогатый скот
ЛФ летальный фактор, компонент сибиреязвенного токсина
МонАТ моноклональные антитела
МПБ мясопептонный бульон
МППБ мясопептонный печеночный бульон под вазелиновым маслом
МПА мясопептонный агар
н. нуклеотид
НК нуклеиновая кислота
ОРС открытая рамка считывания
ОФ отечный фактор, компонент сибиреязвенного токсина
ПААГ полиакриламидный гель
п.о. пар оснований
ПДРФ полиморфизм длин рестрикционных фрагментов
ПЦР полимеразная цепная реакция
ПА протективный антиген, компонент сибиреязвенного токсина
РАЛ реакция агглютинации латекса
РИГА реакция непрямой гемагглютинации
РНК рибонуклеиновая кислота
РП реакция преципитации
СВК среда для выделения и культивирования сибиреязвенного микроба
т.п.о. тысяч пар оснований
трис трис гидроксиметил амином етан
ФСБ фосфатносолевой буфер
ЭДТА этилендиамин тетраацетат
сШТР дезоксинуклеозидтрифосфат
ЬВ среда ЛурияБертана.
1. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность
Продолжительный и комплексный характер исследований при идентификации предназначен для исключения диагностических ошибок, которые могут иметь место изза таксономической схожести представителей рода i, когда отдельные идентификационные критерии различных видов бацилл могут совпадать. Достоверным отличительным признаком вирулентных штаммов . Однако постановка биопробы это наиболее продолжительный по времени и не всегда доступный идентификационный тест, а, кроме того, этот метод не позволяет идентифицировать бескапсульные штаммы возбудителя. Длительность, трудоемкость, недостаточная специфичность и чувствительность применяемых в настоящее время методов заставляет исследователей обратить особое внимание на разработку и внедрение в ветеринарную практику новых высокочувствительных и специфичных методов диагностики возбудителя сибирской язвы, основанных на анализе генома и антигенных детерминант, позволяющих надежно выявлять возбудитель в объектах ветеринарного надзора. Нуклеотидные последовательности генов, связанных с патогенностью бактерий, используются при разработке ПЦРдиагностикумов. Исследования в области молекулярной биологии сибиреязвенного микроба показали присутствие в клетках вирулентных штаммов плазмид с молекулярной массой и 0 МДа, на которых локализованы гены двух факторов патогенности капсул ообразования и трехкомпонентного токсина, соответственно. Эффективные диагностические препараты при сибирской язве могут быть созданы путем разработки серологических методов, основанных на использовании протективного антигена или его иммуногеиных доменов, а применение генетического маркирования детерминант сибиреязвенного токсина живых бактериальных вакцин позволит, в перспективе, разработать лабораторные тесты позволяющие дифференцировать вакцинные штаммы от вирулентных и авирулентных изолятов Вас. Таким образом, указанные обстоятельства свидетельствуют о необходимости изучения структурнофункциональной организации генома и разработки чувствительных и специфичных тестсистем на основе методов клеточной биотехнологии и генной инженерии для выявления возбудителя сибирской язвы, позволяющих дифференцировать его от других непатогенных представителей рода бацилл, особенно при изучении атипичных и смешанных культур, выделенных из проб почвы. Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы являлась разработка тестсистем для идентификации возбудителя сибирской язвы и определение их значимости при проведении диагностических исследований на сибирскую язву. Бурятии и оценить пригодность ПЦР для идентификации возбудителя сибирской язвы. Научная новизна работы. Разработана чувствительная и специфичная тестсистема на основе ПЦР с использованием праймеров, комплементарных нуклеотидным последовательностям плазмид, определяющих вирулентные свойства и определены оптимальные условия ее проведения при выявлении ДНК возбудителя сибирской язвы. Изучен в сравнительном аспекте полипептидный состав растворимых антигенов вакцинного штамма ВНИИВВиМ и В. Установлено, что полипептидный состав антигенов, выделенных из вегетативных клеток и спор, а также из культуральной жидкости различаются между собой в зависимости от состава питательной среды и времени культивирования. При изучении культуральноморфологических свойств и проведении исследований с помощью ПЦР бацилл, выделенных из проб почв скотомогильника в местности Иркана Северобайкальского района Республики Бурятия, установлена изменчивость вирулентных свойств у выделенных сибиреязвенных штаммов. Практическая значимость работы. Разработана тестсистема на основе ПЦР для обнаружения фрагментов ДНК генов протективного антигена и капсульного оперона, пригодная для идентификации возбудителя сибирской язвы и дифференциации вирулентных капсулообразуюших штаммов от бескапсульных вакцинных штаммов. Разработанная тестсистема может быть использована в качестве сигнального метода при исследовании смешанных культур микроорганизмов, выделяемых из проб патологического материала, почвы, воды при подозрении на сибирскую язву.
Диагностические препараты и тест-системы, используемые при проведении лабораторной диагностики сибирской язвы
Номер регистрационного удостоверения
Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие сибиреязвенные неадсорбированные сухие, лиофилизат (для диагностических целей)
РП N 247-97 ФС 42-3640-98 (до 2003 г.)
ФГБУ "НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи"
123098, г. Москва,
Тел.: (499)193-30-50; 190-44-59
Альбумин бычий или бараний меченный родамином сухой
Набор реагентов для иммунохроматографического экспресс- выявления и идентификации спор возбудителя сибирской язвы (ИХ-тест В. anthracis)
142279, Московская область, Серпуховский район, п. Оболенск
Тел./факс: (4967) 36-00-20
Диагностический фаг-тест-набор для идентификации сибиреязвенного возбудителя (Фаг-тест-набор "Оболенск RI")
142279, Московская область, Серпуховский район, п. Оболенск
Тел./факс: (4967) 36-00-20
Тест-система для выявления ДНК В. antracis рХ01 + методом ПЦР (Ген-Сиб)
ФСР 2007/00101 от 25.05.2007
410005, г. Саратов, ул. Университетская, д. 46
Набор реагентов для выявления ДНК Bacillus anthracis в биологическом материале и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме "реального времени" "Ампли-Сенс Bacillus anthracis-FRT"
ФСР 2008/02417 от 09.04.2008
ФБУН ЦНИИ эпидемиологии, ООО "Интерлабсервис" 119021, г. Москва, Олсуфьевский переулок, д. 8, стр. 1
ФКУЗ РосНИПЧИ "Микроб"
410005, г. Саратов, ул. Университетская, д. 46
Незарегистрированные и разрабатываемые препараты (используются лабораториями территориального и регионального уровней только после регистрации)
Набор реагентов для иммунохроматографического экспресс-выявления и идентификации вегетативных клеток возбудителя сибирской язвы (ИХ тест-полоска В. anthracis)
Экспериментально-производственные серии, будут сертифицированы в ближайшее время
142279, Московская область, Серпуховский район, п. Оболенск
Тел.: (4967) 36-00-09
Тел./факс: (4967) 36-00-20
Иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные соматические адсорбированные флюоресцирующие сухие
Экспериментально-производственные серии, будут сертифицированы в ближайшее время
355035, г. Ставрополь, ул. Советская, 13-15
Тел./факс: (8652) 26-40-39
Иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные споровые адсорбированные флюоресцирующие сухие
Экспериментально-производственные серии, будут сертифицированы
355035, г. Ставрополь, ул. Советская, 13-15
Тел./факс: (8652) 26-40-39
Бактериофаг Fah-ВНИИВВиМ сибиреязвенный диагностический
ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии 601120, г. Покров Петушинского района Владимирской области
Тел.: (49243) 6-21-25; 6-10-82
Факс: (49243) 6-21-25; 6-13-85; 6-10-56
E-mail: VNIIVViM@ niiv.petush.elcom.ru
Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий
355035, г. Ставрополь, ул. Советская, 13-15
Тел./факс: (8652) 26-40-39
Диагностикум эритроцитарный сибиреязвенный антигенный сухой
ФКУЗ Волгоградский НИПЧИ,
400131, г. Волгоград, ул. Голубинская, 7
Диагностикум эритроцитарный сибиреязвенный имммуноглобулиновый сухой
ФГУ "48 ЦНИИ МО РФ"
610000, г. Киров, Октябрьский пр., 119
Сыворотка преципитирующая сибиреязвенная
302501, Орловская область, Орловский район, п. Биофабрика, ФГУП "Орловская биофабрика"
| > Антибактериальные препараты, используемые при проведении лабораторной диагностики сибирской язвы для приготовления селективных. |
| Содержание Методические указания МУК 4.2.2941-11 "Порядок организации и проведения лабораторной диагностики сибирской язвы для лабораторий. |
Откройте актуальную версию документа прямо сейчас или получите полный доступ к системе ГАРАНТ на 3 дня бесплатно!
Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.
480 руб. | 150 грн. | 7,5 долл. ', MOUSEOFF, FGCOLOR, '#FFFFCC',BGCOLOR, '#393939');" onMouseOut="return nd();"> Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья
Автореферат - бесплатно , доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников
Конвисарев, Андрей Петрович. Разработка тест-систем на основе ПЦР и латекс-агглютинации для идентификации возбудителя сибирской язвы : диссертация . кандидата биологических наук : 03.00.23.- Щелково, 2000.- 106 с.: ил. РГБ ОД, 61 01-3/321-4
Введение к работе
1. 1.1. Актуальность темы
Среди болезней, продолжающих наносить значительный ущерб
ивотноводству, а также представляющих угрозу жизни и здоровью
гловеку, важное место принадлежит зооантропонозным инфекциям
, прежде всего,' сибирской язве. Снижение числа неблагополучных
унктов - результат усиления общих противоэпизоотических меро-
риятий, проводимых' в очагах инфекции, и, главным образом, раз-
аботки и внедрения в практику более эффективных вакцин, а еже-
эдная регистрация спорадических случаев обусловлена биологиче-
кими особенностями возбудителя (самостоятельный паразитиче-
кий вид сохранивший свойства сапрофитов), что придает сибир
кой язве характер почвенно-очаговой инфекции, носящей стацио-
арный характер, которая раз возникнув в какой-либо местности
кореняется, сохраняя ..на многие десятилетия угрозу повторных
спышек. ; ,>
Для России указанная болезнь также остается чрезвычайно шасной и требует постоянного внимания, так как несмотря на зна-ійт'ельньїе успехи в деле предупреждения и искоренения сибирской звы в России, в последние годы прослеживается тенденция к обострению эпизоотической и эпидемической ситуации, что связано с 'сложнившимися хозяйственно-экономическими условиями ведения
1«
кивотноводства, особенно при круглогодовом отгонно-пастбищном
ІІ -
«держании животных (Н.Г. Ипатенко, 1998; И.А. Ургуев, 1999; И.А
Увеличение в отдельных пунктах числа животных, заболевши и павших от сибирской язвы, обусловлено запоздалой постановко диагноза и не своевременным проведением профилактических м( роприятий, что является результатом роста числа мелких ферм увеличения поголовья в личных подворьях, где животных иногда н вакцинируют против сибирской язвы.
В настоящее время для выявления и идентификации возбуді^ теля сибирской язвы широко используют серологические, биохимк ческие, микробиологические методы, определение чувствительнс сти к различным антибиотикам и бактериофагам, а также постаної ку биопробы на лабораторных животных. Продолжительный комплексный характер исследований при идентификации предш значен для исключения диагностических ошибок, которые могу иметь место из-за таксономической схожести представителей рс да Bacillus.
Длительность, трудоемкость, недостаточная специфичность чувствительность применяемых в настоящее время методов застаЕ ляет исследователей обратить особое внимание на разработку и вш дрение в ветеринарную практику новых высокочувствительных специфичных методов диагностики возбудителя сибирской язвь основанных на анализе генома и антигенных детерминант, позве ляющих надежно выявлять возбудитель в объектах ветеринарноп надзора.
Эффективные диагностические препараты при сибирской язв могут быть созданы и на основе разработки серологических мето дов с использованием препаратов очищенного протективного анги
єна или его иммуногенных доменов, а применение генетического іаркирования детерминант сибиреязвенного токсина живых бакте-іиальньїх вакцин позволит, в перспективе, разработать лаборатор-іьіе тесты, позволяющие дифференцировать вакцинные штаммы от іирулентньїх и авирулентных изолятов Вас. anthracis, а также дру-их непатогенных бацилл.
Таким образом, указанные обстоятельства свидетельствуют о [еобходимости изучения структурно-функциональной организации енома и разработки чувствительных и специфичных тест-систем іа основе методов клеточной биотехнологий и генной инженерии [ля выявления возбудителя сибирской язвы, позволяющих диффе-іенцировать его от других непатогенных представителей рода ба-іилл, особенно при изучении атипичных и смешанных культур, вы-іеленньїх из проб почвы.
1.2. Цель и задачи исследования
Основной целью данной работы являлась разработка тест-истем для идентификации возбудителя сибирской язвы и определе-іие их значимости при проведении комплексных диагностических ісследований на сибирскую язву.
Для достижения указанной цели необходимо было решить сле-[ующие задачи:
- выбрать праймеры для избирательной амплификации различных участков генома и оптимизировать условия постановки ПЦР для об-«ружения фрагментов генома возбудителя сибирской язвы;
отработать условия получения концентрированных, очищеннь антигенов возбудителя сибирской язвы и оптимизировать услові постановки латекс-агглютинации для обнаружения специфическі антигенов и антител при сибирской язве;
изучить морфологические, культуральные и патогенные свойс ва культур микроорганизмов, выделенных из патматериала и прс почв скотомогильников в Бурятии и оценить пригодность ПЦР ДО идентификации возбудителя сибирской язвы.
1.3. Научная новизна работы
Разработана чувствительная и специфичная тест-система на оі нове ПЦР с использованием праймеров, комплементарных нукле творимых антигенов вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ и В. cereu Установлено, что полипептидный состав антигенов, выделенных і вегетативных клеток, спор и культуральной жидкости различакш между собой в зависимости от состава питательной среды и времен культивирования.
При изучении культурально-морфологических свойств и И( следований с помощью ПЦР 12 культур бацилл, выделенных из прс почв скотомогильника в местности Иркана Северобайкальского pai она Республики Бурятия, установлена изменчивость вирулентны свойств у выделенных сибиреязвенных штаммов.
1.4. Практическая значимость работы
Разработана тест-система на основе ПЦР для обнаружения фрагментов ДНК генов протективного антигена и капсульного оперона, рйгодная для идентификации возбудителя сибирской язвы и диффе-енциации вирулентных капсулообразующих штаммов от бескап-ульных вакцинных штаммов. Разработанная тест-система может ытй использована в качестве сигнального метода при исследовании типичных несмешанных культур микроорганизмов, выделяемых из роб патологического материала, почвы, воды при подозрении на ібирскую язву.
Отработана реакция латекс-агглютинации для выявления анти-:л к Bac.anthracis, пригодная для серологических исследований ри определении эффективности вакцинации животных.
На основании проведенных исследований разработаны Методические указания по выявлению ДНК возбудителя сибиркой язвы полимеразной цепной реакцией" рассмотренные на засе-ании ученого совета института (протокол №.10 от 13.10.2000 г.) и гвержденные директором ВНИИВВиМ.
1.5. Основные положения, выносимые на защиту:
- результаты исследований по разработке тест-системы на ос-ове полимеразной цепной реакции, позволяющие идентифициро-iTb ! Bac."anthracis в пробах патматериала, почв и дифференцировать "о от других непатогенных представителей рода бацилл;
результаты исследований по очистке растворимых антигеної вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ и использованию их в разра ботке тест-системы на основе латекс-агглютинации, позволяющее выявлять специфические антитела против сибирской язвы в сыю-ротках вакцинированных и переболевших животных;
изучение морфологических, культуральных и патогенны свойств бацилл, выделенных из патматериала и проб почв скотоме гильника в Бурятии и оценка пригодности ПЦР для идентификаци возбудителя сибирской язвы.
1.6. Апробация и публикация результатов
Материалы исследований доложены и обсуждены на: научно-практической конференции, посвященной 30-летию Прикаспийско го ЗНИВИ "Современное состояние и перспективы интеграции ве теринарной науки и практики в условиях реформирования прикас пийского региона", г. Махачкала, 1997 г.; международной научно практической конференции, посвященной 40-летию ВННИИВи\ "Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными и эк зотическими болезнями животных", г. Покров 1998 г.; Всероссий ской научно-практической конференции, посвященной 30-летии ВНИТИБП "Научные основы производства ветеринарных биологи ческих препаратов", г. Щелково, 2000 г.; Международной конфе ренции посвященной 75-летию со дня рождения И.А. Бакулова, г Покров, 2000 г.
По материалам диссертации опубликовано 6 печатных рабог.
1.7. Структура и объем диссертации
Материал от больного - содержимое карбункула - отбирают (с соблюдением правил забора клинического материала) стерильной платиновой петлей или пастеровской пипеткой в количестве 0,1-1,3 мл. Кожные элементы предварительно очищают ватным тампоном, смоченным спиртом или эфиром. Материалом для исследования могут быть также пробы из внешней среды - почва, смывы с поверхностей, а также суспензии органов павших животных и клеточные взвеси (10 6 -10 8 м.к./ мл) при идентификации выделенных культур.
Для обеззараживания материала, содержащего спорообразующие микроорганизмы, в том числе B. anthracis, применяют методический подход, заключающийся в герминации спор и последующей обработке пенициллином, прогреванием и воздействии лизирующего буфера с гуанидинтиоционатом. Принцип метода состоит в прорастании спор в вегетативные клетки при культивировании их в благоприятных условиях. Далее под действием температуры и пенициллина происходит разрушение клеточной мембраны бацилл с высвобождением ДНК. Последовательность выполнения операций следующая:
1. Для герминации спор исследуемый материал засевают в количестве 0,1 мл в пробирки с 0,9 мл бульона Хоттингера рН 7,6 и инкубируют с встряхиванием при температуре 37 °С в течение 2,5 ч.
2. В пробирки с материалом добавляют пенициллин в расчете 1000 ЕД/мл, инкубируют при 37 °С в течение 15 мин, затем прогревают на водяной бане при температуре 100°С в течение 10 мин.
3. Из проб отбирают по 100 мкл материала в микроцентрифужные пробирки типа Эппендорф, добавляют по 300 мкл лизирующего буфера с гуанидинтиоцианатом и прогревают при температуре 65 °С в течение 15 мин.
После выполнения процедур 1-3 этапов материал для исследования считается обеззараженным, при этом не повреждается ДНК и в последующем не ингибируется ПЦР.
Тест-систему извлекают из морозильной камеры, размораживают содержимое пробирок (для этого лучше использовать ледяную баню или охладитель проб). После траспортировки или длительного хранения пробирки центрифугируют 20 сек (для осаждения капель со стенок) и тщательно перемешивают на вортексе.
Готовят реакционную смесь в специально предназначенной для этого пробирке из расчета на одну пробу: 10х ПЦР-буфер - 2,5 мкл, раствор дНТФ - 2,5 мкл, праймеры ВА1 и ВА2 - по 1 мкл, Таq-полимераза - 0,2 мкл, вода деионизованная - 7,8 мкл.
Фермент в реакционную смесь вносят в последнюю очередь и оставляют его вместе с наконечником в пробирке. Затем в наконечник вставляют дозатор, настроенный на 15 мкл, реакционную смесь тщательно перемешивают не только круговыми движениями наконечника, но и поступательными движениями поршня дозатора (пипетированием). По окончании перемешивания в каждую пробирку, включая контроли, добавляют по 15 мкл реакционной смеси, после чего вносят по одной капле вазелинового масла (для предотвращения испарения реакционной смеси при термоциклировании.). В пробирку, обозначенную как отрицательный контроль (-), вносят 10 мкл деионизованной воды, а в пробирку, обозначенную как положительный контроль (+), - 10 мкл контрольной ДНК (специально предназначенным для этого дозатором!). Пробы в объеме 10 мкл вносят (также предназначенным для этого дозатором) под минеральное масло. По мере заполнения пробирки закрывают, нумеруют, помещают в амплификатор и термоциклируют по программе: предварительная денатурация при 94 ºС (1 цикл) - 3 мин, затем 35 40-секундных циклов при 94, 49 и 72 ºС. В заключение проводят 1 цикл при 72 ºС в течение 10 мин.
После первого этапа амплификации для повышения чувствительности и специфичности реакции проводят вторую стадию. Реакционную смесь готовят из расчета на одну пробу: 10х буфер - 2,5 мкл, раствор дНТФ - 2,5 мкл, праймеры ВА3 и ВА4 - по 1 мкл каждого, фермент Taq-полимераза - 0,2 мкл, вода деионизованная - 16,8 мкл. Далее реакциионную смесь разливают по 24 мкл в каждую пробирку, наслаивают на нее по одной капле вазелинового масла и под масло вносят по 1 мкл амплификата, полученного после первого этапа реакции. Термоциклирование на втором этапе проводят по следующей программе: 1 цикл - 1 мин при 94 ºС, 25 40-секундных циклов при 94, 49 и 72 ºС и 1 цикл при 72 ºС в течение 10 мин.
Наиболее простой метод выявления продукта ферментативной амплификации ДНК в ПЦР - электрофорез в агарозном геле. По окончании программы амплификации анализируемые образцы смешивают с 2,0-2,5 мкл раствора для нанесения проб и вносят в лунки горизонтального агарозного геля. Для более четкого разделения амплифицированных фрагментов целесообразно использование агарозного геля плотностью 1,3 %. Электрофорез проводят в 1хТВЕ-буфере в присутствии бромистого этидия в концентрации 0,5 мкг/мл при напряженности 6 В/см в течение 1 ч, не допуская выхода бромфенолового синего из геля. Затем гель просматривают в ультрафиолетовом свете на транс-иллюминаторе и результат фоторегистрируют.
Амплифицированные фрагменты ДНК идентифицируют по размеру, сравнивая флуоресцирующие в геле полосы анализируемых образцов с полосами положительного контроля или в соответствии с маркерами молекулярного веса.
Оценка результатов ПЦР:
- положительный контроль - выявляется полоса фрагмента 154 п.н.;
- отрицательный контроль - полоса на уровне положительного контроля отсутствует
- анализируемые пробы: наличие полосы на уровне положительного контроля (154 п.н.) указывает на присутствие ДНК возбудителя в исследуемом материале,
- наличие полос выше или ниже положительного контроля является неспецифичным ответом и во внимание не принимается.
Приложение
Последнее изменение этой страницы: 2016-12-30; Нарушение авторского права страницы
Прочитайте:
|
Для лабораторной диагностики сибирской язвы применяют микроскопический, бактериологический, биологический и серологические методы исследования, кожную аллергическую пробу и полимеразную цепную реакцию (ПЦР).
Материал для исследования зависит от клинической формы заболевания, это: отделяемое везикул, карбункулов и язв, струпы, кровь, мокрота, испражнения, моча, пунктаты лимфоузлов, ликвор и аутоп-сийный материал.
Лабораторную диагностику проводят в специатьных лабораториях с соблюдением правил работы с особо опасными инфекциями.Этих же правил придерживаются при взятии и транспортировке патологического материала
Микроскопические исследования. Мазки из исследуемых материалов окрашивают по Граму. Для выявления капсулы применяют методы Бурри-Гинса, Ребигера и другие. Наличие в мазках крупных грамположительных палочек, образующих короткие цепочки, окруженные общей капсулой, позволяют дать предварительный ответ в течение одного часа. Иногда мазки окрашивают по методу Ожешке для обнаружения спор.
Дополнительно применяют прямой метод иммунофлюоресцен-пии со специфической сибиреязвенной люминеецируювдей сывороткой, служащий подтверждением результатов микроскопического исследования.
Бактериологический метод. Выполняют посевы исследуемого материала на чашки с МПА, кровяным агаром, на среды с сывороткой (для выявления капсулы), пол им икс и ново-желточный агар. Кровь и ликвор параллельно засевают на жидкие питательные среды.
В положительном случае, после суточной инкубации при 37°С, на чашках вырастают характерные R-колонии. Их исследуют и выделяют- чистую культуру, которую идентифицируют (см. ниже).
Биологическая проба. Одновременно с посевами на питательные среды, исследуемый материал подкожно вводят мышам, морским свинкам или кроликам. Обычно через сутки мыши погибают Из их крови и органов готовят мазки-отпечатки (с целью обнаружения характерных капсульных палочек) и проводят посевы на питательные среды для выделения чистой культуры возбудителя. Через сутки часть выживших животных забивают и осуществляют аналогичные исследование. За остальными животными наблюдают в течение 10 суток.
Идентификация выделенной чистой культуры возбудителя. Ее проводят с учетом широкого распространения непатогенных и условно-патогенных спороносных бацилл, обладающих сходной морфологией и рядом других общих свойств с сибиреязвенными бактериями. Для дифференциации используют комплекс признаков, присущих только B.anthracis:
- наличие капсул в организме человека и животных и калсулооб-
разование на сывороточных средах;
- фаголизабельность специфическим сибиреязвенным бактерио
фагом;
- отсутствие гемолиза при росте колоний на кровяном агаре (не
вполне надежный признак, так как некоторые почвенные бацил
лы также не дают гемолиза),
- вирулентность для мышей, морских свинок и главное - кроликов,
так как некоторые бациллы, например В.cereus, введенные в боль
ших дозах, могут вызывать гибель мышей и морских свинок.
- Серологическую идентификацию проводят методом прямой им-
мунофлюоресценции.
На основании результатов идентификации испытуемой культуры ставят окончательный диагноз сибирской язвы. Однако, выделить культуру возбудителя удается далеко не всегда, например при кожной форме - менее чем в 50% случаев, что связано, главным образом, с ранним началом лечения антибиотиками.
Серологический метод. Его применяют для выявления сибиреязвенного антигена или возбудителя непосредственно в патологическом материале в ранние сроки заболевания. Используют экспресс-методы: прямой РИФ, РИГА с эритроцитарным антительным диагностикумом (РОНГА), ИФА.
Антитела в сыворотке крови больных выявляют реже, в основном при кожной форме заболевания. Применяют РИГА (с эритроцитарным антигенным диагностикумом), а в последнее время применяют тест-системы ЛФА с капсульным, протективным антигенами или летальным токсином, позволяющие выявлять соответствующие антитела.
По наличию специфических антител у переболевших устанавливают ретроспективный диагноз сибирской язвы.
Сохраняет свое значение реакция термопреципитации Асколи, основное назначение которой - определение зараженности различного животного сырья (кожа, шкуры, шерсть., щетина и др.), атакже объектов внешней среды, трупов людей и животных, даже разложившихся.
Для постановки реакции Асколи готовят термопреципитиноген из исследуемого материала, который измельчают, кипятят в изотоническом растворе NaCl и фильтруют. Прозрачный преципитиноген наслаивают на сибиреязвенную сыворотку, налитую в узкую пробирку. В положительном случае на границе двух жидкостей образуется мутно-белое кольцо преципитата. Одновременно ставят контроль с нормальной сывороткой, где преципитация должна отсутствовать.
Раньше эту реакцию использовали и для прижизненной диагностики кожной формы сибирской язвы (термопреципитиноген готовили из струпа, покрывающего карбункул), но в настоящее время для этой цели реакцию Асколи почти не применяют.
Кожно-аллергичеекая проба Ее ставят для выявления аллергиза-ции организма (развит ие ГЗТ), возникающей при сибиреязвенной инфекции и сохраняющейся в течение многих лет у переболевших. Аллерген-антраксин вводят в объеме О Л мл внутрикожно в ладонную поверхность предплечью. Результат учитывают через 24 и 48 часов. Реакция считается положительной при наличии инфильтрата и гиперемии диаметром 16-25мм и резко положительной, если диаметр 26мм и более. Положительную кожно-аллергическую пробу наблюдают у больных и переболевших кожной формой сибирской язвы почти в 90% случаев.
Подимеразная цепная реакция (ПЦР)является перспективным, чувствительным экспресс-методом, позволяющим выявлять присутствие ДНК возбудителя сибирской язвы в патологическом материале. взятом от больных, в том числе во время лечения антибиотиками., а также в объектах внешней среды. В настоящее время разработаны и апробированы на практике диагностические тест-системы, содержащие набор ингредиентов для постановки ПЦР.
Дата добавления: 2014-12-11 | Просмотры: 4194 | Нарушение авторских прав
Читайте также: